硒化甘草多糖聯(lián)合抗生素對(duì)奇異變形桿菌體內(nèi)外抑菌效果以及抑菌機(jī)制研究

王 燕 李效振 朱曉慶* 谷新利* 張夢(mèng)圓 王蒙蒙 楊慧瑩 劉雨然

（1．石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2．烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心，新疆 烏魯木齊 830000）

變形桿菌屬于革蘭陰性菌腸桿菌科，是人畜共患菌。奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，PM）在自然界廣泛分布，可通過(guò)糞便、飲水等途徑感染人或動(dòng)物，引起敗血癥、食物中毒、腹瀉、泌尿系統(tǒng)等疾病[1]。近年來(lái)，隨著PM耐藥性增加，抗生素防控效果急劇下降。因此，開(kāi)發(fā)新型抗菌劑對(duì)降低細(xì)菌耐藥率尤為重要。

甘草作為較為常見(jiàn)的中藥，主要分布在我國(guó)西北部，其根部是常見(jiàn)用藥部位。甘草提取物包括黃酮類、淀粉、氨基酸、糖類等。甘草多糖（Glycyrrhizapolysaccharide，GUP）是一種從甘草中提取出來(lái)的天然多糖，具有抗炎抑菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等功能[2]。硒作為人體必需元素，能夠保障機(jī)體健康，降低癌癥、甲狀腺、大骨病等疾病風(fēng)險(xiǎn)；還具有抗氧化、抗癌、抗炎抑菌、提高機(jī)體免疫力等生物學(xué)功能。硒分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒。無(wú)機(jī)硒毒副作用大、生物利用率低；有機(jī)硒比無(wú)機(jī)硒毒副作用小，利用率高，能夠與大分子結(jié)合，在生物活性方面產(chǎn)生協(xié)同作用[3]。將硒與甘草多糖結(jié)合為硒化甘草多糖（selenideGlycyrrhizapolysaccharide，SeGUP），具有抗炎抑菌、免疫調(diào)節(jié)等作用。研究表明，GUP 對(duì)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌具有較好的抑制作用[4]；SeGUP 對(duì)大腸桿菌有抑制作用[5]；PM 對(duì)氨基糖苷類、青霉素類、喹諾酮類抗生素呈不同程度耐藥[6-8]。本試驗(yàn)研究SeGUP、GUP 聯(lián)合抗生素對(duì)PM 體內(nèi)外抑菌效果及抑菌機(jī)制，比較兩者抑菌性效果，旨在開(kāi)發(fā)新型天然植物抑菌劑、臨床抗生素使用以及PM的防治方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明級(jí)小鼠，240只，雌、雄各半，7～9周齡，體重（20±2）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)菌株及試驗(yàn)試劑

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，菌株編號(hào)為BNCC107943）購(gòu)自BeNa Culture Collection；新疆烏拉爾甘草購(gòu)自石河子市國(guó)浩中草藥公司；BHI、營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；G-100 葡聚糖購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；抗生素藥敏片（恩諾沙星、環(huán)丙沙星（CI）、新霉素硫酸鹽、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿莫西林、氨芐西林）購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；CI、堿性磷酸酶（AKP）試劑盒、BCA 法蛋白含量測(cè)定試劑盒、β-半乳糖苷酶（β-gal）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；亞硒酸鈉購(gòu)自天津福晨化學(xué)試劑廠；透析袋、瓊脂粉購(gòu)自北京博奧拓科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

Biotek SynergeyTM2多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；DEAE-52 層析柱、Sephadex G-100 層析柱（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；ZG-280中藥煎藥包裝一體機(jī)（吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠）；冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；HVA-85高壓蒸汽滅菌鍋（華粵行儀器有限公司）；單道排槍移液器、多道排槍移液器（德國(guó)Transferpette公司）。

