納豆芽孢桿菌對肉仔雞生長性能、免疫功能及腸道健康的影響

王 丁 徐 彬 席燕燕 王改利 付 趁 孫全友 李紹鈺*

（1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450002；2．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002）

在動物生產(chǎn)中長期使用抗生素類藥物容易產(chǎn)生負面影響，如產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留、食品安全等問題[1]，因此我國提出在飼料端禁止使用抗生素[2]。微生態(tài)制劑具有增強動物自身免疫力、改善飼料轉(zhuǎn)化率、維持動物健康快速生長等生物學(xué)功能[3-4]。納豆芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的一個亞種，屬于好氧菌中的非致病革蘭氏陽性菌[5]。納豆芽孢桿菌具有耐酸耐堿的特性，可在酸性胃環(huán)境中保持良好的穩(wěn)定性，進入腸道后產(chǎn)生的代謝物能夠抑制有害菌生長，調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)平衡，保障腸道正常功能運轉(zhuǎn)[6]。肉仔雞日糧中添加納豆芽孢桿菌可以顯著提高免疫器官指數(shù)，增強肉雞免疫反應(yīng)[7]。發(fā)酵納豆芽孢桿菌能夠有效降低肉雞的料重比，提高腸道中乳酸桿菌的含量[8]。乳酸菌和芽孢桿菌聯(lián)用，可在不同程度上提高肉仔雞的飼料利用率，促進肉仔雞生長，提高法氏囊指數(shù)，增強機體免疫功能[9]。目前，有關(guān)納豆芽孢桿菌的研究多集中于對肉雞生長性能及免疫作用的影響，關(guān)于其對腸道菌群影響的研究甚少。因此，本試驗在肉仔雞日糧中添加納豆芽孢桿菌，觀察其對肉仔雞生長性能、免疫功能及腸道菌群的影響，以期為納豆芽孢桿菌在肉仔雞的生產(chǎn)應(yīng)用中提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選取180 只1 日齡科寶肉仔雞隨機分為2 組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞，對照組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組在基礎(chǔ)日糧＋300 mg/kg 納豆芽孢桿菌。試驗期42 d。試驗地點在河南大用實業(yè)有限公司，試驗雞由公司提供。試驗所用納豆芽孢桿菌購自日本株式會社目黑研究所，為灰棕色至黃棕色粉末。納豆芽孢桿菌含量≥1.0×1011CFU/g，推薦量為300 mg/kg。基礎(chǔ)日糧參照《雞飼養(yǎng)標準》（NY/T 33—2004）進行配制，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 飼養(yǎng)管理

采用三層籠養(yǎng)，肉仔雞自由采食與飲水，環(huán)境溫度隨著日齡增加逐漸降低，每周下降2～3 ℃，從1日齡的32 ℃降到23 ℃并保持不變。按照雞場免疫程序進行接種。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長性能

試驗期間每周對試驗雞進行空腹稱重并詳細記錄耗料量，計算試驗肉雞的平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 血清免疫指標

在肉仔雞21、42 日齡，從每個重復(fù)選取1 只雞翅靜脈采血，無抗凝血3 500 r/min 離心10 min，收集血清分裝于2 mL 離心管中，-20 ℃冷凍保存。血清用于測定免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）的含量，采用南京建成生物工程研究所試劑盒采用方法為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定。

1.3.3 空腸炎癥因子

試驗肉仔雞采血后屠宰，取出腸道，縱向剪開空腸，用生理鹽水沖洗掉腸道內(nèi)容物，收集黏膜于凍存管中-80 ℃保存待測。稱取空腸黏膜，按重量體積比1 g∶9 mL的比例加入9倍體積的PBS（pH值7.4），使用勻漿器充分勻漿。2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清，-20 ℃冷凍，白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）采用南京建成生物工程研究所試劑盒使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定。

1.3.4 腸道菌群

收集盲腸內(nèi)容物于無菌凍存管中，置于液氮中保存，用于微生物測定。根據(jù)DNeasy? PowerSoil? Pro Kit（QIAGEN）說明書對盲腸內(nèi)容物微生物群落進行總DNA抽提，使用NanoDrop 2000 檢測DNA 濃度并進行PCR 擴增，對回收純化后的產(chǎn)物構(gòu)建文庫并測序[10]。

