基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的環(huán)肽分子計算設(shè)計

王凡灝，來魯華1，，3，張長勝1，

（1 北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院定量生物學(xué)中心，北京 100871； 2 北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京分子科學(xué)國家研究中心，北京 100871； 3 北京大學(xué)-清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100871）

1 環(huán)肽藥物

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在生物體系中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，很多相互作用體系，如酶／抑制劑、細(xì)胞因子／細(xì)胞膜受體、病原體／受體、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)作用、分子機(jī)器組裝體內(nèi)部作用、蛋白質(zhì)聚集等都被認(rèn)為是潛在的重要靶標(biāo)［1-4］。通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用可以提高藥物的專一性，減少藥物的毒副作用。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用已經(jīng)成為國內(nèi)外藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)競相投入研發(fā)的藥物靶點(diǎn)［5-10］。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用界面一般較大而平坦，較難進(jìn)行高專一性結(jié)合的小分子化合物設(shè)計。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用界面面積通常為1500～3000 ?2，而小分子化合物總的溶劑可及表面積只有約150～500 ?2。相對于小分子，多肽分子可以提供較大的結(jié)合界面，并且具有易合成［11］、結(jié)合專一性強(qiáng)、毒性小、免疫原性小等獨(dú)特的優(yōu)勢［12-16］。使用天然多肽作為藥物，在調(diào)控分泌蛋白、細(xì)胞膜上受體等蛋白質(zhì)功能方面已取得了很大成功［17］。但由于天然多肽在很多情況下存在熱穩(wěn)定性差、易被蛋白酶降解、結(jié)合較弱的缺點(diǎn)，導(dǎo)致這些多肽分子在體內(nèi)的半衰期短、藥效弱［18-21］。所以，改造這些多肽分子或全新設(shè)計穩(wěn)定的多肽是藥物研發(fā)的重要目標(biāo)［22-23］。

多肽分子的環(huán)化，如主鏈?zhǔn)孜残纬甚０锋I、殘基側(cè)鏈間形成二硫鍵或其他共價鍵，可以限制多肽的構(gòu)象，是提高多肽藥物穩(wěn)定性的重要手段。環(huán)肽降低了肽鏈的柔性，因此還可以減少與靶蛋白結(jié)合的熵?fù)p失［24-30］。在天然氨基酸環(huán)肽的基礎(chǔ)上再引入N-甲基化氨基酸、D型氨基酸、類肽等非天然殘基可以更近一步解決易被蛋白酶水解等問題，并進(jìn)一步拓寬其可設(shè)計化學(xué)空間［31］。天然產(chǎn)物與人工設(shè)計的環(huán)肽分子越來越多地用作調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，例如HDAC抑制劑［32-34］、灰霉素［35］、CXCR4拮抗劑［36-37］、抑制HIF-1a/HIF-1b的cyclo-（CLLFVY）［35，38］等。

過去20年里經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市的環(huán)肽藥物有18種［39-40］，包括激素類藥物和靶向藥，表1列出了這些藥物的結(jié)構(gòu)和功能。

表1 已獲FDA批準(zhǔn)的18種環(huán)肽類藥物匯總表Table 1 Summary of 18 cyclic peptide drugs approved by FDA

這些分子主要來源于從自然界中分離的環(huán)肽，經(jīng)改造優(yōu)化提高了效價、藥代動力學(xué)和藥代動力學(xué)特性。例如通過將芳香萘和D-色氨酸加入生長抑素類藥物蘭瑞肽（Lanreotide，結(jié)構(gòu)見表1），可以穩(wěn)定其超分子堆積的納米管，有助于延長其半衰期、抑制激素水平和活性的能力。從技術(shù)角度來看，環(huán)肽藥物的開發(fā)得益于快速發(fā)展的化學(xué)合成與修飾方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，環(huán)肽的分子結(jié)構(gòu)不僅可以進(jìn)行靈活修飾，一級序列也可以快速突變和優(yōu)化，以獲得更高的產(chǎn)量與生物活性。例如由環(huán)孢素衍生而來的伏環(huán)孢素（Voclosporin，結(jié)構(gòu)見表1）就是利用化學(xué)修飾，將E-MePmt1分子基團(tuán)取代環(huán)孢素A（CsA）中第一個殘基Bmt1［41-42］，以優(yōu)化其對靶標(biāo)的結(jié)合能力，并提升了代謝穩(wěn)定性［43-45］。但是單純通過大規(guī)模實(shí)驗(yàn)分離與篩選的方法獲得可結(jié)合靶標(biāo)蛋白環(huán)肽分子的效率低、成本高，所以計算設(shè)計方法將極大地幫助環(huán)肽藥物的開發(fā)［46-48］。

2 環(huán)肽的結(jié)構(gòu)與環(huán)肽-靶標(biāo)蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)