1.4 試驗(yàn)活化菌株

在超凈工作臺(tái)中將密封的PM試管用磨砂石打開(kāi)，將無(wú)菌液體培養(yǎng)基打入PM試管中，混勻；再蘸取PM菌懸液在固體培養(yǎng)基中劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h；選取大小均一的單菌落，置于液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整菌液濃度為108CFU/mL。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 GUP制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]的方法，取干燥的新疆烏拉爾甘草1 000 g，工業(yè)乙醇浸泡12 h 除去脂質(zhì)小分子。熱水回流提取3次，加入無(wú)水乙醇使終體積分?jǐn)?shù)為80%、靜置8 h，去除上清液，3 000 r/min離心15 min，取濃縮液，冷凍干燥后得到新疆烏拉爾甘草粗多糖。

將粗多糖配制成10 g/L溶液，調(diào)溶液pH值為7.0，加三氯乙酸攪拌4 h，加入過(guò)氧化氫，50 ℃水浴靜置3 h。將以上處理過(guò)的溶液裝入透析袋，蒸餾水透析72 h，放置層析柱除雜，離心除去沉淀，冷凍干燥，即為GUP。

1.5.2 SeGUP制備

稱取500 mg GUP，加入濃硝酸50 mL，攪拌30 min，加入200 mg亞硒酸鈉，水浴8 h，加飽和無(wú)水碳酸鈉，調(diào)pH值為6.0，3 000 r/min離心15 min，去除沉淀。將以上處理過(guò)的溶液裝入透析袋，蒸餾水透析48 h，放置層析柱除雜，冷凍干燥后得即為SeGUP。

1.5.3 體外抑菌試驗(yàn)

1.5.3.1 藥敏試驗(yàn)

將SeGUP、GUP 用無(wú)菌水調(diào)制成濃度分別為100、200、300、400 g/L 的溶液，再將溶液、自制藥敏片進(jìn)行高壓滅菌。將藥敏紙片均勻放置在無(wú)菌玻璃器皿上，吸取20 μL不同濃度的SeGUP、GUP放置在藥敏片上，4 ℃放置4 h，在37 ℃烘箱中烘干。將PM均勻涂布在固體培養(yǎng)基上直至干澀難涂，使用無(wú)菌眼科鑷夾將制備好的不同質(zhì)量濃度SeGUP、GUP 藥敏片以及各抗生素藥敏片均勻放置在固體培養(yǎng)基上，保持間距，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈，測(cè)量抑菌圈直徑，以3 次抑菌圈直徑的平均值為敏感度標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)《中藥藥理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)》，抑菌圈直徑≥20 mm為極度敏感；15 mm≤抑菌圈直徑＜19 mm為高度敏感；10 mm≤抑菌圈直徑＜14 mm為中度敏感；抑菌圈直徑＜10 mm為無(wú)抑菌活性。

1.5.3.2 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

參考林震等[10]以及實(shí)驗(yàn)室前期方法稍做改動(dòng)，使用無(wú)菌蒸餾水配制不同濃度的SeGUP、GUP、抗生素溶液，多糖溶液高壓滅菌，準(zhǔn)備3 塊96 孔板，吸取100 μL 不同質(zhì)量濃度的SeGUP、GUP、抗生素溶液分別加入不同板中，加入100 μL 菌懸液，SeGUP、GUP 溶液終質(zhì)量濃度分別為25、50、75、100、125、150、175、200、225、250 g/L；抗生素溶液終質(zhì)量濃度分別為320×10-3、160×10-3、 80×10-3、 40×10-3、 20×10-3、 10×10-3、5×10-3g/L；對(duì)照組為只含PM的菌懸液。37 ℃恒搖床振蕩培養(yǎng)24 h，與對(duì)照組比，孔中無(wú)渾濁即為MIC。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3.3 SeGUP、GUP對(duì)PM的生長(zhǎng)曲線

參考Liu等[11]以及實(shí)驗(yàn)室前期方法適當(dāng)修改，采用二倍稀釋法，使用無(wú)菌蒸餾水分別配制2 MIC、1 MIC、0 MIC SeGUP 和GUP 溶液，高壓滅菌，將PM 菌懸液放置在無(wú)菌試管中，加入等量、不同質(zhì)量濃度的SeGUP、GUP溶液，SeGUP、GUP溶液終質(zhì)量濃度分別為1 MIC、1/2 MIC、0 MIC。37 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h測(cè)定在OD600nm處的吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)，繪圖。

