‘陽光玫瑰’葡萄銹果品質(zhì)及顯微結(jié)構(gòu)分析

黃艷，劉芳，黃科文，劉磊，梁東，王進(jìn)，陳洪艷，呂秀蘭*

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬研究所，四川成都 611130；2. 成都市農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所，四川成都 611130；3. 樂山師范學(xué)院，四川樂山 614000；4. 瀘定縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣和土壤肥料站，四川瀘定 626100）

果銹是指在果實(shí)發(fā)育過程中果實(shí)表面出現(xiàn)的黃褐色斑痕，是果實(shí)成熟時(shí)的一種生理紊亂現(xiàn)象，在多種果樹中均有發(fā)生，如蘋果、枇杷、梨和葡萄等[1-4]。果銹的產(chǎn)生是內(nèi)、外多種因素共同作用引起的。李健花等[5]認(rèn)為，‘金冠’蘋果角質(zhì)膜破裂與果銹產(chǎn)生密切相關(guān)，由于果實(shí)表皮細(xì)胞角質(zhì)層破裂，使木栓化程度加深，導(dǎo)致表皮細(xì)胞及皮層細(xì)胞死亡。在梨果銹的形成過程中，其表面角質(zhì)膜的變化與‘金冠’蘋果十分相似[6]。進(jìn)一步利用掃描電鏡觀察沙梨表皮發(fā)現(xiàn)，有銹部位的果皮角質(zhì)膜發(fā)生龜裂，在沒有角質(zhì)膜保護(hù)的情況下，表皮細(xì)胞裸露部位的細(xì)胞壁次生加厚[7]。研究發(fā)現(xiàn)，‘銹酥’果皮中的木質(zhì)素含量顯著高于‘碭山酥梨’果皮中的木質(zhì)素含量，表明木質(zhì)素的積累可能與果銹的產(chǎn)生有關(guān)[8]。

馮嬌[9]認(rèn)為，葡萄園內(nèi)空氣濕度過大，不僅影響‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)表皮角質(zhì)層和蠟質(zhì)層的形成，還會導(dǎo)致角質(zhì)層產(chǎn)生龜裂，促進(jìn)果銹產(chǎn)生。婁玉穗等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在‘陽光玫瑰’的果實(shí)表面常形成條狀或不規(guī)則狀銹斑，嚴(yán)重時(shí)連成片，致使果實(shí)表皮形成木栓化組織，產(chǎn)生銹果[10]。對黃綠色葡萄品種的果銹發(fā)生情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一般情況下歐亞種比歐美雜交種更易產(chǎn)生果銹；而對歐亞種的調(diào)查顯示，薄皮品種與厚皮品種相比更易產(chǎn)生果銹，如‘無核白雞心’‘黃金指’和‘京玉’較易產(chǎn)生果銹[11]。針對‘陽光玫瑰’的研究結(jié)果表明，果銹的生成與多酚化合物及其氧化反應(yīng)有關(guān)[12-14]。

眾所周知，結(jié)構(gòu)決定著功能，因此果銹的產(chǎn)生與果實(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化具有相關(guān)性。目前，關(guān)于果銹與葡萄果實(shí)結(jié)構(gòu)變化相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究系統(tǒng)分析了‘陽光玫瑰’葡萄有銹果果皮的顯微結(jié)構(gòu)及果實(shí)品質(zhì)，為‘陽光玫瑰’葡萄提質(zhì)增效提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地（30°33'46"N，103°39'36"E）葡萄園進(jìn)行。以4年生的‘陽光玫瑰’葡萄為試材，株行距為1.5 m×3 m，Y形整形，避雨雙膜覆蓋栽培。試驗(yàn)園土壤為砂質(zhì)壤土，常規(guī)管理。

1.2 果實(shí)理化指標(biāo)測定

1.2.1 果實(shí)外觀及基本理化指標(biāo)的測定

于2019年8月中旬果實(shí)成熟時(shí)進(jìn)行采樣。從葡萄園內(nèi)選擇10株樹勢一致、無病蟲害、生長健壯的4年生‘陽光玫瑰’葡萄，從每株樹上采集部位相近的無果銹（果銹面積=0）和有果銹（果銹面積＞25%）的果實(shí)各10粒，共200粒，快速放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。使用色差儀對果皮顏色進(jìn)行測定，L*表示顏色亮度，a*和b*表示顏色組成，a*值從負(fù)增加到正，顏色由綠變紅，而b*值由負(fù)增加到正，顏色由藍(lán)變黃。使用百分之一電子天平測定粒質(zhì)量；用電子游標(biāo)卡尺測量橫縱徑，計(jì)算果形指數(shù)；采用手持式糖度計(jì)測定可溶性固形物含量；用酸堿中和滴定法測定可滴定酸含量；用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[15]；木質(zhì)素含量采用試劑盒測定（蘇州格銳思生物科技有限公司，G0708F）。