環(huán)肽的三維結(jié)構(gòu)和環(huán)肽與靶標(biāo)蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)為理解環(huán)肽性質(zhì)和功能機(jī)制提供了重要依據(jù)。已有很多工作收集了自由環(huán)肽的實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)，例如，Beaufays等［49］的研究中收集了38個PDB數(shù)據(jù)庫中的環(huán)肽結(jié)構(gòu)作為測試集，長度5～30個殘基，通過側(cè)鏈或主鏈之間的共價鍵連接成環(huán)；黃勝友實(shí)驗(yàn)室［50］在多肽構(gòu)象生成方法MODPEP2.0的研究中，收集了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）中采取二硫鍵連接成環(huán)的環(huán)肽結(jié)構(gòu)。我們對PDB中的環(huán)肽配體與靶標(biāo)蛋白的高分辨（≤2.5 ?）復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了統(tǒng)計分析，截至2022年9月，PDB中包含了經(jīng)過去冗余的88個環(huán)肽配體與靶標(biāo)蛋白的高分辨復(fù)合物結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)中的環(huán)肽配體長度為5～21個殘基，靶標(biāo)蛋白在相互作用界面上被埋藏的面積大部分在300～700 ?2之間（見表2）。

表2 PDB數(shù)據(jù)庫中的環(huán)肽-靶標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表Table 2 Non-redundant cyclic peptide-target protein complex structures in the PDB database

這些結(jié)構(gòu)中，31個環(huán)肽配體通過酰胺鍵環(huán)化，23個環(huán)肽配體通過二硫鍵環(huán)化，41個環(huán)肽配體中含D型氨基酸或其他非天然氨基酸，或者是引入了新的基團(tuán)實(shí)現(xiàn)合環(huán)，例如圖1（c）的環(huán)肽是由線性肽兩末端的半胱氨酸通過與α，α＇-二氯-間二甲苯反應(yīng)形成的合環(huán)［51］。其中不含D型氨基酸環(huán)肽的主鏈二面角φ和ψ分布與天然蛋白的Ramachandran統(tǒng)計分布相近，如［圖1（a）］所示，這些二面角大都在Ramachandran統(tǒng)計允許的范圍之內(nèi)。Riniker團(tuán)隊(duì)［52］對PDB數(shù)據(jù)庫和CSD數(shù)據(jù)庫中的大環(huán)化合物（包括環(huán)肽）的統(tǒng)計結(jié)果表明，環(huán)上可旋轉(zhuǎn)單鍵數(shù)≤8時，才會導(dǎo)致環(huán)上的二面角分布受環(huán)應(yīng)力的影響而偏離相應(yīng)線性分子的分布范圍［52］，而環(huán)肽分子的環(huán)內(nèi)一般含有≥5個殘基，可旋轉(zhuǎn)單鍵數(shù)一般≥10。含D型氨基酸的L/D混合環(huán)肽的主鏈二面角ψ和φ的分布［見圖1（b）］趨近于甘氨酸的非手性Ramachandran統(tǒng)計分布。

圖1 PDB中環(huán)肽-靶標(biāo)復(fù)合物數(shù)據(jù)集（見表2）中環(huán)肽配體的參數(shù)統(tǒng)計圖（a）、（b）中藍(lán)色背景分布為天然蛋白質(zhì)體系的氨基酸殘基扭轉(zhuǎn)角ψ/φ的分布。（a）僅含天然氨基酸殘基的環(huán)肽配體主鏈扭轉(zhuǎn)角分布圖（ψ/φ）；（b）存在非天然氨基酸殘基的環(huán)肽配體主鏈扭轉(zhuǎn)角分布圖（ψ/φ）；（c）數(shù)據(jù)集中所有環(huán)肽配體環(huán)序列長度分布圖；（d）數(shù)據(jù)集中所有環(huán)肽配體與靶標(biāo)之間界面面積分布圖Fig.1 Parameters of cyclic peptide ligands with the cyclic peptide-target complex data set (see Table 1) in PDB Distribution of torsion angles of the main chain of cyclic peptide ligands containing natural (a) and non-natural (b) amino acid residues (ψ/φ), in which blue cloud highlights the distribution of the torsion angle ψ/φ of amino acid residues in natural proteins; Length distribution of the loop sequences of all cyclic peptide ligands in the data set (c); Distribution of the interface area between all cyclic peptide ligands and targets (d)

此外，有些環(huán)肽結(jié)構(gòu)中存在一些較為剛性的局部結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定分子骨架，從而減少與靶標(biāo)蛋白結(jié)合過程中的熵?fù)p失，增強(qiáng)環(huán)肽配體與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合［26-27，30，53-54］，如圖2中的β發(fā)卡末端環(huán)化形成的環(huán)肽配體結(jié)構(gòu)［（a）以側(cè)鏈二硫鍵合環(huán)，（b）以首尾酰胺鍵合環(huán)］，β片層之間的氫鍵和β轉(zhuǎn)角處形成的1，3、1，4氫鍵相互作用，穩(wěn)定了環(huán)肽的構(gòu)象，增強(qiáng)了骨架的剛性。脯氨酸也可以限制環(huán)肽主鏈的運(yùn)動，因此在剛性環(huán)肽骨架的從頭設(shè)計工作中引入脯氨酸也是穩(wěn)定目標(biāo)骨架結(jié)構(gòu)的重要策略［55-56］。

圖2 PDB編號為5DJC（a）、4K1E（b）和5NES（c）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)環(huán)肽配體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Cyclic peptide ligand structures for the complexes in PDB 5DJC (a), 4K1E (b) and 5NES (c)

