賀蘭山東麓老葡萄園卷葉病田間危害調查及分子檢測

黃強，張強強，顧沛雯

（寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021）

葡萄病毒病是制約葡萄產業(yè)健康發(fā)展的主要因素，葡萄卷葉?。℅rapevine leafroll disease，GLD）是造成嚴重經(jīng)濟損失的系統(tǒng)性病毒病害之一[1]。在我國，卷葉病分布較廣，凡有葡萄栽培的地區(qū)都有該病的存在，其中北京、河北、天津、山東和寧夏發(fā)生較重[2]。該病病原是葡萄卷葉伴隨病毒（Grapevine leafroll-associated viruses，GLRaVs）。迄今為止，全世界已報道了6種葡萄卷葉伴隨病毒，分別為GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4（包括GLRaV-4的變種GLRaV-5、GLRaV-6、GLRaV-9、GLRaV-Pr、GLRaVDe、GLRaV-Car）、GLRaV-7和GLRaV-13，均屬于長線病毒科（Closterovoridae）[3-5]。

葡萄卷葉病的典型癥狀是葡萄樹體感染病毒后，下部葉片先表現(xiàn)癥狀，葉片向下翻卷，并逐漸向上部葉片擴展，因卷縮而發(fā)脆。Maree等[6]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄植株感染卷葉伴隨病毒后，樹勢會受到嚴重影響，植株壽命顯著縮短。徐美隆等[7]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄植株在感染卷葉伴隨病毒后，其葉片組織中的葉綠素含量減少，感病植株光合速率明顯減弱。劉萬好等[8]通過檢測感染卷葉病的‘蛇龍珠’葡萄成熟果實理化指標發(fā)現(xiàn)，其還原糖含量比正常植株最多降低24.05%，含酸量是正常植株的1.4倍。目前，葡萄卷葉病無法通過化學藥劑進行有效控制，防治方法主要通過栽植脫毒苗木。隨著葡萄種植年限的增加，老園感病率和感病程度正逐年提高，因此建立高效準確的檢測方法，是早期診斷和防治葡萄卷葉病的關鍵措施。

近幾年，常用于檢測GLRaVs的方法有：生物學方法、血清學方法、免疫電鏡、雙鏈RNA分析、標記探針雜交和RT-PCR（逆轉錄聚合酶鏈式反應）等[9]，其中，生產實際環(huán)節(jié)中應用最為廣泛的是RT-PCR技術。李晨等[10]利用RT-PCR方法對6個葡萄品種進行了14種葡萄病毒的檢測，共檢測出13種葡萄病毒，其中分布較廣的為沙地葡萄莖痘相關病毒（GRSPaV）、葡萄斑點病毒（GFkV）和葡萄卷葉伴隨病毒3（GLRaV-3）。呂苗苗等[11]采用RT-PCR方法，對賀蘭山東麓地區(qū)40份樣品進行GLRaV-1～GLRaV-5這5種葡萄卷葉伴隨病毒的檢測，共檢出3種病毒類型，其中GLRaV-3的檢出率最高，為87.5%。葡萄卷葉伴隨病毒為RNA病毒，由于其在自我復制過程中缺乏矯正機制，極易發(fā)生變異[12]，顧沛雯等[13]對寧夏地區(qū)的釀酒葡萄進行了RT-PCR檢測，經(jīng)基因同源性比對研究，發(fā)現(xiàn)GLRaV-3寧夏分離物的CP基因可能存在分子變異。且有大量研究表明葡萄病毒可以通過介體昆蟲如粉虱、葉蟬和蚜蟲等傳播，進而進一步擴大危害范圍，因此有必要重新對不同地區(qū)釀酒葡萄卷葉病進行全面的調查和檢測，這對指導該地區(qū)葡萄卷葉病的早期監(jiān)測和防控具有重要意義。

本研究通過對賀蘭山東麓地區(qū)老葡萄園釀酒葡萄卷葉病的調查及檢測，旨在明確賀蘭山東麓地區(qū)釀酒葡萄卷葉伴隨病毒的攜帶狀況，并對目前當?shù)刂髟葬劸破咸哑贩N健康狀況進行綜合評估，為寧夏釀酒葡萄病毒病的早期診斷和建立葡萄脫毒苗繁育技術體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