1.5.3.4 SeGUP、GUP和抗生素組合體外協(xié)同試驗(yàn)

參考Li 等[12]以及實(shí)驗(yàn)室前期方法稍做改動(dòng)，采用棋盤法測(cè)定SeGUP、GUP 聯(lián)合抗生素抑菌效果，將50 μL不同濃度的SeGUP、GUP 溶液提前加入2 個(gè)不同的96 孔板中，每板中分別加入50 μL不同濃度的抗生素溶液，每孔加入100 μL的PM菌懸液，SeGUP質(zhì)量濃度分別為20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 g/L；GUP 質(zhì)量濃度分別為40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115 g/L；抗生素質(zhì)量濃度分別為5×10-3、10×10-3、15×10-3、 20×10-3、 25×10-3、 30×10-3、 35×10-3、40×10-3g/L。對(duì)照組為只含PM 菌懸液，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，與對(duì)照組比，孔中無(wú)渾濁為聯(lián)合后抗生素的MIC。

體外協(xié)同作用（FICI）=（甲藥聯(lián)合時(shí)的MIC/甲藥單用時(shí)的MIC）+（乙藥聯(lián)合時(shí)的MIC/乙藥單用時(shí)的MIC） (1)

結(jié)果判定：FICI≤0.5 為協(xié)同；0.5＜FICI≤1.0 為相加；1.0＜FICI≤2.0為無(wú)關(guān)；FICI＞2.0為拮抗。

1.5.4 體內(nèi)抑菌預(yù)試驗(yàn)

1.5.4.1 PM菌懸液制備

取大小均一的PM 菌落接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18 h，用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整PM 菌液濃度為1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108CFU/mL。

1.5.4.2 小鼠80%致死劑量（MLD）

將80只昆明級(jí)小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，其他6組腹腔注射不同濃度菌液，0.3 mL/只，觀察7 d。使用10 只小鼠作為驗(yàn)證組，給予80% MLD菌液，驗(yàn)證此劑量小鼠死亡率，確定小鼠80%MLD，即為感染量。

1.5.4.3 抗生素最佳預(yù)防劑量

將70 只昆明級(jí)小鼠隨機(jī)分為7 組：2 mg/kg 組、3 mg/kg 組、4 mg/kg 組、5 mg/kg 組、6 mg/kg 組、7 mg/kg組、對(duì)照組，每組10只。每組小鼠灌服相應(yīng)劑量抗生素，對(duì)照組灌服生理鹽水，0.3 mL/只，連續(xù)14 d。末次灌服完成2 h后腹腔注射80% MLD菌液，觀察7 d。

1.5.5 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

90只昆明級(jí)小鼠隨機(jī)分為SeGUP 高、中、低（150、100、50 mg/kg）劑量組及GUP高、中、低劑量組（150、100、50 mg/kg）和對(duì)照組、模型組、抗生素組，每組10 只。模型組小鼠不處理，對(duì)照組灌服生理鹽水，抗生素組灌服最佳預(yù)防濃度的抗生素溶液，其余各組灌服0.3 mL/只、不同劑量的SeGUP、GUP 溶液，連續(xù)14 d。末次灌服完成2 h后，除對(duì)照組外，其他組腹腔注射80%MLD的菌液。觀察7 d。

1.5.6 抑菌機(jī)制試驗(yàn)

1.5.6.1 SeGUP、GUP 聯(lián)合抗生素對(duì)PM AKP、β-gal、DNA、蛋白含量的影響

將相同體積藥物分別加入只裝有PM菌液高壓滅菌的試管中，使?jié)舛确謩e為MIC SeGUP、MIC GUP、MIC CI、 MIC （SeGUP+CI）、 MIC （GUP+CI）、 1/2 MIC SeGUP、1/2 MIC GUP、1/2 MIC CI、1/2 MIC（SeGUP+CI）、1/2 MIC（GUP+CI），對(duì)照組只加入同等體積的無(wú)菌蒸餾水（只含PM菌液），37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，4、12 h 無(wú)菌取樣1 mL 于無(wú)菌EP 管中，按照AKP、β-gal、DNA、蛋白含量試劑盒使用說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)量其在OD450nm、OD260nm、OD280nm、OD562nm吸光度值，得出AKP、β-gal、DNA、蛋白含量變化。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行，取平均值。