分子動力學(xué)模擬（MD simulation）是研究蛋白質(zhì)和多肽結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的重要手段?；诜肿觿恿W(xué)模擬的環(huán)肽藥物分子的構(gòu)象研究推動了研究者們對環(huán)肽構(gòu)象的深入理解與經(jīng)驗(yàn)積累，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模環(huán)肽分子從頭設(shè)計提供了理論依據(jù)［57］。由于蛋白質(zhì)中的環(huán)結(jié)構(gòu)（loop）與環(huán)肽結(jié)構(gòu)較為相似，通用的分子動力學(xué)模擬力場參數(shù)根據(jù)蛋白質(zhì)loop結(jié)構(gòu)進(jìn)行重新擬合調(diào)整后可以更好地用于環(huán)肽分子的結(jié)構(gòu)優(yōu)化與構(gòu)象采樣［58-63］。Geng等［64］就曾以晶體結(jié)構(gòu)為基準(zhǔn)，比較了四種多肽力場Amber99 sb-ildn［65］、OPLS-AA/L、RSFF1［66］和RSFF2［67］預(yù)測全反式（酰胺鍵）環(huán)肽結(jié)構(gòu)的能力。其中基于蛋白質(zhì)環(huán)形結(jié)構(gòu)（loop）庫進(jìn)行參數(shù)化的RSFF1和RSFF2力場得到的預(yù)測結(jié)果與晶體結(jié)構(gòu)匹配最佳［68］。同其他柔性體系一樣，增強(qiáng)采樣的方法可以加速環(huán)肽構(gòu)象采樣的過程，提升采樣的效率。其中最為廣泛使用的是副本交換分子動力學(xué)（REMD）［69-71］和元動力學(xué)（META）［72-73］。

3 環(huán)肽分子結(jié)構(gòu)建模（結(jié)構(gòu)預(yù)測/構(gòu)象生成）

環(huán)肽分子結(jié)構(gòu)建模的目標(biāo)是生成環(huán)肽的低能量的合理構(gòu)象，對于較剛性的環(huán)肽，如環(huán)化的β發(fā)夾，就是預(yù)測出準(zhǔn)確的折疊結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中收集環(huán)肽結(jié)構(gòu)建立數(shù)據(jù)集來檢驗(yàn)由環(huán)肽結(jié)構(gòu)建模算法的表現(xiàn)。計算生成的環(huán)肽構(gòu)象是環(huán)肽與靶標(biāo)蛋白對接篩選的前提。經(jīng)檢驗(yàn)，環(huán)肽分子的結(jié)構(gòu)采樣方法以及打分評價方法，可直接用于大規(guī)模的基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的環(huán)肽分子的改造、生成、評價［74］。

3.1 基于模板結(jié)構(gòu)的比較模建算法

黃勝友實(shí)驗(yàn)室［50］開發(fā)的MODPEP2.0（http：//huanglab.phys.hust.edu.cn/software/modpep2）可以快速地產(chǎn)生二硫鍵環(huán)化的環(huán)肽構(gòu)象。他們從PDB數(shù)據(jù)庫中收集了3～30個氨基酸長度的二硫鍵環(huán)肽結(jié)構(gòu)，通過聚類選擇后得到的不同長度的二硫鍵環(huán)肽結(jié)構(gòu)集合作為目標(biāo)環(huán)肽構(gòu)象生成的模板庫。MODPEP2.0選取與目標(biāo)肽序列相似性高的，并且結(jié)構(gòu)分辨率高的結(jié)構(gòu)做模板，選取概率如下：

式中，si是基于目標(biāo)序列和第i個結(jié)構(gòu)的序列相似性；ri是第i個結(jié)構(gòu)的分辨率，除以相應(yīng)的最大值（smax，rmax）是為了對不同的打分項(xiàng)進(jìn)行歸一化；w為兩項(xiàng)的權(quán)重系數(shù)。之后在選定的模板主鏈上應(yīng)用側(cè)鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)子庫逐個殘基安裝側(cè)鏈，得到目標(biāo)二硫鍵環(huán)肽的構(gòu)象，并通過選取不同的模板生成多樣的構(gòu)象［50］。對于環(huán)以外序列的結(jié)構(gòu)，算法用MODPEP的早期版本通過片段組裝方法完成［75］。該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了測試方法對MODPEP2.0生成構(gòu)象的準(zhǔn)確性進(jìn)行評價，當(dāng)生成10種或100種構(gòu)象時，與測試數(shù)據(jù)集中結(jié)構(gòu)最接近的Cα RMSD平均值分別為2.20 ?、1.66 ?［50，75］。

張陽實(shí)驗(yàn)室［76］發(fā)展的I-TASSER是基于結(jié)構(gòu)采樣和優(yōu)化作蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的代表性方法之一，加入環(huán)化所需的共價距離約束就可用于環(huán)肽結(jié)構(gòu)預(yù)測［76］，提供在線計算服務(wù)（http：//zhang.bioinformatics.ku.edu/I-TASSER）。該算法通過多種序列比對方法識別與連續(xù)片段相似的PDB模板結(jié)構(gòu)，將模板的主鏈作為這個片段的主鏈結(jié)構(gòu)，并通過基于模板片段副本交換的蒙特卡洛采樣方法探索整個蛋白質(zhì)或多肽的結(jié)構(gòu)空間，獲得能量較低的結(jié)構(gòu)模型。環(huán)肽中的環(huán)化共價鍵可作為幾何約束加入能量函數(shù)。在Peplook的環(huán)肽結(jié)構(gòu)測試集中，I-TASSER表現(xiàn)優(yōu)異［49，76］。

