民族藥鍋鏟藤的質(zhì)量標準研究

赫偉 周成蕾 楊信 李麗 湯果怡

【摘 要】 目的：建立鍋鏟藤藥材的質(zhì)量標準。方法：對鍋鏟藤基原植物的藤莖及葉進行性狀鑒別、顯微鑒別和薄層色譜鑒別，測定鍋鏟藤的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、重金屬、農(nóng)藥殘留。結(jié)果：確定了鍋鏟藤的基原植物為鐮葉西番蓮Passiflora wilsonii Hemsl.。明確了鍋鏟藤基原植物的藤莖和葉橫切面的組織構(gòu)造特征及粉末鑒別特征，初步建立了鍋鏟藤的薄層色譜鑒別方法。確定了鍋鏟藤質(zhì)量標準規(guī)定。結(jié)論：文章建立的方法可作為評價鍋鏟藤質(zhì)量的標準。

【關(guān)鍵詞】民族藥；質(zhì)量標準；鐮葉西番蓮；顯微鑒別；肝炎

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）11-0029-06

Abstract：Objective To establish the quality of etnnicemedicine Caulis Passifrorae.Methods Todetermine the original plants of Caulis Passifrorae，and them was researched by Morphologica characters identification，microscopic identification and thin layer chromatography，and moisture，total ash，acid insoluble ash，extract，heavy metals，pesticide residue of Caulis Passifrorae were determined.Results To confirm the original plants of Caulis Passifrorae are Passiflora wilsonii.The structural characteristics of setm and leaf cross sections and the powder identification characteristics of ethnicemedicine Caulis Passifrorae were clarified.The identification method of TCL was preliminary estabished.To confirm quality control regulationsof Caulis Passifrorae.Conclusion To established methods can be used to evaluate the quality of etnnicemedicine Caulis Passifrorae.

Keywords：Ethnicemedicine;Quality Standard;Passiflora wilsonii Hemsl.;Microscopic Identification;Hepatitis

鍋鏟藤，又名鍋鏟葉、半截葉、金邊蓮，來源為西番蓮科西番蓮屬植物鐮葉西番蓮Passiflora wilsonii Hemsl.，藥部位有全草、葉、根或者藤莖，分布于云南省東南至西南部地區(qū)、廣西、貴州，生于海拔1000～2500m的山坡、溝谷林下、路邊雜木林、土坡水溝邊、灌木叢中［1］。鍋鏟藤作為云南各少數(shù)民族地區(qū)常用的藥物，使用歷史悠久，在云南各地少數(shù)民族的醫(yī)藥文獻中均有記載。筆者通過實地走訪調(diào)查和查閱文獻資料［2-5］，發(fā)現(xiàn)在云南各州市地區(qū)的傣族、景頗族、彝族等少數(shù)民族的民間醫(yī)生均有使用鍋鏟藤的民間驗方，用于治療黃疸型肝炎、肝腹水、腎炎、腎虛陽痿、月經(jīng)不調(diào)、風濕麻木等疾病。在《云南中草藥選》記載：“具有燥濕，止血，消炎，生肌。治風濕腰痛，肝炎，肝硬化，腫瘤，跌打損傷，骨折。”［6］近年有研究［7］證實，鐮葉西番蓮地上部分水提取物對乙醇誘導小鼠急性肝損傷具有保護作用。鍋鏟藤藥材曾收載于1996年版的《云南省藥品標準》［8］，但此版標準沒有正式對外執(zhí)行，僅對鍋鏟藤藥材的性狀鑒別進行了規(guī)定。目前筆者未見國內(nèi)（外）有關(guān)鍋鏟藤藥材的生藥學鑒別方面的研究文獻報道。