1.5.6.2 SeGUP、GUP 聯(lián)合抗生素對(duì)PM 生物膜形成的影響

參考溫燕龍等[13]和Djordjevic等[14]方法稍作改進(jìn)。分組同1.5.6.1，將SeGUP、GUP、抗生素溶液與PM菌液振蕩混勻，吸取200 μL 的混合液到96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h；棄去每孔中的混合液，使用無(wú)菌PBS漂洗3次；再取200 μL 結(jié)晶紫染液加到每孔中，37 ℃染色1 h，棄去每孔中的染色液，使用無(wú)菌PBS 漂洗3 次；再吸取200 μL 的95%乙醇加入每孔中，37 ℃脫色8 h，測(cè)定在OD595nm處吸光度值。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，取平均值。

1.5.6.3 SeGUP、GUP 聯(lián)合抗生素對(duì)PM CAT、SOD 活性的影響

分組以及藥物處理同1.5.6.1，根據(jù)CAT、SOD 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定在OD240nm、OD450nm處吸光度值，得出CAT、SOD活性變化。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's 檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.01 表示差異極顯著。采用Graphpad prism 7軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 SeGUP、GUP對(duì)PM藥敏的試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1）

表1 SeGUP、GUP對(duì)PM藥敏的試驗(yàn)結(jié)果 單位：mm

由表1 可知，300 g/L SeGUP、400 g/L GUP 對(duì)PM 達(dá)到了極敏效果，同一濃度下SeGUP比GUP抑菌圈大?？股厮幟粼囼?yàn)中CI 的抑菌效果最佳，達(dá)到極敏。因此，選用抗生素CI進(jìn)行體內(nèi)外抑菌以及抑菌機(jī)制試驗(yàn)。

2.1.2 SeGUP、GUP、CI對(duì)PM的MIC結(jié)果（見(jiàn)表2）

表2 SeGUP、GUP、CI對(duì)PM的MIC結(jié)果 單位：g/L

由表2 可知，SeGUP 對(duì)PM 的MIC 值為100.00 g/L，GUP 對(duì)PM的MIC值為150.00 g/L，CI對(duì)PM的MIC值為0.04 g/L。

2.1.3 GUP、SeGUP對(duì)PM生長(zhǎng)曲線的影響（見(jiàn)圖1、圖2）

圖1 GUP對(duì)PM生長(zhǎng)曲線的影響

圖2 SeGUP對(duì)PM生長(zhǎng)曲線的影響

由圖1、圖2 可知，PM 在10 h 之前完成了遲緩期和對(duì)數(shù)期；在1 MIC GUP、1 MIC SeGUP 的影響下，細(xì)菌不增殖；1/2 MIC GUP、1/2 MIC SeGUP 均對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)出抑制作用，PM 的遲緩期和對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)特征消失。1/2 MIC SeGUP 對(duì)PM 的生長(zhǎng)抑制作用停留在0.5 之前，1/2 MIC GUP對(duì)PM的生長(zhǎng)抑制作用停留在0.6左右。

2.1.4 SeGUP、GUP聯(lián)合CI對(duì)PM的FICI結(jié)果（見(jiàn)表3）

表3 SeGUP、GUP聯(lián)合CI對(duì)PM的FICI結(jié)果單位：g/L

由表3 可知，SeGUP、GUP 聯(lián)合CI 使用后MIC 從100.00、150.00 g/L 降低至25.00、50.00 g/L，CI MIC 從0.04 g/L降低到0.01、0.005 g/L。SeGUP聯(lián)合CI表現(xiàn)為協(xié)同作用，GUP聯(lián)合CI表現(xiàn)為相加作用。

2.2 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 人工感染小鼠80% MLD結(jié)果（見(jiàn)表4）