3.2 基于主鏈結(jié)構(gòu)預(yù)測和分子力場優(yōu)化的方法

PEPstrMOD算法（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/pepstrmod/）從序列預(yù)測所得二級結(jié)構(gòu)（α螺旋、β片、轉(zhuǎn)角、無規(guī)等）類型構(gòu)建多肽的初始主鏈構(gòu)象，使用Amber力場對結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化和動力學(xué)模擬優(yōu)化［77］。對于環(huán)肽，在分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中加入相關(guān)共價鍵連。PEPstrMOD將末端修飾、D-氨基酸、非天然氨基酸、翻譯后修飾等殘基類型的力場參入加入Amber力場，使之可以預(yù)測含有非天然氨基酸殘基的多肽結(jié)構(gòu)［77-79］。PEPstrMOD算法在來自于PDB數(shù)據(jù)庫的ModPep、ModPep16、CyclicPep三個數(shù)據(jù)集上進(jìn)行了檢驗(yàn)，預(yù)測得到的主鏈原子的均方根偏差為3.81～4.05 ?之間。

PEP-FOLD算法（https：//mobyle.rpbs.univ-parisdiderot.fr/cgi-bin/portal.py#forms：：PEP-FOLD3）也是先從序列預(yù)測各殘基處的主鏈構(gòu)象，然后利用力場做優(yōu)化。不同的是PEP-FOLD將主鏈二級結(jié)構(gòu)擴(kuò)展為27種類型，基于預(yù)測的所有位置的這27種類型的概率分布，使用貪婪算法構(gòu)建粗?；娜S模型，使用蒙特卡洛方法作粗?；鰞?yōu)化后再構(gòu)建全原子模型。同樣地，在分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中加入相關(guān)共價鍵連用于環(huán)肽的結(jié)構(gòu)預(yù)測［80-81］。PEPFOLD的最新版本改進(jìn)了粗?；龅姆兜氯A項(xiàng)和用于主鏈結(jié)構(gòu)預(yù)測的片段庫，提高了多肽結(jié)構(gòu)的預(yù)測性能［80-83］。

3.3 基于主鏈扭轉(zhuǎn)角采樣的環(huán)肽結(jié)構(gòu)預(yù)測算法

環(huán)肽局部連續(xù)片段的構(gòu)象運(yùn)動是兩端都受約束的運(yùn)動，與力學(xué)中的運(yùn)動學(xué)閉環(huán)（kinematic closure，KIC）類似，例如對于機(jī)器人，在給定肩部和指尖固定位置的情況下，確定機(jī)器人手臂內(nèi)部關(guān)節(jié)的可能位置與扭轉(zhuǎn)角度范圍。Rosetta（https：//www.rosettacommons.org/software）中的genKIC是運(yùn)動學(xué)閉環(huán)算法在蛋白質(zhì)環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測、蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)擾動中的成功應(yīng)用。genKIC算法選擇一肽段上第一個、中間某一個和最后一個殘基的Cα原子固定為轉(zhuǎn)動中心，然后對非轉(zhuǎn)動中心的殘基用Ramachandran概率對ψ/φ隨機(jī)采樣并對N-Cα-C鍵角采樣，得到的肽鏈在固定殘基處斷開，之后運(yùn)動學(xué)閉環(huán)算法找到使肽鏈重新閉合的3個轉(zhuǎn)動中心殘基的ψ/φ值，從而獲得肽段的新構(gòu)象［84］。使用Rosetta勢能函數(shù)和蒙特卡洛采樣實(shí)現(xiàn)對構(gòu)象空間的探索，獲得蛋白質(zhì)環(huán)區(qū)或環(huán)肽的低能構(gòu)象［85-86］。

Peplook（http：//www.biosiris.com/en/Online_order/PepLook/PepLook_order.html）是一種對蛋白質(zhì)或多肽的主鏈二面角進(jìn)行玻爾茲曼隨機(jī)采樣來預(yù)測結(jié)構(gòu)的算法［49，87］。Peplook從64對ψ/φ角度中對每一個氨基酸隨機(jī)取值［88-90］，根據(jù)這些主鏈二面角值構(gòu)建結(jié)構(gòu)，并計算體系能量，在環(huán)肽結(jié)構(gòu)預(yù)測中體系能量加入首尾二硫鍵或酰胺鍵原子的距離相關(guān)項(xiàng)。每一輪生成1萬個結(jié)構(gòu)，前一輪得到的體系能量和主鏈二面角取值的關(guān)系決定下一輪中各ψ/φ角度對被取到的概率，采樣100～500輪得到低能量構(gòu)象［49］。在38個環(huán)肽測試集上，Peplook建模最佳結(jié)構(gòu)的主鏈原子的均方根偏差的平均值為3.8 ?［49，91］。

3.4 基于距離幾何的構(gòu)象生成算法

構(gòu)象生成器ETKDG是小分子化合物構(gòu)象生成最常用的方法之一。ETKDG通過分子的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)中的二面角數(shù)據(jù)，生成分子的距離邊界矩陣，根據(jù)該矩陣限定的原子間距離的范圍隨機(jī)產(chǎn)生一個距離矩陣，然后由距離矩陣產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)，之后優(yōu)化構(gòu)象［92］。最近該方法改進(jìn)了對大環(huán)化合物分子和環(huán)肽的生成。mETKDG使用橢圓幾何約束來限制環(huán)肽整體環(huán)系骨架，并且加入可調(diào)整的庫侖相互作用作為酰胺原子之間的獎勵式方法來模擬跨環(huán)分子內(nèi)氫鍵［52］。mETKDG的環(huán)肽建模性能在由PDB、CSD 篩選的環(huán)肽分子測試集上得到了驗(yàn)證，mETKDG的重構(gòu)主鏈原子的均方根偏差的平均值為1.23 ?。目前mETKDG已經(jīng)被寫入常用的RDkit（http：//www.rdkit.org/）Python工具包中［52，92］。