PCR 擴增體系（20 μL）：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、上游引物（5 μmol/L）0.8 μL、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL、TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL、模板DNA 10 ng。

德國ETAS（易特馳）集團為客戶提供用于汽車電控單元（ECU）開發(fā)和維護的各種集成工具和解決方案。作為一流的工具供應(yīng)商，易特馳始終提供創(chuàng)新、高質(zhì)量的產(chǎn)品，并針對ECU生命周期的各個階段提供解決方案。該公司2005年進入中國，為中國本土客戶提供全方位的服務(wù)以及個性化的解決方案。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件進行T 檢驗，Duncan's法進行多重比較。結(jié)果以平均值和標準誤表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。采用FASTP（version 0.20.0）軟件用于盲腸微生物原始測序序列的質(zhì)控，F(xiàn)lash（version 1.2.7）軟件拼接。根據(jù)97%的相似度對優(yōu)化序列進行OTU聚類，消除嵌合體，并統(tǒng)計不同水平下各樣品菌群結(jié)構(gòu)的組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌對肉仔雞生長性能的影響（見表3）

由表3 可知，1～21 日齡，與對照組相比，試驗組肉仔雞平均采食量、平均日增重、料重比差異均不顯著（P＞0.05）。22～42日齡，試驗組肉雞的平均日增重顯著高于對照組（P＜0.05）。1～42日齡，試驗組肉雞的平均日增重顯著高于對照組（P＜0.05），肉雞42日齡體重顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.2 納豆芽孢桿菌對肉仔雞血清免疫的影響（見表4）

由表4 可知，與對照組相比，21 日齡和42 日齡試驗組肉仔雞血清IgA和IgG含量差異不顯著（P＞0.05），IgM含量分別升高了37.63%、38.85%（P＜0.01）。

2.3 納豆芽孢桿菌對肉仔空腸炎癥因子的影響（見表5）

表5 納豆芽孢桿菌對肉仔雞空腸炎癥因子的影響 單位：g/L

由表5 可知，與對照組相比，21 日齡試驗組肉雞空腸黏膜IL-1β的含量下降21.97%（P＞0.05），42日齡肉雞空腸IL-1β 的含量極顯著下降47.02%（P＜0.01）。21、42日齡試驗組肉雞空腸黏膜IL-6、TNF-α的含量均有不同程度降低（P＞0.05），IL-10 的含量具有一定程度的提高（P＞0.05）。

2.4 納豆芽孢桿菌對肉仔雞盲腸微生物區(qū)系的影響

2.4.1 盲腸微生物α多樣性分析

通過高通量測序分析最終獲得3 514 657 條有效序列，平均長度416 bp。按照97%相似性對非重復(fù)效序列進行OTU聚類分析，得到所有樣本平均聚類的OTU數(shù)目為648 個。對序列進行隨機抽樣并獲得對應(yīng)的數(shù)量構(gòu)建稀釋曲線，見圖1。

圖1 稀釋曲線

由圖1 可知，該曲線趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大并且樣本的測序數(shù)據(jù)量合理。

納豆芽孢桿菌對肉仔雞盲腸菌群多樣性的影響見表6。由表6 可知，與對照組相比，試驗組肉雞腸道微生物多樣性有所提高。對照組和試驗組盲腸菌群測序覆蓋率達到99.87%，說明樣本中未檢測序列的概率很低。各組間42 日齡肉雞盲腸生物群落α 多樣性指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。

表6 納豆芽孢桿菌對肉仔雞盲腸菌群多樣性的影響

2.4.2 盲腸微生物Beta多樣性分析（見圖2）

圖2 盲腸微生物Beta多樣性分析

由圖2 可知，根據(jù)樣品間距離，微生物群落有部分相似性，群落結(jié)構(gòu)相似度較高，分析表明對照組和處理組差異顯著（P＜0.05），同組微生物具有明顯聚類。

