基于SCoT分子標(biāo)記的37份葡萄種質(zhì)遺傳多樣性分析

馬玉姣，何西堂，吳玉森，劉利，李勃，李秀杰*

（1. 山東省葡萄研究院，山東濟南 250100；2. 莒南縣城鄉(xiāng)建設(shè)綜合服務(wù)中心，山東莒南 276699）

近年來，DNA分子標(biāo)記因其操作簡單、反應(yīng)靈敏、應(yīng)用范圍廣及受環(huán)境因素干擾小等顯著優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于葡萄遺傳多樣性分析[1-3]。其中，目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（Start codon targeted polymorphism，SCoT）分子標(biāo)記由Collard和Mackill[4]在水稻研究中開發(fā)，是基于ATG起始密碼子兩側(cè)短序列的保守性，利用單引物對基因組進行PCR擴增的分子標(biāo)記方法。相比于SSR、ISSR、AFLP等傳統(tǒng)分子標(biāo)記，SCoT具有成本低、操作簡單、重復(fù)性好、引物通用性強等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于龍眼、芒果、柿、獼猴桃、桃、櫻桃等[5-10]多種果樹的多態(tài)性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析研究。

葡萄為葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（VitisL.）植物，是最古老的植物之一[11]。我國現(xiàn)有資源圃中保存的葡萄種質(zhì)達3000多份[12]，品種豐富多樣，種植范圍廣，在落葉果樹生產(chǎn)中占據(jù)重要的位置[13]。近年來，隨著國內(nèi)葡萄新品種的不斷選育，其中不乏自然變異及民間選育的品種，加之地區(qū)之間品種交流頻繁，導(dǎo)致出現(xiàn)“同名異物”或“同物異名”現(xiàn)象[14]。因此，開展葡萄種質(zhì)資源研究，僅靠形態(tài)學(xué)標(biāo)記已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，必須借助簡單高效的分子標(biāo)記，以實現(xiàn)對種質(zhì)遺傳關(guān)系及多樣性的精準(zhǔn)鑒定。目前，SCoT分子標(biāo)記雖已在葡萄上有所應(yīng)用[15-16]，但缺乏對主栽品種和自主選育品種的遺傳關(guān)系及多樣性分析。本研究基于SCoT分子標(biāo)記技術(shù)，利用11對多態(tài)性好的引物，對中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家葡萄種質(zhì)資源圃（鄭州）和山東省果樹研究所金牛山基地（泰安）的主栽品種和自主選育品種（優(yōu)系）共37份種質(zhì)進行遺傳關(guān)系及遺傳多樣性分析，篩選部分品種的潛在親本，為葡萄遺傳育種工作中親本的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所選取的37份樣品材料，包括27個現(xiàn)有栽培品種：紅地球、美人指、紅巴拉多、魏可、秋紅、秋黑、安藝皇后、巨玫瑰、乍娜、紅乳、矢富羅莎、玫瑰香、巨星、里扎馬特、紅雞心、著色香、牛奶、京秀、黑巴拉多、蜜汁、鳳凰51、巨峰、紅雙味、弗雷無核、早霞玫瑰、山東早紅、87-1，來自國家葡萄種質(zhì)資源圃（鄭州）；MPG1、JM19、JFF19、JFH19、JF19、錦紅[17]、藤稔芽變7個自育品種（系）及巨峰、藤稔、摩爾多瓦3個現(xiàn)有栽培品種取自金牛山基地（泰安），巨峰在兩地同時采樣（表1）。上述種質(zhì)于2020年8月取樣，每份樣品隨機采集幼嫩葉片10片，迅速置于液氮中帶回實驗室，保存至-80 ℃冰箱中備用。

表1 試驗所需葡萄種質(zhì)詳細(xì)信息Table 1 Detail information of the tested grape accessions

1.2 葡萄DNA的提取

采用CTAB法提取葡萄葉片基因組DNA，通過1%凝膠電泳和微量核酸蛋白濃度測定儀（NanoDrop2000，Thermo，USA）檢測其純度和濃度，并用ddH2O統(tǒng)一稀釋至30 ng·μL-1，保存至-20 ℃冰箱備用。