供試品種為‘蛇龍珠’‘美樂’‘赤霞珠’‘貴人香’和‘霞多麗’5個品種，樹齡均在10年以上。上述供試品種分別采自賀蘭山東麓4個種植區(qū)代表性葡萄園，其中石嘴山種植區(qū)選擇賀東莊園，銀川種植區(qū)選擇新牛酒莊和志輝源石酒莊，永寧種植區(qū)選擇立蘭酒莊和西夏王酒莊，青銅峽種植區(qū)選擇西鴿酒莊。

1.1.2 主要儀器與試劑

Simpli Nano超微量分光光度計（GE Healthcare公司，美國）；C200全自動凝膠成像儀（Azure Biosystems 公司，美國）；T100TM PCR儀（Biorad公司，美國）；DYY-6C電泳儀（北京六一廠，中國）；3K15冷凍離心機（Sigma公司，美國）；LE204E電子分析天平（Mettler-toledo公司，瑞士）。

RNA提取試劑盒（Kit R6827，Omeg公司，美國）反轉錄試劑盒（EasyScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal），北京全式金生物有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 田間危害調查

2021年6—9月，對賀蘭山東麓4個種植區(qū)6個酒莊的5個主栽釀酒葡萄品種進行葡萄卷葉病的田間自然發(fā)病情況調查，并記錄其危害癥狀。每個葡萄園每品種選擇一塊樣地，每樣地隨機選取10行，每行隨機選取3個小區(qū)，每個小區(qū)范圍是2個架桿間的葡萄植株，區(qū)間內進行逐行逐株調查發(fā)病情況。按呂苗苗等[11]的方法對植株發(fā)病嚴重程度進行分級，計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

嚴重度按5級標準進行分級：0-無癥狀；1-僅在枝條基部老葉上有輕微卷葉病癥狀；2-植株有1/3以下的葉片有卷葉病的癥狀；3-植株上有1/3～1/2的葉片有卷葉病癥狀；4-植株上有1/2以上的葉片有卷葉病癥狀[11]。

發(fā)病率（%）=(病株數(shù)/調查總株數(shù))×100

病情指數(shù)＝∑(各級病株數(shù)×該病級值)/(調查總株數(shù)×最高級值)×100

1.2.2 RT-PCR樣品采集方法

每個品種在設置的小區(qū)內，隨機選擇單株進行葉片采集。具體操作為每單株分上、中、下部各取1片葉，迅速用錫箔紙包好，作為一個樣品。標記好采集地點、品種等信息，置于液氮罐中，帶回實驗室置于-80 ℃冰箱中保存，備用。共計92份樣品。

1.2.3 RNA提取及cDNA的合成和PCR檢測

在樣品中加入液氮并迅速研磨至粉末狀，轉移100 mg粉末到1.5 mL的離心管中，使用Plant RNA Kit R6827試劑盒進行總RNA的提取。將提取出的總RNA使用EasyScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒反轉錄成cDNA，采用表1中的特異性引物對樣品中的病毒進行檢測。PCR擴增反應體系（25 μL）：Max Taq酶12 μL，上、下游引物各1 μL，RNase-free Water 9 μL，cDNA 2 μL；PCR擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 3 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。PCR產物由測序公司進行測序。

表1 RT-PCR所用引物Table 1 Primers used in RT-PCR

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2019與SPSS 20.0對92份樣品檢測結果進行分析整理，計算發(fā)病率和病情指數(shù)。從GenBank中獲得3種卷葉伴隨病毒不同地理來源的基因序列（表2），利用Mega 7.0軟件對測序結果進行多重比對，分析不同毒株分離物間的核酸序列相似性并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

表2 用于構建系統(tǒng)發(fā)育樹的參比序列Table 2 Reference sequences used to construct phylogenetic trees

2 結果與分析

2.1 老葡萄園卷葉病的田間癥狀

賀蘭山東麓釀酒葡萄卷葉病于7月上旬開始，田間陸續(xù)可見發(fā)病癥狀，前期癥狀表現(xiàn)為植株葉片葉緣輕微反卷（圖1 A）。不同釀酒葡萄品種感染卷葉伴隨病毒后，表現(xiàn)出的癥狀不同。隨著葡萄生長，紅色品種感病植株葉片開始出現(xiàn)大小不等的紅斑，葉片反卷幅度加重，葉肉開始逐漸加厚。葡萄成熟以后，感病癥狀最為明顯，表現(xiàn)為植株葉片各紅斑連接面積擴大，葉脈保持綠色，葉片反卷皺縮（圖1 B）。白色品種感病植株前期癥狀與紅色品種相同，但后期葉片向后反卷并未變紅，葉片組織葉綠素含量變低，表現(xiàn)出褪綠黃化的癥狀（圖1 C）。紅色和白色品種感染卷葉伴隨病毒后，植株果實發(fā)育不良，果粒變小，著色不明顯（圖1 D）。