表4 人工感染小鼠80% MLD結(jié)果 單位：%

攻毒4 h 后，小鼠開(kāi)始精神不振，蜷縮抱團(tuán)在一起，雙眼緊閉；30 h 后小鼠被毛粗糙，飲水飲食減少，尾部被毛凌亂、發(fā)黃，部分出現(xiàn)糞便稀薄情況；40 h 后，小鼠毛發(fā)凌亂打結(jié)，不思飲食飲水，尾部血管開(kāi)始發(fā)青，部分小鼠腹瀉嚴(yán)重，小鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡；3 d后小鼠繼續(xù)死亡，部分小鼠尾部嚴(yán)重發(fā)青，不愿活動(dòng)，也有部分小鼠開(kāi)始恢復(fù)飲食飲水，逐漸恢復(fù)精神狀態(tài)；4 d后未死亡小鼠開(kāi)始恢復(fù)精神狀態(tài)，開(kāi)始攀爬，自由飲水飲食。

由表4可知，對(duì)照組小鼠攻毒劑量為0，死亡率也為0。驗(yàn)證組小鼠腹腔注射5×106CFU/mL 菌液，4 d 內(nèi)小鼠死亡率仍為80%，最終確定小鼠80% MLD 為5×106CFU/mL。

2.2.2 各劑量CI對(duì)小鼠死亡率的影響（見(jiàn)表5）

表5 各劑量CI對(duì)小鼠死亡率的影響 單位：%

由表5 可知，隨著CI 劑量增加，小鼠死亡率越低，預(yù)防效果越好，最佳預(yù)防劑量為7 mg/kg。

2.2.3 SeGUP、GUP體內(nèi)抑菌試驗(yàn)（見(jiàn)表6）

表6 SeGUP、GUP體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

由表6 可知，SeGUP 高、中、低劑量組，GUP 高、中劑量組死亡率極顯著低于模型組（P＜0.01）；GUP低劑量組對(duì)小鼠死亡率無(wú)影響。同濃度下SeGUP 劑量組死亡率低于GUP劑量組。

2.3 抑菌機(jī)制結(jié)果

2.3.1 SeGUP、GUP 聯(lián)合CI 對(duì)PM AKP、β-gal、DNA、蛋白質(zhì)含量的影響（見(jiàn)表7）

表7 SeGUP、GUP聯(lián)合CI對(duì)PM AKP、β-gal、DNA、蛋白質(zhì)含量的影響

以12 h時(shí)MIC劑量組與對(duì)照組進(jìn)行組間差異性比較；以12 h 時(shí)1/2 MIC 劑量組與對(duì)照組進(jìn)行組間差異性比較。由表7可知，1/2 MIC SeGUP組、MIC SeGUP組PM培養(yǎng)液中AKP、β-gal、蛋白含量極顯著高于對(duì)應(yīng)的1/2 MIC GUP、MIC GUP 組比（P＜0.01）；1/2 MIC SeGUP 組、MIC SeGUP 組PM 培養(yǎng)液中AKP、β-gal、蛋白含量極顯著低于對(duì)應(yīng)的1/2 MIC CI 組、MIC CI 組（P＜0.01）；1/2 MIC（SeGUP+CI）組、MIC（SeGUP+CI）組PM培養(yǎng)液中AKP、β-gal、蛋白含量極顯著高于對(duì)應(yīng)的1/2 MIC（GUP+CI）、MIC （GUP+CI） 組（P＜0.01）。1/2 MIC SeGUP組、MIC SeGUP組PM菌體內(nèi)DNA濃度極顯著低于對(duì)應(yīng)的1/2 MIC GUP、MIC GUP 組（P＜0.01）；MIC CI 組PM 菌體內(nèi)DNA 濃度極顯著低于MIC SeGUP 組（P＜0.01）；1/2 MIC （SeGUP+CI） 組、MIC （SeGUP+CI）組PM 菌體內(nèi)DNA 濃度極顯著低于對(duì)應(yīng)的1/2 MIC（GUP+CI）組、MIC（GUP+CI）組（P＜0.01）。