2.4.3 盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)分析（見圖3～圖5）

圖3 42日齡盲腸菌群門水平相對豐度

圖4 42日齡盲腸菌群屬水平相對豐度

圖5 腸道微生物菌群屬水平組間差異

由圖3 可知，對照組和試驗組肉仔雞盲腸菌群由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobaceteriota）和變形菌門（Proteobacteria）等菌門組成，是不同組別中菌群的主要組成成分，其中前4種微生物大約占群落總數(shù)的98%。

由圖4 可知，對照組和試驗組肉仔雞盲腸菌群由另枝菌屬（Alistipes）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、未分類f_norank_o_梭菌目_UCG-014（norank_f_norank_o_Clostridia-UCG-014）、 未分類_f_毛螺菌屬（unclassified_f_Lachnospiraceae）、梭菌目vadin BB60 菌科的 norank_f_ 菌屬 （noramk_f__Clostridiales_vadin BB60_group） 、 瘤 胃 菌 屬（Ruminococcus_torques_group）、Barnesiella、巨單胞菌屬（Megamonas）、羅姆布茨菌（Romboutsia）、布勞特氏菌屬 （Blautia）、 雙歧桿菌屬 （Bifidobacterium）、Shuttleworthia、 Colidextribacter、 考 拉 桿 菌 屬（Phascolarctobacterium）等其他菌門組成，是不同組別中菌群的主要組成成分，其中前10種微生物大約占群落總數(shù)的74%。

由圖5 可知，試驗組Enorma、未分類_f_黃桿菌屬（norank_f_Flavobacteriaceae）、Paludicola顯著高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 納豆芽孢桿菌對肉仔雞生長性能的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌能夠降低肉仔雞腹部脂肪的堆積，顯著提高肉雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率[11]。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加納豆芽孢桿菌可顯著提高肉仔雞平均日增重、降低料重比，與上述試驗結(jié)果一致，說明納豆芽孢桿菌能夠顯著提高肉仔雞的生長性能。

3.2 納豆芽孢桿菌對肉仔雞血清免疫的影響

IgM 是抗原刺激后產(chǎn)生的第一種抗體，可以通過殺菌、激活補體等作用提高機體免疫功能[12-13]。據(jù)報道，肉仔雞日糧中添加不同劑量復(fù)合益生菌后可顯著提高血清IgG和IgM含量[14]。張俊瑜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肉雞日糧中加入不同水平的納豆芽孢桿菌均能夠提高血清IgG、IgM、IgA含量，與胥振國等[16]的研究結(jié)論一致。本試驗結(jié)果顯示，日糧中添加納豆芽孢桿菌提高肉仔雞血清IgA、IgG、IgM 含量，表明納豆芽孢桿菌對肉仔雞的機體免疫有一定的促進作用，可減輕肉仔雞炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

3.3 納豆芽孢桿菌對肉仔雞腸道炎癥的影響

當病原菌進入腸道后，腸相關(guān)淋巴樣組織（gutassociated lymphoid tissue，GALT）釋放多種細胞因子（如白細胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等物質(zhì)），可有效避免有害病菌入侵，維持腸道健康[17]。細胞因子參與和介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)[18]，根據(jù)細胞因子的作用可分為參與促進炎癥反應(yīng)的促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α 等）以及具有緩解炎癥反應(yīng)的抗炎因子（IL-10、IL-4等）[19]。當機體發(fā)生炎癥時，機體內(nèi)促炎細胞因子IL-6、IL-1β含量升高，導(dǎo)致炎癥加劇[20]。趙會利等[21]發(fā)現(xiàn)，將納豆芽孢桿菌與牛奶混合飼喂犢牛可降低斷奶犢牛IL-6和IL-1β 的含量，緩解犢牛的斷奶應(yīng)激，從而影響犢牛的生長發(fā)育。在本試驗中，納豆芽孢桿菌能夠降低肉仔雞腸道黏膜促炎因子IL-1β 的含量，從而調(diào)節(jié)肉仔雞腸道免疫系統(tǒng)保持穩(wěn)定。