鍋鏟藤在云南省民間應用廣泛，臨床效果好，但其文獻記載的基原植物形態(tài)、使用部分和藥材名稱并未統(tǒng)一，也沒有現(xiàn)行完善的質(zhì)量標準，加上野生資源近幾年急劇下降，生長范圍縮小，樣品采集困難，使其推廣應用受到限制。本實驗綜合文獻資料和實地走訪調(diào)查民間使用情況，確定鍋鏟藤基原植物為西番蓮科西番蓮屬植物鐮葉西番蓮Passiflora wilsonii Hemsl.，藥用部位為藤莖及葉，通過對基原植物的性狀鑒別、顯微鑒別和薄層鑒別研究，檢測鍋鏟藤藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、重金屬、農(nóng)藥殘留，建立其質(zhì)量標準，為民族藥的資源開發(fā)利用提供實驗依據(jù)，確保其臨床用藥的正確安全有效，也為其今后農(nóng)業(yè)種植和經(jīng)濟推廣該藥材打下堅實基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料 13份樣品均采自于云南地區(qū)（見表1），標本經(jīng)中科院昆明植物所楊文光副研究員鑒定為西番蓮科西番蓮屬植物鐮葉西番蓮Passiflora wilsonii Hemsl.。

1.2 儀器與試劑ICAPRQ ICPMAS儀（美國 ThermoFisher），Multiwave pro 消解儀（奧地利 安東帕），7890A氣相色譜儀（美國Agilent ），Nikon 80i 生物數(shù)碼攝影顯微鏡（日本Nikon），TP1020全自動組織脫水機（德國 Leica），LeicaRM2235輪轉(zhuǎn)切片機（德國 Leica），101A-2電熱干燥箱（寧波自動化儀表廠），SB-5200D超聲波清洗機（功率：360W；頻率：40KHz），F(xiàn)W177高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。高效硅膠G（青島海洋化工有限公司）；實驗所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 本品可全年采收。本品粗莖切成不規(guī)則段節(jié)。莖呈圓柱形或橢圓柱形，稍彎曲，直徑0.5～4cm，莖暗棕色，有明顯較深縱紋和皮孔，表面粗糙而帶鈍刺狀突起；體輕，質(zhì)硬，不易折斷，斷面不平坦，淡黃色，皮部窄，木部呈放射狀排列，有針尖大小的小孔（導管），髓部圓形而小。葉多破損，完整的葉形似鍋鏟，長3～8cm，寬5～12cm，紙質(zhì)，先端截形，略成三尖頭，葉的上端略平截而兩側(cè)角具銳尖，主脈5條，葉面具細網(wǎng)脈紋，背面葉脈及脈腋具短柔毛；葉柄長3～4cm，具腺體1枚。葉腋具細長的卷須。氣微，味甘、微苦。如圖1所示。

2.2 顯微鑒別 采用石蠟切片法［9］，取鐮葉西番蓮的藤莖及葉，切成一定規(guī)格，經(jīng) FAA 固定→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→脫蠟→染色→封藏→標注，制備植物組織石蠟切片。置顯微鏡下觀察。利用水合氯醛透化和稀甘油裝片法制作水裝片和透化片進行粉末顯微觀察、鑒定、描述。

2.2.1 藤莖橫切面 其最外層為木栓層，為數(shù)十層細胞，含有棕色物質(zhì)。皮層窄，為數(shù)列細胞，散在石細胞群。中柱鞘部位有為木化的纖維群，韌皮部篩管群明顯。形成層不連續(xù)成環(huán)，為一列細胞。木質(zhì)部發(fā)達，導管類圓形或類三角形，大多單個散在或數(shù)個相聚，呈放射狀排列，木射線明顯，為寬數(shù)十余列木薄壁細胞組成。髓部小，由細胞壁稍厚的薄壁細胞組成。薄壁細胞中含有較多的草酸鈣簇晶。如圖2、3所示。

2.2.2 葉（主脈）橫切面 上下表皮均為1列橫向延長的細胞，外被角質(zhì)層。非腺毛壁增厚，基部稍彎曲，含有棕色物質(zhì)。柵欄細胞2～3列，近長方形，過中脈，與海綿細胞分化不明顯。海綿組織細胞小，略呈長圓形，排列疏松。主脈維管束外韌型，上下兩側(cè)均有微木化的纖維束和厚壁組織。薄壁細胞中含有草酸鈣簇晶。如圖4、圖5所示。

2.2.3 粉末灰褐色 木栓細胞黃棕色，壁增厚。薄壁細胞為類長方形或類方形。石細胞多見，單個或數(shù)個成群，類方形、類圓形或不規(guī)則形，壁厚，孔溝明顯。導管主要為具緣紋孔導管，紋孔呈類橢圓，直徑27～83μm，可見螺紋導管。韌皮纖維，類長方形，非木化，紋孔較多。木纖維甚多，壁厚，直徑46～80μm。非腺毛為多細胞或單細胞，頂端漸尖。草酸鈣簇晶多見，棱角較鈍或銳尖，直徑8～25μm。棕色塊散在，形狀、大小及顏色深淺不一。 如圖6所示。