4 基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的環(huán)肽分子計算設(shè)計

基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)可以改造設(shè)計或全新設(shè)計與之結(jié)合的環(huán)肽分子，在具有備選的環(huán)肽庫的情況下，通過基于分子對接的虛擬篩選，可以縮小實(shí)驗(yàn)測試的分子范圍，從而更高效地發(fā)現(xiàn)新的結(jié)合靶標(biāo)的環(huán)肽分子。分子動力學(xué)模擬是詳細(xì)研究和改進(jìn)已知環(huán)肽分子的重要方法。近年來，以Rosetta為代表的從頭生成算法大大拓展了設(shè)計環(huán)肽分子的化學(xué)空間，為針對特定靶標(biāo)結(jié)構(gòu)設(shè)計全新的環(huán)肽藥物分子提供了解決方案。對于細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)蛋白，需要在設(shè)計中考慮跨膜活性。因此本節(jié)將介紹這4個方面的計算設(shè)計方法（圖3），表3總結(jié)了這些算法的主要思路和適用目的。

圖3 基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的環(huán)肽設(shè)計算法（a）基于分子對接的虛擬篩選算法；（b）基于分子動力學(xué)模擬的理性設(shè)計算法；（c）從頭設(shè)計算法；（d）跨膜環(huán)肽分子的設(shè)計算法Fig.3 Overview of computational methods for target structure based cyclic peptide design(a) Virtual screening algorithms based on molecular docking; (b) Rational design algorithms based on molecular dynamics simulation;(c) De novo design algorithms;(d) Design algorithms for transmembrane cyclic peptides

表3 基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的環(huán)肽分子計算設(shè)計算法Table 3 Structure based computational design algorithms of cyclic peptides

4.1 基于分子對接的虛擬篩選方法

基于大規(guī)模環(huán)肽數(shù)據(jù)庫的虛擬篩選是最早出現(xiàn)的計算設(shè)計方法，環(huán)肽結(jié)構(gòu)庫和對接及打分算法是這一方法的核心內(nèi)容。

Duffy等［95］于2011年便嘗試過生成用于虛擬篩選的環(huán)肽數(shù)據(jù)庫，開發(fā)了CycloPs，該程序可以根據(jù)規(guī)則與用戶預(yù)定義的約束，大量生成一維SMILES，通過RDkit建模為三維環(huán)肽分子結(jié)構(gòu)，結(jié)合后續(xù)的虛擬篩選構(gòu)成了完整的環(huán)肽藥物的設(shè)計流程。但是環(huán)肽藥物發(fā)現(xiàn)的虛擬篩選方法往往局限于數(shù)據(jù)庫的規(guī)模與復(fù)合物對接建模的準(zhǔn)確度。

Sanner實(shí)驗(yàn)室［96-97］開發(fā)的AutoDock CrankPep（或簡稱ADCP）是由小分子-蛋白對接軟件AutoDock改進(jìn)而來的多肽（環(huán)肽）對接軟件（https：//ccsb.scripps.edu/adcp），可以對接長度在20個氨基酸殘基以內(nèi)的線性多肽與環(huán)肽結(jié)構(gòu)。他們應(yīng)用了基于多肽骨架的曲軸運(yùn)動微擾方式，支持對具有環(huán)肽主鏈的構(gòu)象進(jìn)行高效采樣，并在AutoDock基本的Monte Carlo采樣過程中引入了主鏈環(huán)化勢能項(xiàng)，使得程序能夠從線性多肽序列出發(fā)的擴(kuò)展線性肽開始對接計算，從而在沒有初始環(huán)狀構(gòu)象可用的情況下實(shí)現(xiàn)對接與環(huán)化同時進(jìn)行，最終得到環(huán)肽-蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)。最后，距離依賴性勢能確保多肽環(huán)化。這種勢能不同于之前的基于環(huán)化勢能的方法，ADCP中線性多肽能夠在模擬過程中環(huán)化、斷裂和重組［96-97］，中間狀態(tài)的存在允許算法在對接過程中探索主鏈的各種構(gòu)象組合并確定最佳二硫鍵或首尾環(huán)化位點(diǎn)。ADCP測試的平均fnc（對接得到的復(fù)合物構(gòu)象對于天然復(fù)合物構(gòu)象中的原位配體-受體相互作用對的召回率，在蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)預(yù)測比賽CAPRI中，fnc高于0.3對應(yīng)中等對接精度，fnc超過0.5則認(rèn)為對接精度較高）超過0.5［98］。ADCP是環(huán)肽-受體復(fù)合物相互作用建模和結(jié)構(gòu)預(yù)測的有效工具，可用于開發(fā)設(shè)計環(huán)肽藥物，并在相當(dāng)一段時間內(nèi)被認(rèn)為是該領(lǐng)域最先進(jìn)的SOTA（state of the arts）算法［93］。