1.2.2 果實(shí)糖組分的測定

果實(shí)糖組分提取與測定參照胡志群、Chen等[16-17]的方法，并略有修改。將冷凍的葡萄果皮和果肉樣品分別在液氮中磨成粉末狀，精確稱取1.0 g，加入4 mL超純水，80 ℃水浴15 min，9000 r·min-1，4 ℃離心15 min，取上清液，轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶。重復(fù)上述步驟再次提取上清液，超純水定容到10 mL，獲得糖組分提取樣液。合并兩次提取液，抽取1 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后以備上機(jī)分析。每個(gè)樣品均重復(fù)3次。糖檢測使用的色譜柱為Thermo，0.5 μm NH2柱，檢測器RID，以乙腈∶水=8∶2為流動相，流速為0.5 mL·min-1，等度洗脫，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。根據(jù)吸光度值和標(biāo)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

果糖：y＝226229x－958.57（R2＝0.9991）

葡萄糖：y＝194780x＋25802（R2＝0.9990）

蔗糖：y＝201205x＋7113.3（R2＝0.9999）

上述公式中，x為標(biāo)品濃度，y為吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算樣品中果糖、葡萄糖和蔗糖含量。

1.2.3 酚類物質(zhì)（類黃酮類）測定

酚類物質(zhì)的提取參考嚴(yán)娟等[18]的方法。提取液為70%的甲醇內(nèi)含2%的甲酸。稱取‘陽光玫瑰’葡萄果皮0.2 g，加2 mL提取液在0 ℃下研磨提取，然后轉(zhuǎn)移到離心管中，再加3 mL提取液沖洗研缽后，并入離心管。超聲浸提30 min；隨后在搖床30 ℃下250 r·min-1震蕩2 h，充分提取。8000 r·min-1離心10 min，上清液用0.45 μm的針管濾膜過濾后4 ℃保存，待用?？偡雍康臏y定使用Folin-Ciocalteu方法，總黃酮含量參考Wang等[19]的方法，總黃烷醇含量參考Fang等[20]的方法，總黃酮醇含量參考Miliauskas等[21]的方法。

1.2.4 酚組分的測定

參考黃勝佳等[22]的方法，略有修改。從-80 ℃冰箱中取出果皮和果肉樣品，將其敲碎后混勻，分別取果皮和果肉至研缽中，加入液氮研磨成粉末后，準(zhǔn)確稱取0.5 g混合樣放入5 mL離心管中，避光條件下加入1.5 mL提取液，充分混勻。將離心管放入超聲裝置中輔助提取30 min后，在4 ℃、5 000 r·min-1條件下離心15 min，吸取上清液。用0.45 μm微孔濾膜過濾，貯存于-20 ℃冰箱中，用于酚的分析。使用安捷倫1260液相色譜儀，Comatex C18色譜柱，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。流動相A為2%甲酸溶液，B為乙腈，梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，洗脫程序見表1。

表1 流動相配比與洗脫時(shí)間Table 1 Mobile phase ratio and elution time

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用甲醇（色譜純）將每瓶定量的20 mg標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解，定容于25 mL棕色容量瓶中，配制成 800 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品母液，全程均為避光處理。將上述母液用流動相分別配制成0.5、1、2、5、10、25、50、100 mg·L-1的濃度梯度，再配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光保存于-20 ℃以下的環(huán)境中[23]。

將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析，以標(biāo)樣的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出9種酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且計(jì)算出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

沒食子酸：y＝39.407x－177.16（R2＝0.9991）

香豆酸：y＝34.514x－50.987（R2＝0.9995）

綠原酸：y＝54.134x＋104.556（R2＝0.9999）

咖啡酸：y＝102.27x－227.73（R2＝0.9992）

丁香酸：y＝56.291x－114.55（R2＝0.9995）

表兒茶素：y＝12.615x－48.155（R2＝0.9993）

阿魏酸：y＝121.64x－179.78（R2＝0.9995）

槲皮苷：y＝56.797x＋29.964（R2＝0.9994）

白藜蘆醇：y＝149.75x－223.2（R2＝0.9993）

1.2.5 果皮體式顯微鏡和石蠟切片觀察

采用體式顯微鏡觀察同一成熟時(shí)期有果銹和無果銹葡萄果實(shí)的果皮特征，并拍照記錄。采用石蠟切片法觀察同部位果皮結(jié)構(gòu)。分別選取有、無果銹的葡萄果實(shí)5～10粒，用雙面刀片切取果皮的果銹部位，無果銹果實(shí)則選取果實(shí)向陽面的果皮，取樣厚度0.5 cm左右，立即放入FAA固定液中，經(jīng)抽氣后固定待用。采用石蠟切片法制作切片，切片厚度為10 μm，然后經(jīng)番紅-固綠雙重染色進(jìn)行制片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行果皮垂周面形態(tài)觀察[24]。