2.3.2 SeGUP、GUP 聯(lián)合CI 對(duì)PM 生物膜形成的影響（見(jiàn)圖3）

圖3 SeGUP、GUP聯(lián)合CI對(duì)PM生物膜形成的影響

由圖3 可知，與1/2 MIC GUP、MIC GUP 組比，1/2 MIC SeGUP 組、MIC SeGUP 組PM 生物膜形成極顯著減少（P＜0.01）；與1/2 MIC SeGUP、MIC SeGUP 組比，1/2 MIC CI 組、MIC CI 組PM 生物膜形成極顯著減少（P＜0.01）；與1/2 MIC（GUP+CI）組、MIC（GUP+CI）組比，1/2 MIC（SeGUP+CI）組、MIC（SeGUP+CI）組PM生物膜形成極顯著減少（P＜0.01）。

2.3.3 SeGUP、GUP 聯(lián)合CI 對(duì)PM CAT、SOD 活性的影響（見(jiàn)表8）

表8 SeGUP、GUP聯(lián)合CI對(duì)PM CAT、SOD活性的影響

由表8 可知，1/2 MIC SeGUP 組、MIC SeGUP 組CAT、SOD 活性極顯著低于對(duì)應(yīng)的1/2 MIC GUP 組、MIC GUP 組（P＜0.01）；1/2 MIC CI、MIC CI 組CAT、SOD 活性極顯著低于對(duì)應(yīng)的1/2 MIC SeGUP 組、MIC SeGUP 組（P＜0.01）；1/2 MIC （SeGUP+CI） 組、MIC（SeGUP+CI） 組CAT、SOD 活性極顯著低于對(duì)應(yīng)的1/2 MIC（GUP+CI）、MIC（GUP+CI）組（P＜0.01）。

3 討論

3.1 SeGUP、GUP對(duì)PM體內(nèi)外抑菌效果的影響

SeGUP、GUP 對(duì)大腸桿菌肺炎克雷伯菌均具有較好體外抑菌作用，抑菌圈均為11 mm[4-5]。本試驗(yàn)中，SeGUP、GUP 對(duì)PM 均有較好的體外抑菌效果。隨著濃度增高，抑菌圈擴(kuò)大；SeGUP MIC 小于GUP MIC，且SeGUP 抑制PM 增殖效果優(yōu)于GUP。茯苓多糖與恩諾沙星聯(lián)合同時(shí)降低了多糖與抗生素使用量[15]。山蒼子精油聯(lián)合四環(huán)素和土霉素表現(xiàn)為協(xié)同和相加作用，有效降低抗生素使用量[12]。經(jīng)過(guò)前期試驗(yàn)篩選出對(duì)SeGUP、GUP均極敏的CI 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SeGUP 聯(lián)合CI 時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同，GUP表現(xiàn)為相加，表明SeGUP能夠更有效地降低CI使用量，為指導(dǎo)抗生素在生產(chǎn)實(shí)踐中的使用、減緩PM抗生素耐藥性以及SeGUP、GUP 在臨床中的應(yīng)用提供了參考。高艷等[16]在小鼠體內(nèi)建立多殺性巴氏桿菌模型，使用菪可輪蒲水煎液對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)防和治療干預(yù)，發(fā)現(xiàn)菪可輪蒲水煎液預(yù)防作用能夠更有效地降低小鼠死亡率。探索PM 對(duì)小鼠死亡率劑量的影響，在體內(nèi)抑菌試驗(yàn)之前，先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)?zāi)軌虼蟠筇岣弑驹囼?yàn)的成功率；隨著SeGUP、GUP 劑量增加，有效降低了小鼠死亡率；同等劑量的SeGUP 預(yù)防效果優(yōu)于GUP。結(jié)合體外抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SeGUP、GUP 體內(nèi)外均有抑菌效果，這為甘草以及多糖類在畜牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供了參考，增加了SeGUP、GUP作為抗菌劑的可行性。