與ADCP類似，HADDOCK算法的最新2.4版本（https：//wenmr.science.uu.nl/haddock2.4）在對接過程中也應(yīng)用了末端二硫鍵幾何約束或者首尾氨基酸距離約束，使多肽結(jié)構(gòu)在對接過程中逐步環(huán)化［94］。在對接流程中，用于對接的環(huán)肽是用PyMOL的內(nèi)置功能從多肽序列生成起始構(gòu)象［99］，HADDOCK會利用環(huán)化約束指導(dǎo)線性多肽結(jié)構(gòu)逐步收緊多肽首尾或二硫鍵之間的距離（通過HADDOCK）使線性肽強(qiáng)制環(huán)化。環(huán)化之后，HADDOCK會將生成的環(huán)肽結(jié)構(gòu)分別與各自的受體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接，并實(shí)施9種對接方案以獲得高質(zhì)量的配體結(jié)構(gòu)［94］。HADDOCK在環(huán)肽-蛋白質(zhì)復(fù)合物建模方面的表現(xiàn)與ADCP基本相當(dāng)［96］［在完全未結(jié)合狀態(tài)從頭對接的情況下與ADCP的表現(xiàn)相當(dāng)，在重建模（redock）性能評估時略優(yōu)于ADCP（HADDOCK中的默認(rèn)模式）］。由于HADDOCK還可以結(jié)合各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（例如關(guān)于肽構(gòu)象的核磁共振譜圖信息）來指導(dǎo)對接，因此基于已知結(jié)構(gòu)的測試性能可被認(rèn)為是下限，通過額外的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入可以進(jìn)一步增強(qiáng)算法性能［94］。環(huán)肽配體的對接建模為環(huán)肽藥物分子的虛擬篩選與理性設(shè)計提供了高效可靠的工具。

4.2 借助于動力學(xué)模擬的設(shè)計方法

較為傳統(tǒng)的藥物分子改性與理性設(shè)計方法仍然適用于設(shè)計環(huán)肽配體，這類方法向環(huán)肽復(fù)合物體系的遷移應(yīng)用往往依賴于高效的環(huán)肽配體分子構(gòu)象采樣算法。

Razavi等［79］使用計算篩選和REMD模擬相結(jié)合的算法，通過模擬LapD中的β-發(fā)夾（hairpin）結(jié)構(gòu)，成功設(shè)計了環(huán)肽配體。LapD是一種細(xì)菌蛋白，其與LapG的相互作用對生物膜的形成至關(guān)重要［78-79，100-101］。該團(tuán)隊(duì)首先使用隱式溶劑模型的REMD 模擬用于快速篩選潛在的環(huán)肽模擬物［69］，隨后應(yīng)用顯式溶劑模型進(jìn)一步進(jìn)行模擬采樣結(jié)合虛擬篩選方法得到4種最有利的設(shè)計產(chǎn)物，最終成功設(shè)計出了類似LapD β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一系列環(huán)肽配體［73］。若已知體系的決速自由度，則可以應(yīng)用BE-META模擬方法以實(shí)現(xiàn)高效構(gòu)象采樣。例如，在基于isoDGR的αvβ3環(huán)肽拮抗劑的設(shè)計中便使用了BE-META結(jié)合多構(gòu)象對接的方法［102］，從而在其構(gòu)象系綜中發(fā)現(xiàn)最有利于結(jié)合的配體構(gòu)象，并根據(jù)這些優(yōu)勢構(gòu)象進(jìn)一步修改isoDGR分子結(jié)構(gòu)，衍生物的平衡系綜更傾向于與受體產(chǎn)生強(qiáng)結(jié)合的狀態(tài)［69］。

4.3 從頭生成設(shè)計方法

從頭設(shè)計方法可以得到與已知肽段結(jié)構(gòu)完全不同的全新結(jié)構(gòu)環(huán)肽，需要同時考慮生成環(huán)肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及跟靶標(biāo)蛋白的親和力，在環(huán)肽結(jié)構(gòu)采樣的同時優(yōu)化與靶標(biāo)蛋白的計算結(jié)合能。

在不考慮靶標(biāo)的自由環(huán)肽結(jié)構(gòu)生成方面，Hosseinzadeh等［55］利用基于Rosetta軟件的genKIC算法生成L/D氨基酸混合的7～14個殘基的環(huán)肽的主鏈骨架結(jié)構(gòu)。用全甘氨酸的序列和甘氨酸、脯氨酸非手性的Ramachandran概率對ψ/φ隨機(jī)采樣，生成閉環(huán)的主鏈骨架，最終得到200多個預(yù)測可折疊成單個穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的環(huán)肽，其中12個結(jié)構(gòu)得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此工作的算法流程支持加入D-氨基酸來拓寬構(gòu)象空間并且能夠形成雙環(huán)（同時存在首尾酰胺鍵連接與二硫鍵連接）拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以增強(qiáng)大環(huán)剛性，這些結(jié)構(gòu)幾乎完全覆蓋了已知環(huán)肽化合物可能的構(gòu)象空間，并探索到了大量非天然的局部二級結(jié)構(gòu)，大大拓寬了理性環(huán)肽藥物設(shè)計和虛擬篩選方法的可用起始結(jié)構(gòu)空間［55］。之后，Hosseinzadeh等［34］在2021年提出了錨擴(kuò)展（anchor extension）方法，將genKIC環(huán)肽結(jié)構(gòu)設(shè)計方法用于直接在靶標(biāo)蛋白表面設(shè)計環(huán)肽配體，是一次里程碑式的嘗試。這種方法需要目標(biāo)受體表面的三維結(jié)構(gòu)，并利用已知有較強(qiáng)結(jié)合配體分子的對結(jié)合能貢獻(xiàn)較大的基團(tuán)作為錨，置于原位（同時刪除配體的其余部分結(jié)構(gòu)），錨即為環(huán)肽結(jié)構(gòu)向外延伸的起始位點(diǎn)。錨擴(kuò)展方法使用Rosetta軟件中的廣義運(yùn)動學(xué)閉環(huán)方法（genKIC）在錨點(diǎn)周圍構(gòu)建環(huán)肽骨架，生成的合理大環(huán)骨架從錨點(diǎn)出發(fā)向外延伸進(jìn)行主鏈優(yōu)化采樣與序列設(shè)計，逐步增強(qiáng)其與受體之間的相互作用［84-86］。作者選定的測試體系是HDAC2和HDAC6分別與一種藍(lán)藻毒素Largazole結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，保留其中的2-硫-2-氨基-7-磺酰基庚酸（SHA）的部分作為錨，來從頭設(shè)計環(huán)肽配體［103-104］，最終得到了多個IC50為納摩爾量級的產(chǎn)物（HDAC2與SHA的IC50和與環(huán)肽配體最優(yōu)IC50分別為5.4 μmol/L、9.1 nmol/L，HDAC6則為0.6 μmol/L、5.4 nmol/L）。