圖1 老葡萄園釀酒葡萄品種卷葉病癥狀Figure 1 Symptoms of leafroll-associated disease of wine grape varieties

2.2 老葡萄園釀酒葡萄卷葉病感病狀況

2.2.1 不同種植地區(qū)發(fā)病情況差異

由表3可知，永寧種植區(qū)的發(fā)病程度最重，其次是青銅峽種植區(qū)，銀川種植區(qū)發(fā)病程度最輕。在4個種植區(qū)的6個酒莊葡萄園中，西夏王酒莊葡萄園發(fā)病最嚴重，平均發(fā)病率和病情指數(shù)顯著高于其他酒莊，分別為66.43%和41.43；其次是新牛酒莊葡萄園，平均發(fā)病率和病情指數(shù)分別為42.72%和22.1。志輝源石葡萄園發(fā)病程度最輕，平均發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于其他酒莊的葡萄園，分別為5.64%和1.89。說明賀蘭山東麓不同種植地區(qū)葡萄卷葉病的發(fā)病率與發(fā)病程度有很明顯的差異。

表3 賀蘭山東麓不同種植區(qū)老葡萄園釀酒葡萄卷葉病田間自然發(fā)病情況Table 3 Natural incidence investigation in different planting areas of old vineyard with grapevine leafroll-associated disease in the east foot of Helan Mountains

2.2.2 不同品種間發(fā)病情況差異

由表4可知，不同品種的發(fā)病率和發(fā)病程度各有差異。其中‘蛇龍珠’發(fā)病最為嚴重，其平均發(fā)病率和病情指數(shù)都顯著高于其它品種，分別為70.47%和43.32?！罉贰沃淦骄l(fā)病率和病情指數(shù)分別為37.67%和20.59；‘霞多麗’發(fā)病程度最輕，其平均發(fā)病率和病情指數(shù)分別為20.62%和9.16，顯著低于其他品種。說明‘蛇龍珠’和‘美樂’屬卷葉病易感品種。

表4 賀蘭山東麓不同釀酒葡萄品種間葡萄卷葉病自然發(fā)病情況Table 4 Natural incidence investigation of different wine grape varieties grapevine leafroll-associated disease in the east foot of Helan Mountains

2.3 釀酒葡萄卷葉伴隨病毒RT-PCR檢測

2.3.1 RT-PCR檢測結果

92份樣品中檢測到3種卷葉伴隨病毒。由表5可知，分別為GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-3，其中GLRaV-3的平均檢出率最高，為70.17%。5個品種均檢測到GLRaV-1和GLRaV-3?！啐堉椤蠫LRaV-1平均檢出率最高，為75.00%；其次是‘美樂’，為66.67%；‘貴人香’和‘霞多麗’GLRaV-1的檢出率最低，均為50.00%。‘赤霞珠’‘美樂’和‘貴人香’均檢測到了GLRaV-2，其中‘貴人香’GLRaV-2的檢出率最高，為41.67%；其次是‘赤霞珠’，檢出率為25.00%；‘美樂’GLRaV-2的檢出率最低，為16.67%?！啐堉椤疓LRaV-3的檢出率最高，為83.33%；其次是‘赤霞珠’，為79.17%；‘霞多麗’的檢出率最低，為55.00%。此外，5個品種GLRaV-3的檢出率均大于50.00%。

表5 葡萄卷葉伴隨病毒RT-PCR檢出率Table 5 RT-PCR detection rate with grape leafroll-associated virus %

在5個釀酒葡萄品種中發(fā)現(xiàn)，‘蛇龍珠’和‘霞多麗’兩品種存在二重復合侵染現(xiàn)象，其中‘蛇龍珠’二重復合侵染率最高，為83.33%；‘貴人香’‘美樂’和‘赤霞珠’3個品種存在三重復合侵染現(xiàn)象，其中‘貴人香’的三重復合侵染率最高，為33.33%；‘赤霞珠’三重復合侵染率最低，為16.67%。綜合來看，‘蛇龍珠’GLRaVs的檢出率是5個品種中最高的，即在所有調查的品種中，‘蛇龍珠’是卷葉伴隨病毒主要侵害的釀酒葡萄品種。