3.2 SeGUP、GUP、CI 以及多糖聯(lián)合CI 對(duì)PM 膜結(jié)構(gòu)的影響

AKP 是存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的物質(zhì)，當(dāng)胞外AKP 活性升高，說(shuō)明細(xì)胞壁受到損傷。因此，AKP 活性常用于指示細(xì)胞壁通透性。β-gal是胞內(nèi)酶，可分解胞內(nèi)乳糖，除細(xì)胞膜受損外，β-gal 不會(huì)從胞內(nèi)泄漏到胞外，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物外漏是細(xì)胞膜受損的典型特征[17]。菌體內(nèi)DNA濃度、胞外蛋白濃度反映細(xì)菌細(xì)胞膜完整性。本試驗(yàn)中，SeGUP、GUP 對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜均具有破壞作用，SeGUP 對(duì)細(xì)菌的破壞能力強(qiáng)于GUP；當(dāng)SeGUP、GUP聯(lián)合CI時(shí)，加大了對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的破壞程度，增強(qiáng)了抗生素的殺菌效果。槲皮素能夠破壞大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使胞外AKP、β-gal以及可溶性蛋白顯著升高；槲皮素作為飼料添加劑具有代替抗生素的潛力[18]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。生物膜可分泌胞外多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)，組成胞外聚合物（EPS），通過(guò)EPS 包圍細(xì)菌，生物膜之間相互附著，難以去除生物膜成為細(xì)菌耐藥性原因之一。山蒼子精油聯(lián)合四環(huán)素和土霉素能夠有效去除副溶血鏈球菌生物膜，減少了去除生物膜所需抗生素用量以及副溶血鏈球菌的耐藥性[12]。SeGUP 聯(lián)合CI比GUP聯(lián)合CI更能夠抑制PM生物膜形成，呈劑量依賴趨勢(shì)，有效降低CI的使用量。

3.3 SeGUP、GUP、CI 以及多糖聯(lián)合CI 對(duì)PM 抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT 是細(xì)菌免受氧自由基侵害的酶；SOD 通過(guò)催化超氧陰離子發(fā)生歧化作用生成H2O2、O2，CAT 則促進(jìn)H2O2分解，二者發(fā)揮協(xié)同作用可以保護(hù)細(xì)菌免受氧自由基的損害。當(dāng)細(xì)菌處于不利環(huán)境時(shí)，機(jī)體受到氧自由基損害，細(xì)菌抗氧化系統(tǒng)被激活，通過(guò)消除活性氧以及減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，維持細(xì)菌自身氧化-抗氧化系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡，達(dá)到生存目的[19-20]?？股貙?dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，成為介導(dǎo)細(xì)菌死亡的機(jī)制之一。SeGUP、GUP、CI能夠破壞PM機(jī)體氧化-抗氧化動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致菌體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，破壞PM脂質(zhì)、大分子物質(zhì)、抑制PM 生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，4 h 時(shí)，SeGUP、GUP、CI 引起PM強(qiáng)烈氧化應(yīng)激反應(yīng)，SeGUP聯(lián)合CI比GUP聯(lián)合CI引起PM氧化應(yīng)激反應(yīng)更強(qiáng)烈，CAT、SOD活性更高；12 h時(shí)，各劑量組有效破壞PM 抗氧化酶系統(tǒng)，降低SOD、CAT 活性， 其中1/2 MIC （SeGUP+CI） 組、 MIC（SeGUP+CI）組CAT、SOD活性最低，說(shuō)明SeGUP聯(lián)合CI 對(duì)PM 抗氧化酶抑制程度最強(qiáng)，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生速度遠(yuǎn)大于分解速度，有效降低CI的使用量、達(dá)到抑菌效果。水稻提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理表明，水稻提取物后期可抑制CAT、SOD 活性，導(dǎo)致過(guò)量有毒的自由基與菌體反應(yīng)，造成菌體死亡[19]，與本試驗(yàn)一致。Fe3+可以降低慶大霉素在大腸桿菌中的濃度，減少大腸桿菌的氧化應(yīng)激[20]，與本試驗(yàn)結(jié)果相反。

4 結(jié)論

體內(nèi)外抑菌、抑菌機(jī)制試驗(yàn)表明，SeGUP、GUP 均有較好的體內(nèi)外抑菌效果。SeGUP、GUP 能夠破壞PM膜結(jié)構(gòu)、降低PM抗氧化酶活性，有效降低CI的使用量。SeGUP體內(nèi)外抑菌、抑制PM機(jī)制效果均優(yōu)于GUP。