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 取13批鍋鏟藤藥材的藤莖粉末2.0 g（過三號篩），加乙酸乙酯50 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過。濾液水浴蒸干，殘渣加 1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。

2.3.2 薄層色譜條件 點樣量：供試品溶液各10 μL；薄層板：硅膠G板；展開系統(tǒng)：分別考察三氯甲烷-乙醚（8∶2）、三氯甲烷-石油醚（30～60 ℃）-甲酸（8∶2∶0.1）、甲苯-丙酮-甲酸（8∶2∶0.2）3種極性不同的展開劑進行上行展開；檢視方式：晾干，在365 nm紫外燈下檢視。

2.3.3 樣品測定結(jié)果 13個產(chǎn)地鍋鏟藤藤莖的提取液薄層色譜中，以甲苯-丙酮-甲酸（8∶2∶0.2）為展開系統(tǒng)較良好，薄層板顯明顯3個藍色的熒光主斑點。如圖7所示。

2.4 檢查水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物 按照2020年版《中國藥典》（四部）通則0832水分測定法第二法測定水分，通則2302灰分測定法測定總灰分和酸不溶性灰分，通則2201浸出物測定法測定醇溶性浸出物（浸出物方法考察以甲醇、無水乙醇、乙醇、70%乙醇和稀乙醇溶劑的熱浸法，結(jié)果以稀乙醇為溶劑提取最高，故選用稀乙醇為醇溶性浸出物溶劑），對13批鍋鏟藤每批樣品進行平行測定2次。結(jié)果顯示，6批鍋鏟藤藥材的水分測定值為8.92%～9.72%，平均值為9.33%；總灰分測定值為6.87%～7.81%，平均值為7.33%；酸不溶性灰分測定值為0.11%～0.30%，平均值為0.16%；醇溶性浸出物測定值為16.67%～18.92%，平均值為17.58%。結(jié)果見表2。

2.5 重金屬測定

2.5.1 試藥試劑 65 %硝酸［優(yōu)級純，默克化工技術(shù)（上海）有限公司］，超純水（德宏州食品藥品檢驗所實驗室提供）。 鉛（Pb）（批號：GSB-1742-2004； 濃度：1000 μg/mL）、鎘（Cd）（批號：GSB-1721-2004；濃度：1000 μg/mL）、砷（As）（批號：GSB-1714-2004 ；濃度：1000 μg/mL）、銅（Cu）（批號：GSB-1725-2004 ；濃度：1000 μg/mL）、汞（Hg）（批號：GSB-1729-2004 ；濃度：1000 μg/mL）、金（Au）（批號：GSB-1715-2004 ；濃度：1000 μg/mL）、鍺（Ge）（批號：GSB-1728-2004 ；濃度：1000 μg/mL）、銦（In）（批號：GSB-1731-2004 ；濃度：1000 μg/mL）、鉍（Bi（批號：GSB-1719-2004 ；濃度：1000 μg/mL）標準液均購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

2.5.2 方法 按照《中國藥典》2020版四部通則2321鉛、鎘、砷、汞、銅測定法電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定重金屬。

2.5.2.1 ICP-MS測定條件 功率：1200.00 W；冷卻氣體體積流量（氬氣）：15.00 L/min;輔助氣體積流量（氬氣）：1.00 L/min；霧化氣體積流量（氬氣）：1.00 L/min；采樣錐和截取錐：鎳；采樣深度：8.0 mm；測量方式：調(diào)峰模式；掃描次數(shù)：25；重復次數(shù)：3；采用STD模式；蠕動泵轉(zhuǎn)速：35 r/min。

2.5.2.2 混合內(nèi)標溶液制備 分別吸取Ge、In、Bi標準溶液0.1 mL于100 mL量瓶中，加入Au元素標準溶液0.1 mL，再加10%硝酸溶液定容至刻度，即為濃度1 μg/mL混合內(nèi)標溶液。按照《中國藥典》2020版四部通則2321方法，以Ge為內(nèi)標物測定PAs、Cu元素，以In為內(nèi)標物Cd元素，以Bi為內(nèi)標物測定Pb、Hg元素。