2.3.2 RT-PCR產物測序結果分析

92份樣品中，共獲得了12個不同來源的GLRaV-1陽性分離物，由圖3所示。經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，樣品新牛-蛇龍珠、西夏王-蛇龍珠、西鴿-霞多麗、西夏王-赤霞珠、西鴿-赤霞珠、志輝-美樂、賀東-美樂，與樣品西鴿-蛇龍珠分離的毒株序列相似，聚在了同一分支，而上述8個樣品與樣品新牛-美樂分離的毒株序列相似，聚在了同一分支，它們與來自加拿大的GLRaV-1HSP基因分離物（登錄號：MH807217）相似度高，同源率為98.6%；樣品志輝-貴人香分離的毒株與來自加拿大的另一種GLRaV-1HSP基因分離物（登錄號：MH807220）聚在了同一分支，同源率為96.7%。樣品新牛-貴人香分離的毒株與來自匈牙利的GLRaV-1HSP基因分離物（登錄號：MF677861）聚在了同一分支，同源率為98.3%。樣品新牛-霞多麗與來自土耳其的GLRaV-1HSP基因分離物（登錄號：KU362239）聚在了同一分支，同源率為95.3%。上述12個樣品與來自法國的GLRaV-1HSP基因分離物（登錄號：MG925331）相似度高，同源率為90.3%（圖3）。

圖3 GLRaV-1 HSP基因的RT-PCR檢測Figure 3 RT-PCR detection of GLRaV-1 HSP

試驗共獲得了4個不同來源的GLRaV-2陽性分離物。經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，樣品賀東-美樂、立蘭-美樂、西夏王-赤霞珠、志輝-貴人香與葡萄牙GLRaV-2CP基因分離物（登錄號：KM012097）分離的毒株序列相似度高，聚在了同一分支，同源率為99.4%（圖4）。

圖4 GLRaV-2 CP基因的RT-PCR檢測Figure 4 RT-PCR detection of GLRaV-2 CP

92份樣品共獲得了11個不同來源的GLRaV-3陽性分離物。經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，樣品志輝-貴人香、西夏王-赤霞珠分離的毒株與來自意大利GLRaV-3CP基因分離物（登錄號：MT432385）聚在了同一分支，同源率為99.4%；樣品西夏王-赤霞珠分離的毒株與來自巴西GLRaV-3CP基因分離物（登錄號：KJ704369）聚在了同一分支，同源率為98.9%；樣品西鴿-赤霞珠分離的毒株與來自希臘GLRaV-3CP基因分離物（登錄號：LR215339）聚在了同一分支，同源率為99.1%；樣品新牛-蛇龍珠分離的毒株與來自中國北京GLRaV-3CP基因分離物（登錄號：KC477138）聚在了同一分支，同源率為99.0%；樣品賀東-赤霞珠和立蘭-赤霞珠分離的毒株與來自南非GLRaV-3CP基因分離物（登錄號：JQ655295）聚在了同一分支，但進化分支長度較長，同源率為95.1%（圖5）。

圖5 GLRaV-3 CP基因的RT-PCR檢測Figure 5 RT-PCR detection of GLRaV-3 CP

3 討論與結論

該研究調查了賀蘭山東麓4個種植區(qū)的釀酒葡萄感染卷葉伴隨病毒的類型和卷葉病染病情況。在賀蘭山東麓的主要釀酒葡萄品種中，‘蛇龍珠’‘美樂’‘霞多麗’等品種均有感染卷葉病的情況發(fā)生。其中西夏王酒莊的發(fā)病率和病情指數(shù)均較高，志輝酒莊的最低，其他酒莊葡萄園發(fā)病率和發(fā)病嚴重程度也各有差異，分析認為可能是由于葡萄園早期引進與栽植的種苗檢疫手段缺乏或不完善造成的。其次，在所有調查的品種中，‘蛇龍珠’的平均發(fā)病率最高，‘霞多麗’的平均發(fā)病率最低。其他釀酒葡萄品種發(fā)病率和發(fā)病嚴重程度也各有差異，可能與不同品種對卷葉病的抗病差異性有關。