錨擴(kuò)展方法需要結(jié)合較強(qiáng)的“錨”殘基結(jié)構(gòu)作為起始。Delaunay等［105］提出的Des3PI算法（https：//github.com/des3pi/Public_Des3PI）能夠生成這些“錨”殘基，該團(tuán)隊(duì)利用20種氨基酸殘基與靶標(biāo)蛋白表面進(jìn)行對接篩選，得到結(jié)合較強(qiáng)的位點(diǎn)，然后將對接在表面的氨基酸殘基間通過甘氨酸簡單連接成環(huán)得到環(huán)肽配體分子［105］。這種方法普適性較強(qiáng)，但是由于主鏈結(jié)構(gòu)柔性較大，生成的環(huán)肽配體剛性與結(jié)合穩(wěn)定性弱于錨擴(kuò)展工作中精細(xì)設(shè)計的環(huán)肽配體結(jié)構(gòu)。

4.4 具有跨膜活性的環(huán)肽分子設(shè)計

藥物分子的跨膜活性決定了其是否可以作用于細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)［39］。多數(shù)多肽藥物的靶標(biāo)為細(xì)胞膜上的受體，近年來在可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的多肽設(shè)計領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)研究表明主鏈酰胺鍵的N-甲基化修飾以及降低側(cè)鏈的極性均可提高環(huán)肽的跨膜活性［39］。Sindhikara等［106］通過動力學(xué)模擬的方法發(fā)現(xiàn)，環(huán)肽分子的主鏈往往在磷脂雙分子層內(nèi)會將極性的羰基氧和氮上的氫原子通過環(huán)肽分子的構(gòu)象變化（酰胺鍵順反異構(gòu)轉(zhuǎn)變）收容到環(huán)內(nèi)，這大大降低了分子的極性，使之與磷脂細(xì)胞膜融合，穿過細(xì)胞膜后又可以被極性較大的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)，使環(huán)肽分子采取相對較為極性的構(gòu)象，易于與極性的蛋白靶標(biāo)結(jié)合，形成較為穩(wěn)定的復(fù)合物［18，107-108］。因此此類環(huán)肽分子具有隨環(huán)境極性不同轉(zhuǎn)變構(gòu)象的特性，這些特性決定了此類環(huán)肽具有作為可跨膜藥物分子的潛力［109-110］。Baker實(shí)驗(yàn)室［56］綜合了這些特性進(jìn)行了具有優(yōu)良膜滲透性的環(huán)肽設(shè)計并且取得了成功。該團(tuán)隊(duì)改進(jìn)了genKIC算法，在采樣的過程中，允許整個化學(xué)基團(tuán)（如氮甲基）被放置，這就可以在環(huán)肽結(jié)構(gòu)中引入非天然氨基酸修飾，并且Rosetta的殘基類型被重新整理為殘基和補(bǔ)丁，這些補(bǔ)丁可以通過Rosetta的能量函數(shù)來對已有的化學(xué)實(shí)體做化學(xué)修飾［111］。研究者們利用優(yōu)化調(diào)整后的Rosetta軟件設(shè)計了一系列長度為6～12的環(huán)肽結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)均為化學(xué)修飾或支持構(gòu)象轉(zhuǎn)變的剛性環(huán)肽結(jié)構(gòu)，隨后進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)合成與結(jié)構(gòu)解析，實(shí)驗(yàn)測出的結(jié)構(gòu)與設(shè)計結(jié)構(gòu)疊合較好（BB-RMSD<1.5 ?），最后測試了新結(jié)構(gòu)的膜通透性和口服生物利用效率，得到了較好的效果［56］。此工作在環(huán)肽藥物設(shè)計做了進(jìn)一步的探索，從化學(xué)修飾角度著手，大量設(shè)計結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有跨膜活性潛在環(huán)肽藥物分子，為環(huán)肽藥物分子的虛擬篩選工作進(jìn)一步提供了可靠基礎(chǔ)。