1.3 SCoT引物及PCR擴增

本試驗所用引物（表2）均已報道[3-4]，SCoT-PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。SCoT-PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×PCR Mix 10 μL，SCoT引物（10 μmol）1 μL，30 ng·μL-1DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，利用ChamlGel 6000型凝膠成像系統(tǒng)進行觀察并拍照。

表2 11條SCoT引物序列及多態(tài)性信息Table 2 Polymorphism of 11 SCoT primers in samples

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)擴增結(jié)果對條帶進行統(tǒng)計，記錄遷徙位置。對同一遷徙位置的電泳條帶進行賦值，“0”表示無條帶，“1”表示有條帶，構(gòu)建原始（0,1）矩陣。使用軟件NTSYSpc 2.10對（0,1）矩陣中不同種質(zhì)進行遺傳相似系數(shù)分析，根據(jù)軟件中構(gòu)建的（0,1）矩陣對37份葡萄種質(zhì)進行主坐標(biāo)分析，同時利用UPGMA法進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄種質(zhì)SCoT-PCR擴增產(chǎn)物多態(tài)性分析

利用11條SCoT引物分別對37份葡萄種質(zhì)進行SCoT-PCR擴增，共得到整齊、清晰的條帶115條，平均每條引物擴增得到10.45條；其中擴增條帶最多的是SCoT40，共15條；最少的是SCoT23和SCoT37，僅8條；擴增共得到多態(tài)性條帶102條，平均多態(tài)性比率為87.9%。多態(tài)性比率最高的SCoT6和SCoT37，均為100%；最少的是SCoT23，為62.5%（表2）。結(jié)果表明，本研究使用的11條SCoT引物擴增條帶多態(tài)性豐富，且試驗中用到的葡萄種質(zhì)遺傳多樣性豐富。

2.2 基于SCoT標(biāo)記的葡萄種質(zhì)遺傳聚類分析

基于對37份葡萄種質(zhì)樣品建立的（0,1）矩陣，對其遺傳相似系數(shù)進行分析，結(jié)果顯示遺傳相似性系數(shù)范圍在0.612～0.929，平均值為0.776（圖1）。37份種質(zhì)中有20對遺傳相似系數(shù)大于0.850。其中，巨玫瑰（8）和玫瑰香（12）、巨星（13）和里扎馬特（14）、早霞玫瑰（25）和山東早紅（26）、JF19（29）和JFH19（32）、JFF19（31）和JFH19（32）、藤稔（35）和藤稔芽變（36）含有親本關(guān)系或使用了同一親本，而藤稔（35）和藤稔芽變（36）相似系數(shù)高達0.929，說明芽變品種‘藤稔芽變’與其母本‘藤稔’之間相似性極高。37份種質(zhì)中遺傳相似系數(shù)最小的為鳳凰51（21）和JF19（29），僅為0.612，說明二者具有不同的遺傳背景。

圖1 37份葡萄種質(zhì)遺傳相似性系數(shù)熱圖Figure 1 Heat map of genetic similarity coefficient among 37 grape germplasms

2.3 葡萄種質(zhì)聚類分析和主坐標(biāo)分析

對37份種質(zhì)進行聚類分析結(jié)果顯示，當(dāng)遺傳距離為0.67時，可將37份葡萄種質(zhì)分為兩類，第Ⅰ類包含30份種質(zhì)（圖2），第Ⅱ類包含7個種質(zhì)，進一步分類可將其分為6組。第1組包括紅地球、美人指、乍娜、秋黑、87-1、藤稔、藤稔芽變和紅巴拉多8個種質(zhì)；第2組包括巨玫瑰、玫瑰香、紅雞心、矢富羅莎、紅乳、巨星、里扎馬特、牛奶、黑巴拉多和錦紅10份種質(zhì)；第3組包括魏可、早霞玫瑰、山東早紅、秋紅、JFH19、JFF19和著色香7份種質(zhì)；第4組包括安藝皇后、紅雙味、鳳凰51、京秀和弗雷無核5個種質(zhì)；第5組包括蜜汁、巨峰（鄭州）、JF19和巨峰（泰安）4個種質(zhì)；第6組包括MPG1、JM19和摩爾多瓦3個種質(zhì)。