1.2.6 果皮掃描電鏡及透射電鏡觀察

掃描電鏡（HITACHI，SU8100）的制樣方法參考王一衡和李曉[25-26]的方法。透射電鏡（HITACHI，HT7700）的制樣方法參考唐國冬等[27]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016和Sigma Plot軟件進(jìn)行處理并繪制相關(guān)圖表，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟期有銹果及無銹果外觀品質(zhì)分析

由表2可知，成熟期無銹果粒質(zhì)量顯著高于有銹果，兩者的橫徑、縱徑和果形指數(shù)無顯著性差異。結(jié)果表明，無銹果果皮亮度值（L*）顯著高于有銹果果皮，而有銹果的紅色飽和度（a*）極顯著高于無銹果，黃色飽和度（b*）無顯著性差異。

表2 成熟期果實(shí)外觀品質(zhì)比較Table 2 Comparison of fruit appearance and quality at mature stage

2.2 成熟期有銹果及無銹果重要內(nèi)在品質(zhì)分析

由表3可知，有銹果的可溶性固形物高達(dá)22.18%，顯著高于無銹果，其可溶性糖、木質(zhì)素和總酚含量均極顯著高于無銹果，兩者的可滴定酸、總黃酮、總黃酮醇、總黃烷醇含量無顯著性差異。說明糖、木質(zhì)素和總酚的積累可能與果銹的形成有關(guān)。

表3 成熟期果實(shí)重要內(nèi)在品質(zhì)比較Table 3 Comparison of important intrinsic quality of fruit at mature stage

2.3 成熟期銹果及無銹果糖組分分析

由表4所示，‘陽光玫瑰’有銹果果皮和果肉的果糖、葡萄糖和總糖含量均極顯著高于無銹果果皮和果肉，有銹果果皮的果糖、葡萄糖和總糖含量較無銹果果皮分別增加19.79%、14.62%和17.57%，有銹果果肉的果糖、葡萄糖和總糖含量較無銹果果肉分別增加了14.28%、9.50%和11.77%。兩者果皮和果肉的蔗糖含量均無顯著性差異。說明‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)糖分積累與果銹的形成密切相關(guān)，其中果糖和葡萄糖積累有利于果銹的產(chǎn)生。

表4 成熟期果實(shí)糖組分比較Table 4 Comparison of fruit sugar components at mature stage mg·g-1

2.4 成熟期有銹果及無銹果酚組分分析

通過對成熟期有銹果與無銹果果皮和果肉酚組分的測定發(fā)現(xiàn)，有銹果果皮和果肉的酚組分含量與無銹果果皮和果肉的酚組分含量有顯著性差異（表5）。有銹果果皮的沒食子酸、綠原酸、表兒茶素、阿魏酸、槲皮苷和白藜蘆醇含量都極顯著高于無銹果果皮，分別高出110.40%、85.06%、88.01%、359.89%、396.73%和40.66%；其咖啡酸含量顯著高于無銹果果皮，較無銹果果皮增加了21.93%；無銹果果皮中未檢測出丁香酸和香豆酸。有銹果果肉的綠原酸、表兒茶素和咖啡酸含量都極顯著高于無銹果果肉，分別高出89.18%、24.30%和8.48%；無銹果果肉中未檢測出阿魏酸，所有樣品果肉中均未檢測到丁香酸、香豆酸、槲皮苷和白藜蘆醇。說明‘陽光玫瑰’葡萄酚組分的積累有利于果銹的形成。

表5 成熟期果實(shí)酚組分比較Table 5 Comparison of phenolic components at mature stage

2.5 成熟期果皮體式顯微鏡和石蠟切片觀察

由圖1（放大25倍）所示，‘陽光玫瑰’葡萄成熟期有銹果與無銹果的果皮表面存在較大差異。無銹果果皮（圖1 A）呈黃綠色，表面干凈無斑點(diǎn)，而有銹果果皮（圖1 B）呈黃色且有成片的紅色斑點(diǎn)。