5 總結(jié)與展望

目前環(huán)肽作為調(diào)控蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的重要研究對象，已經(jīng)獲得了越來越多的關(guān)注，有關(guān)環(huán)肽分子的結(jié)構(gòu)、動態(tài)構(gòu)象、與靶標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也逐漸增多?；谶@些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，研究者通過分子動力學(xué)模擬、分子構(gòu)象采樣等方法研究了環(huán)肽的構(gòu)象空間，開發(fā)了基于比較模建、基于主鏈扭轉(zhuǎn)角采樣、基于主鏈二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分子力場優(yōu)化和基于距離幾何的環(huán)肽分子構(gòu)象生成或結(jié)構(gòu)預(yù)測算法。蛋白質(zhì)中環(huán)區(qū)（loop）與環(huán)肽的結(jié)構(gòu)和動態(tài)性質(zhì)相似，這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)也是進(jìn)行環(huán)肽構(gòu)象研究和結(jié)構(gòu)建模方法測試的重要數(shù)據(jù)來源。以這些研究為基礎(chǔ)，人們已經(jīng)開始探索基于分子對接的虛擬篩選方法、借助于分子動力學(xué)模擬的方法和基于結(jié)構(gòu)采樣的從頭生成方法來針對目標(biāo)的靶標(biāo)結(jié)構(gòu)進(jìn)行環(huán)肽分子的計算設(shè)計，近些年對環(huán)肽類化合物的生物膜透過性的研究也取得了進(jìn)展。表4總結(jié)了這些環(huán)肽分子結(jié)構(gòu)建模和基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計的方法。基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)進(jìn)行環(huán)肽設(shè)計的關(guān)鍵是能夠同時準(zhǔn)確高效地評估環(huán)肽分子結(jié)構(gòu)構(gòu)象的穩(wěn)定性、環(huán)肽配體與蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合強(qiáng)度。更加高效準(zhǔn)確的環(huán)肽序列和構(gòu)象采樣算法、環(huán)肽與靶標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合能的評估方法準(zhǔn)確，將提高環(huán)肽分子計算設(shè)計的效率和成功率，從而推動環(huán)肽藥物與功能化環(huán)肽分子的開發(fā)。另外，對已有的環(huán)肽藥物的性質(zhì)和功能機(jī)制進(jìn)行研究和學(xué)習(xí)，以及將計算設(shè)計方法和噬菌體展示、酵母展示等高通量實(shí)驗(yàn)篩選技術(shù)相結(jié)合，是促進(jìn)環(huán)肽藥物開發(fā)的途徑［112］。

表4 本文所涉及的算法總體簡介Table 4 A brief introduction of algorithms included

近年來以深度學(xué)習(xí)為代表的機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)快速發(fā)展，在圖像識別、語音識別以及自然語言處理等領(lǐng)域取得突破。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域，以AlphaFold2為代表的基于深度學(xué)習(xí)技術(shù)的端對端方法展現(xiàn)出令人驚嘆的由蛋白質(zhì)序列預(yù)測折疊結(jié)構(gòu)的效率和精度，顯著超越了基于經(jīng)驗(yàn)勢能打分和采樣的方法。結(jié)構(gòu)設(shè)計是結(jié)構(gòu)預(yù)測的反問題，機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)正在推動蛋白質(zhì)或多肽設(shè)計從基于物理勢能函數(shù)的階段到數(shù)據(jù)驅(qū)動的新階段。例如目前基于深度擴(kuò)散模型的RFdiffusion［113］、Chroma［114］等工作，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多種場景下的蛋白質(zhì)（多肽）結(jié)構(gòu)從頭生成，基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的小分子配體也可以通過深度學(xué)習(xí)模型從頭生成，比如LiGANN［115］、DeepLigBuilder［116］等。這些生成模型的成功依賴于大量的已知三維蛋白質(zhì)與復(fù)合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，基于機(jī)器學(xué)習(xí)的環(huán)肽結(jié)構(gòu)生成算法或許可以借鑒蛋白質(zhì)或多肽設(shè)計的相關(guān)算法，并通過引入蛋白質(zhì)環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)以彌補(bǔ)環(huán)肽結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)少的不足。另外，環(huán)肽設(shè)計領(lǐng)域未來的挑戰(zhàn)是更加多樣化的功能環(huán)肽的從頭設(shè)計，首先需要進(jìn)一步拓寬環(huán)肽的可設(shè)計化學(xué)空間［117-121］，比如引入非天然氨基酸、N-甲基化修飾與更豐富的環(huán)化方式等等［122-124］。在設(shè)計更多可用環(huán)肽骨架的同時能夠引入非天然的化學(xué)修飾改性，并對修飾后的分子進(jìn)行有效模擬采樣與結(jié)構(gòu)優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)對環(huán)肽分子多樣化設(shè)計與功能調(diào)控。此外，自然界中的環(huán)肽分子不只是單環(huán)結(jié)構(gòu)，通過提取天然產(chǎn)物或基于較為傳統(tǒng)的環(huán)肽合成方法即可產(chǎn)生雙環(huán)肽、三環(huán)肽等較為復(fù)雜的主鏈環(huán)系拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這些額外的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步提供空間約束以增強(qiáng)分子剛性，但同時也大大增加了構(gòu)象空間復(fù)雜性［125-126］。然而目前對于環(huán)肽體系的計算研究大多停留于單環(huán)結(jié)構(gòu)。這些需求與挑戰(zhàn)為環(huán)肽設(shè)計領(lǐng)域未來的研究提供了契機(jī)。