2.5.2.3 線性關(guān)系考察 分別吸取Pb、Cd、As、Cu、Hg標準溶液0.1 mL置于100 mL量瓶中，加超純水定容，配置呈濃度1 μg/mL 的混合標準溶液貯備液。分別吸取貯備液為0 μL、5 μL、10 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL、1000 μL置于100 mL量瓶中，各加入1 mL混合內(nèi)標溶液，再加10%硝酸溶液定容，即得到0 μg/L、0.05 μg/L、0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2.5 μg/L、5 μg/L、10 μg/L混合標準品溶液。分別進樣測定Pb、Cd、As、Cu、Hg元素。以待測元素與對應的內(nèi)標元素信號值之比對元素質(zhì)量濃度進行線性回歸，得到回歸方程（見表3）。結(jié)果表明，5種重金屬元素在0～10 μg/L線性關(guān)系良好。

2.5.2.4 供試品溶液制備 精密稱取0.25 g樣品（過三號篩）于聚四氟乙烯高壓微波消解罐中，依次加入65%硝酸8 mL，放置加熱（80 ℃）預消解2 h，在放置于微波消解儀中，用2步梯度升溫法消解（30 min內(nèi)溫度由室溫升至160 ℃，保持15 min；在于5 min內(nèi)升至200 ℃，保持15 min）。然后，逐漸冷卻至55 ℃。消解液冷卻至室溫，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，轉(zhuǎn)至25 mL量瓶中，加入1 mL混合內(nèi)標溶液，再加超純水定容至刻度，搖勻，即可。

2.5.2.5 空白對照溶液的制備 除不加鍋鏟藤樣品外，其余制備方法與供試品溶液制備方法相同，制成空白對照溶液。

2.5.2.6 方法學考察 精密度試驗：取混合標準品溶液連續(xù)進樣6次，測定5種元素的量，進行計算，Pb、Cd、As、Cu、Hg的RSD分別為2.12%、1.85%、1.03%、1.27%、4.32%。表明儀器的精密度良好。

重復性試驗：取同一批號鍋鏟藤樣品6份，制備成供試品溶液，測定5種重金屬元素。得到Pb、Cd、As、Cu、Hg的RSD%分別為3.12%、1.65%、2.53%、2.83%、4.92%。表明方法的重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批號鍋鏟藤樣品，在測定條件下，分別于在樣品制備后0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、36 h進樣，測定5種重金屬元素的量。結(jié)果顯示，Pb、Cd、As、Cu、Hg的RSD分別為1.87%、2.33%、2.79%、3.02%、7.84%。除了Hg元素，其他4種重金屬元素在制備36 h內(nèi)各元素是穩(wěn)定的。

檢驗限測定：吸取10 mL稀釋溶液（10%硝酸溶液），在相同的方法條件下測定，重復6次測定稀釋溶液。以某元素測定結(jié)果標準偏差的3倍值（3δ）除以該元素回歸方程的斜率（k），即為該元素的檢測限。Pb、Cd、As、Cu、Hg的檢測限分別為0.159 μg/L、0.753 μg/L、0.792 μg/L、0.013 μg/L、0.133 μg/L、0.127 μg/L。

樣品測定：按照供試品制備方法，測定供試品溶液中5中重金屬元素的量，再扣除空白對照溶液的各元素的量，得到鍋鏟藤樣品中5種重金屬的量。每一批號鍋鏟藤進行了2次平行試驗，取平均值計算，即得到13份鍋鏟藤樣品5種重金屬的量。測定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，批號為20190421的樣品測定的Pb、Cu兩個元素量高于標準［9］規(guī)定，其他批號的鍋鏟藤樣品均在限制之內(nèi)。

根據(jù)2001年我國對外貿(mào)易經(jīng)濟合作部頒布的《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》對藥用植物原料、飲片等的限量標準［10］，為鉛（Pb）≤5.0 mg/kg；鎘（Cd）≤0.3 mg/kg；砷（As）≤2.0 mg/kg；汞（Hg）≤0.2 mg/kg；銅（Cu）≤20.0 mg/kg。結(jié)果，批號為20190421的樣品中鉛、銅元素超標，其余批號的重金屬元素的量均符合標準，說明不同產(chǎn)地的鍋鏟藤中5種重金屬元素有明顯差異。