該研究對賀蘭山東麓釀酒葡萄進行了6種GLRaVs（GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4、GLRaV-7、GLRaV-13）的RT-PCR檢測，檢測出3種卷葉伴隨病毒，分別為GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-3，其中GLRaV-3的檢出率最高，這與呂苗苗等[11]的調查結果相一致。本研究在5個釀酒葡萄品種上均檢測出不同的卷葉伴隨病毒，‘蛇龍珠’和‘霞多麗’品種存在GLRaV-1和GLRaV-3兩種卷葉伴隨病毒的復合侵染，‘赤霞珠’‘美樂’和‘貴人香’存在GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-3三種卷葉伴隨病毒的復合侵染。分析認為，這可能是由于寧夏釀酒葡萄在發(fā)展初期葡萄病毒檢測體系尚不健全的情況下，大量引進砧木與歐亞種葡萄品種進行嫁接，帶毒苗木進入葡萄園所導致。此外，病毒長期的積累，加上葉蟬、粉蚧等昆蟲的傳播，也是造成老葡萄園出現(xiàn)嚴重卷葉伴隨病毒復合侵染的原因之一。

GLRaV-1和GLRaV-3分離株系存在明顯變異，李文學等[20]對寧夏不同葡萄品種GLRaV-1和GLRaV-3CP基因分離物進行單鏈構象多態(tài)性（SSCP）技術和聚類分析發(fā)現(xiàn)，GLRaV-1和GLRaV-3均存在兩種變異類群。Turturo等[21]利用SSCP技術對45個葡萄樣品GLRaV-3CP基因變異的研究發(fā)現(xiàn)，GLRaV-3CP基因的變異幾率較大。本研究發(fā)現(xiàn)，12個不同來源的GLRaV-1HSP基因陽性分離物與來自加拿大的GLRaV-1HSP基因分離物、來自匈牙利的GLRaV-1HSP基因分離物、來自土耳其的GLRaV-1HSP基因分離物相似度高，該基因的核苷酸序列一致性為90.3%～98.6%；此外，在3個不同品種上均檢測到了GLRaV-2，4個不同來源樣品的GLRaV-2CP基因陽性分離物與來自葡萄牙GLRaV-2CP的基因分離物相似度高，同源率為99.4%，尚未發(fā)現(xiàn)該基因有明顯差異；在11個不同來源樣品的GLRaV-3CP基因陽性分離物中，樣品賀東-赤霞珠和立蘭-赤霞珠分離的毒株與南非GLRaV-3CP基因分離物的同源率為95.1%，這三種毒株進化分支長度較長，且同源率低。GLRaV-1HSP基因與GLRaV-3CP基因在系統(tǒng)發(fā)育樹上明顯分化為多個分支，分析認為，GLRaV-1HSP基因與GLRaV-3CP基因可能存在變異并分別分化出了多種不同的株系。上述結果表明，賀蘭山東麓產區(qū)不同釀酒葡萄品種所感染的GLRaVs中，GLRaV-1HSP基因與GLRaV-3CP基因存在差異和變異，具體存在哪種形式變異還尚待研究。

目前，葡萄病毒病無法利用化學藥劑進行有效控制，主要通過栽植脫毒苗、防治傳毒介體和加強栽培管理等方法進行防治，其中栽植脫毒苗木是最經(jīng)濟有效的方法，嫁接時也應采用無毒的砧木和接穗[22]。國內葡萄苗木脫毒方法有使用莖尖培養(yǎng)脫毒、熱處理與莖尖培養(yǎng)相結合脫毒、化學療法與莖尖培養(yǎng)相結合脫毒和莖尖超低溫療法脫毒。此外葡萄園里的粉蚧、蚜蟲和薊馬等昆蟲可傳播葡萄病毒[23]。在生產上應抓住這些傳毒介體的關鍵防治時期，加強傳毒介體的防治，防止病毒的傳播蔓延。同時加強水肥管理、合理負載，增強樹勢，提高樹體抵抗力，在每年夏秋季對葡萄園調查兩次，若發(fā)現(xiàn)嚴重發(fā)病的病株，應及時刨除。修剪時也應注意果枝剪的消毒，防止病毒通過果枝剪上殘留的汁液進行傳播。