圖1 成熟期‘陽光玫瑰’無銹果（A）與有銹果（B）體視顯微鏡下果皮特征差異（25倍）Figure 1 The difference of pericarp characteristics between none russet (A) and russet (B) 'Shine Muscat' grape at mature stage under stereoscopic microscope (×25)

通過對無銹果與有銹果果皮細(xì)胞的石蠟切片觀察（放大200倍）發(fā)現(xiàn)，‘陽光玫瑰’葡萄果皮主要由角質(zhì)層細(xì)胞和表皮細(xì)胞組成。無銹果果皮角質(zhì)層細(xì)胞較小，呈鵝卵石狀，排列疏松；表皮細(xì)胞呈扁圓形或扁長形，排列緊密，越靠近果肉細(xì)胞越大（圖2 A）。而有銹果皮無明顯的角質(zhì)層細(xì)胞，角質(zhì)膜結(jié)構(gòu)被破壞（圖2 B）。

圖2 成熟期‘陽光玫瑰’葡萄無銹果（A）與有銹果（B）果皮石蠟切片（200倍）Figure 2 Paraffin section of pericarp of none russet (A) and russet (B) 'Shine Muscat' grape at mature stage (×200)

2.6 成熟期果皮掃描電鏡觀察

通過對無銹果與有銹果果皮掃描電鏡觀察（圖3）發(fā)現(xiàn)，無銹果果皮（圖3 A、B）表皮蠟質(zhì)層豐富，覆蓋面廣，分布均勻，結(jié)構(gòu)致密；個(gè)別表皮細(xì)胞裸露、脫落，蠟質(zhì)晶體大小均一，致密，排列均勻。有銹果果皮（圖3 C、D）表皮蠟質(zhì)層相對稀疏，局部小面積蠟質(zhì)脫落，表皮細(xì)胞裸露，蠟質(zhì)層表面較多孔隙，基質(zhì)稀疏；表皮細(xì)胞部分區(qū)域脫落，蠟質(zhì)晶體大小不均一，排列紊亂，局部呈絲狀。表明無銹果與有銹果果皮表皮結(jié)構(gòu)存在一定程度差異性，無銹果表皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)相對較好。

圖3 成熟期‘陽光玫瑰’葡萄無銹果（A、B）與有銹果（C、D）果皮掃描電鏡觀察Figure 3 SEM observation of pericarp of none russet (A, B) and russet (C, D) 'Shine Muscat' grape at mature stage

2.7 成熟期果皮透射電鏡觀察

由圖4所示，無銹果果皮（圖4 A、B）表皮細(xì)胞呈中度水腫，細(xì)胞膜局部萎縮，細(xì)胞壁完整，輕度質(zhì)壁分離，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器輕度腫脹、局部區(qū)域空泡化。線粒體呈輕度腫脹，大部分線粒體膜完整，基質(zhì)略顯變淡；液泡局部破損，其中可見嗜鋨顆粒；脂滴較少，葉綠體結(jié)構(gòu)完整，基粒片層結(jié)構(gòu)存在。而有銹果果皮（圖4 C、D）表皮細(xì)胞呈中重度水腫，細(xì)胞膜局部萎縮，細(xì)胞壁完整，次生加厚，輕度質(zhì)壁分離，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器明顯腫脹、呈空泡化。線粒體呈中重度腫脹，大部分線粒體嵴消失，部分嚴(yán)重者膜破損，其結(jié)構(gòu)開始破壞，線粒體正逐漸破裂崩解；液泡崩解，細(xì)胞器游離，其中可見嗜鋨顆粒；脂滴分散、游離，糖萼不連續(xù)。以上結(jié)果表明，‘陽光玫瑰’葡萄果銹的產(chǎn)生是由于果皮細(xì)胞壁次生加厚，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器受到破壞所導(dǎo)致。

圖4 成熟期‘陽光玫瑰’葡萄無果銹（A、B）與有果銹（C、D）葡萄果皮透射電鏡觀察Figure 4 TEM observation of pericarp of none russet (A, B) and russet (C, D) 'Shine Muscat' grape at mature stage