3.4 納豆芽孢桿菌對肉仔雞腸道菌群的影響

腸道是動物機體的重要消化器官，包含大量的微生物。腸道微生物對機體的營養(yǎng)代謝、生長起重要作用，也是導(dǎo)致動物腸道免疫系統(tǒng)成熟的重要因素。因此，腸道微生物菌群的數(shù)量與結(jié)構(gòu)影響著動物機體的消化和健康。動物機體受到品種、日糧、所處環(huán)境尤其是胃腸道環(huán)境的變化時，能夠引起腸道微生物的變化，進而對動物機體產(chǎn)生影響，因此，動物機體與其腸道菌群之間存在共生關(guān)系[22-23]。

腸道菌群α多樣性中，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)反映了菌群的豐富程度，其值越大，菌群豐富度越大；Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映了腸道菌群的多樣性，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，物種多樣性越大[24]。隨著腸道菌群的多樣性增加，腸道微生物群對入侵細菌的抵抗力也進一步增強，兩者呈正相關(guān)[25]。本試驗中，與對照組相比，試驗組肉仔雞盲腸中Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)均有不同程度的上升和下降趨勢，說明添加納豆芽孢桿菌能豐富腸道菌群多樣性。本試驗基于PCoA分析發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌改變了菌群結(jié)構(gòu)。腸道菌群結(jié)構(gòu)與動物生長、發(fā)育和健康存在密切聯(lián)系，對動物機體物質(zhì)代謝、營養(yǎng)吸收、免疫調(diào)節(jié)和保護屏障等方面具有重要作用[26]。有研究顯示，添加芽孢桿菌可調(diào)節(jié)動物腸道菌群組成及維持腸道健康[27]。黃俊文等[28]研究發(fā)現(xiàn)，添加納豆芽孢桿菌仔豬腸道內(nèi)容物中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量上升，腸黏膜中乳酸桿菌數(shù)量上升且大腸桿菌數(shù)量下降。吳高峰等[29]對小鼠灌胃納豆芽孢桿菌溶液，結(jié)果顯示，腸道益生菌群（包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌等）顯著增多，腸道致病菌群（包括腸球菌、腸桿菌、變形桿菌等）均明顯減少。吳德華等[30]研究在仔犬日糧中添加納豆芽孢桿菌也得到了類似結(jié)果。鐘青萍等[31]研究發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌對一些常見的腸道致病菌也具有明顯的抑制作用，如沙門氏菌、大腸桿菌等。陳冬金等[32]研究表明，納豆菌復(fù)合組unclassified_o__Clostridiales的相對豐度顯著降低。楊利娜等[33]研究發(fā)現(xiàn)，單胃動物盲腸中的微生物多樣性最高，其優(yōu)勢菌群主要有擬桿菌門與厚壁菌門。原因可能是納豆芽孢桿菌分泌抗菌物質(zhì)，如吡啶二羧酸和多黏菌素抑制致病菌（如痢疾桿菌、原發(fā)性大腸桿菌、傷寒菌、沙門氏菌等）的生長，拮抗腸內(nèi)病原細胞，緩解腸道疾病[5,34-35]。本試驗結(jié)果顯示，在肉仔雞的腸道微生物中，厚壁菌門相對豐度最高，其次為擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、厚壁菌門，上述均為優(yōu)勢菌群；在屬水平以另枝菌屬、糞桿菌屬、擬桿菌屬、未分類f_norank_o_梭菌目_UCG-014 為主，對照組Ruminococcaceae_UCG-010 顯著高于納豆菌處理組，提高了另枝桿菌的相對豐度，糞桿菌屬、擬桿菌屬的相對豐度有所降低，改變了肉仔雞盲腸優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)的占比，說明飼喂納豆芽孢桿菌能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群比例，改變?nèi)庾须u腸道菌群組成，進而提高了肉仔雞的生長性能。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，納豆芽孢桿菌可改善肉仔雞腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高腸道菌群豐富度和多樣性，增強機體免疫功能，進而提高肉仔雞生長性能。