2.6 農(nóng)藥殘留測定 取鍋鏟藤藥材樣品，按照《中國藥典》［11］2020版四部通則2341農(nóng)藥殘留量測定法第一法測定農(nóng)藥殘留，檢測結(jié)果：六六六 /（μg/kg）；滴滴涕 /（μg/kg）；五氯硝基苯 /（μg/kg），測定農(nóng)藥殘留量均低于檢出限，為0.0000 mg/kg，農(nóng)藥殘留符合其要求。

3 討論

本研究對鍋鏟藤進行較全面的生藥學研究，篩選出各類具有鑒別意義的特征，如鍋鏟藤性狀鑒別特征為莖呈圓柱形或橢圓柱形，表面粗糙而帶鈍刺狀突起；體輕，質(zhì)硬，不易折斷，皮部窄，木部呈放射狀排列，有針尖大小的小孔（導管），髓部圓形而小。葉多破損，完整的葉形似鍋鏟，紙質(zhì)，先端截形，葉腋具細長的卷須。顯微特征為藤莖橫切面最外層為木栓層。皮層窄，散在石細胞群。中柱鞘部位有為木化的纖維群，韌皮部篩管群明顯。木質(zhì)部發(fā)達，導管類圓形或類三角形，呈放射狀排列，木射線明顯。髓部小。薄壁細胞中含有較多的草酸鈣簇晶。葉橫切面上下表皮均為1列橫向延長的細胞，外被角質(zhì)層。主脈維管束外韌型，上下兩側(cè)均有微木化的纖維束和厚壁組織。薄壁細胞中含有草酸鈣簇晶。粉末多見石細胞、木栓細胞、韌皮纖維、木纖維、薄壁細胞、棕色塊、非腺毛、草酸鈣簇晶，導管主要為具緣紋孔導管。

在薄層色譜鑒別項，結(jié)果表明，13個產(chǎn)地鍋鏟藤藤莖的提取液，以甲苯-丙酮-甲酸（8∶2∶0.2）為展開系統(tǒng)較良好，薄層板顯明顯3個藍色的主斑點，分離良好，斑點清晰，且具有較好的重現(xiàn)性。在重金屬測定檢查項目，僅有批號為20190421的鍋鏟藤樣品測定的Pb、Cu兩個元素超標，可能與藥材的生長環(huán)境、采樣加工等因素有一定相關(guān)性，具體原因仍需要有關(guān)學者進一步研究其確切原因。在農(nóng)藥殘留測定檢查項目，13批樣品均未檢出（低于檢出限），說明鍋鏟藤藥材的安全性控制指標符合要求，可以較好保障臨床安全使用。

鍋鏟藤藥材為民間常用藥，但該藥材質(zhì)量標準尚屬空白，制約其推廣和臨床應用。余繼華等［12］從云南產(chǎn)地的鐮葉西番蓮藤莖中可分離得到6個化合物。李干鵬［13］在其博士學位論文《五種云南藥用植物化學成分研究》中發(fā)表鐮葉西番蓮藤莖中可分離得到14個化合物，主要是三萜和甾體類的化合物。本課題通過對鍋鏟藤藥材基原植物鑒定、性狀鑒別、顯微鑒別和薄層色譜鑒別的研究，測定其水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇浸出物、重金屬、農(nóng)藥殘留，能較好的鑒別該藥材，可為鍋鏟藤鑒別和藥材質(zhì)量標準的制訂提供參考依據(jù)，同時也為鍋鏟藤的綜合開發(fā)利用的相關(guān)研究奠定了生藥學基礎(chǔ)，這些研究結(jié)果對于日后擴大鍋鏟藤藥用資源、臨床用藥和新藥開發(fā)方面具有重要意義。本研究中所用的樣品大多數(shù)為野生品種，生長環(huán)境為高山叢林，存在采樣難度大的問題，故樣品批數(shù)數(shù)量較少，后續(xù)本課題組將繼續(xù)采集其他不同產(chǎn)地、不同年限的樣品進行研究，以建立更加完善的藥材質(zhì)量標準。

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（收稿日期：2022-09-06 編輯：陶希睿）