3 討論

在梨和蘋果上的研究發(fā)現(xiàn)，果銹的形成與木質(zhì)素的積累有關(guān)[28]，苯丙烷代謝的次級產(chǎn)物代謝途徑參與了果銹形成過程[29]，葡萄果皮酚類物質(zhì)含量的積累在一定程度上促進(jìn)了果面銹斑形成[4-5,12-14]。本研究結(jié)果表明，‘陽光玫瑰’有銹果果皮的總酚、酚組分（沒食子酸、綠原酸、表兒茶素、阿魏酸、槲皮苷和白藜蘆醇）含量均極顯著高于無銹果果皮，其咖啡酸含量顯著高于無銹果果皮，無銹果果皮中未檢測出丁香酸和香豆酸。果皮木質(zhì)素測定表明，有銹果果皮木質(zhì)素含量極顯著高于無銹果，說明果銹的形成與果皮中酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的積累密切相關(guān)，這與前人報(bào)道的結(jié)果相似[3,7]。本研究還發(fā)現(xiàn)，有銹果果皮的可溶性糖都極顯著高于無銹果，兩者的可滴定酸含量無顯著性差異，說明糖組分的積累有利于果銹的形成，具體影響機(jī)制還有待深入研究。

果銹的形成伴隨著果皮內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。研究表明，‘翠冠’梨果銹的形成與果實(shí)表皮細(xì)胞形狀和排列方式密切相關(guān)，表皮細(xì)胞形狀不規(guī)整，排列不整齊，角質(zhì)膜厚薄不均勻，這些都會導(dǎo)致在快速膨大期果實(shí)內(nèi)部細(xì)胞膨大速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過表皮細(xì)胞時(shí)，角質(zhì)膜發(fā)生網(wǎng)狀龜裂，在外界雨水等不良環(huán)境因子的影響下，表皮細(xì)胞受到損害，形成栓化細(xì)胞，從而導(dǎo)致果銹形成[30,3]。本研究發(fā)現(xiàn)，無果銹的‘陽光玫瑰’葡萄角質(zhì)層細(xì)胞較小，呈鵝卵石狀，排列疏松，表皮細(xì)胞扁圓形或扁長形，排列緊密；而有果銹的‘陽光玫瑰’葡萄果皮無明顯的角質(zhì)層細(xì)胞，角質(zhì)膜結(jié)構(gòu)被破壞。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，無果銹‘陽光玫瑰’葡萄果皮表皮蠟質(zhì)層豐富，分布均勻，結(jié)構(gòu)致密，蠟質(zhì)晶體大小均一，致密，排列均勻；而有果銹‘陽光玫瑰’葡萄果皮表皮蠟質(zhì)層相對稀疏，蠟質(zhì)晶體大小不均一，排列紊亂。說明‘陽光玫瑰’葡萄果銹的形成是由于果皮結(jié)構(gòu)受到破壞導(dǎo)致，這與張盼盼[31]在梨上的研究結(jié)果相似。

有研究發(fā)現(xiàn)，庫爾勒香梨有銹斑部位的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁逐漸消失，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器逐漸解體，而完好部位的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁完整，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)沒有流失[32]。本研究通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，‘陽光玫瑰’無銹果表皮細(xì)胞壁完整，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器輕度腫脹；大部分線粒體膜完整，液泡局部破損，葉綠體結(jié)構(gòu)完整。而有果銹‘陽光玫瑰’葡萄果皮表皮細(xì)胞壁次生加厚，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器明顯腫脹，大部分線粒體嵴消失，部分結(jié)構(gòu)開始破壞，線粒體正逐漸破裂崩解，液泡崩解，細(xì)胞器游離，說明在果銹形成后，表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭破壞，胞間層的次生保護(hù)組織增多，次生組織進(jìn)一步木栓化，果皮組織細(xì)胞壁木質(zhì)化加厚。在受到內(nèi)部細(xì)胞壓力時(shí)，細(xì)胞容易破裂，這可能就是導(dǎo)致‘陽光玫瑰’葡萄果銹形成的重要原因。

4 結(jié)論

果實(shí)品質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，‘陽光玫瑰’有銹果果實(shí)的可溶性固形物顯著高于無銹果，有銹果果皮中果糖、葡萄糖以及總酚、木質(zhì)素和酚組分的積累較無銹果果皮顯著增多。顯微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，有銹果果皮中無明顯的角質(zhì)層細(xì)胞，果銹處果皮角質(zhì)膜和蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損壞，胞間層的次生保護(hù)組織增多，次生組織木栓化程度高，果皮組織細(xì)胞壁木質(zhì)化加厚，線粒體和液泡結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞器游離。因此，‘陽光玫瑰’葡萄果銹的形成雖然影響了外觀品質(zhì)，降低了商品性，但對果實(shí)理化指標(biāo)有明顯的提升，果銹不影響內(nèi)在品質(zhì)和口感。