圖2 37份葡萄種質(zhì)聚類分析圖Figure 2 Cluster diagram of 37 grape germplasms

同時，利用遺傳相似系數(shù)繪制了37份葡萄種質(zhì)進行主坐標(biāo)分析，并繪制散點圖。如圖3所示，可將37份葡萄種質(zhì)分為4組：A組包括紅地球（1）、美人指（2）、紅巴拉多（3）、魏可（4）、秋紅（5）、秋黑（6）、巨玫瑰（8）、乍娜（9）、紅乳（10）、矢富羅莎（11）、玫瑰香（12）、巨星（13）、里扎馬特（14）、紅雞心（15）、著色香（16）、牛奶（17）、京秀（18）、黑巴拉多（19）、弗雷無核（24）、早霞玫瑰（25）、山東早紅（26）、87-1（27）、錦紅（34）、藤稔（35）和藤稔芽變（36）25個種質(zhì)；B組包括安藝皇后（7）、鳳凰51（21）、紅雙味（23）、JFF19（31）和JFH19（32）5個種質(zhì)；C組包括MPG1（30）、JM19（33）和摩爾多瓦（37）3個種質(zhì)；D組包括蜜汁（20）、巨峰-鄭州（22）、JF19（29）和巨峰-泰安（28）4個種質(zhì)。主坐標(biāo)分析中的A、B組和C、D組分別對應(yīng)聚類分析圖中的Ⅰ類和Ⅱ類，且每組成員與聚類分析結(jié)果基本吻合。相比于聚類分析圖，主坐標(biāo)分析圖能更直觀的表現(xiàn)出37個葡萄種質(zhì)的親緣關(guān)系。

圖3 37份葡萄種質(zhì)主坐標(biāo)分析圖Figure 3 Pricipal coordinate analysis of 37 grape germplasms

3 討論與結(jié)論

葡萄為高度雜合的物種，種內(nèi)變異大是葡萄具有遺傳多樣性的基礎(chǔ)。利用分子標(biāo)記對葡萄多樣性及遺傳關(guān)系進行鑒定，對葡萄育種和品種保護提供了重要參考[18-19]。近年來，利用SCoT標(biāo)記進行葡萄種群間遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究也有報道。王發(fā)明等[15]分別利用ISSR和SCoT對葡萄種質(zhì)遺傳多樣性進行了分析，結(jié)果表明，相比于ISSR標(biāo)記，SCoT分析的樣本遺傳多樣性更高，且能更好的區(qū)分栽培種質(zhì)和野生種質(zhì)，在葡萄種質(zhì)系統(tǒng)進化及遺傳多樣性評價中SCoT比ISSR更有優(yōu)勢，這與Kumer等[20]的研究結(jié)果相符。岳慶春等[16]利用SCoT分子標(biāo)記對醉金香及其突變株進行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，SCoT分子標(biāo)記可以將親緣關(guān)系近的樣本聚到一起，說明SCoT分子標(biāo)記可應(yīng)用于葡萄種質(zhì)遺傳多樣性的評價和雜交育種的早期鑒定工作中。

本研究選用山東地區(qū)鮮食葡萄主栽品種和自主選育的品種（優(yōu)系），利用11對SCoT引物分析親本關(guān)系和遺傳多樣性，平均多態(tài)性比例達到87.90%，高于可揭示多數(shù)葡萄種質(zhì)的遺傳差異；遺傳范圍區(qū)間為0.612～0.929，其中遺傳相似系數(shù)大于0.850的有20對，遺傳范圍較窄；當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.67時，可將37份葡萄種質(zhì)分為兩大類。聚類分析結(jié)果表明，具有親本關(guān)系的品種遺傳距離很近，如：秋黑是美人指的后代，巨玫瑰是玫瑰香的后代，自主選育品種錦紅是里扎馬特的后代，芽變品種藤稔芽變是藤稔的后代，其中藤稔芽變和藤稔遺傳相似系數(shù)高達0.929；多數(shù)使用了同一親本的姊妹品種也聚類在同一支上，如：紅雞心和玫瑰香都是白玫瑰的后代，選育的優(yōu)系JFF19和JFH19都是巨玫瑰的后代等，上述結(jié)果與利用SLAF-seq方法報道結(jié)果相符[2]。此外，由于葡萄種質(zhì)遺傳背景較為復(fù)雜，許多民間選育品種無法提供確切的親本信息，如本文中提到的牛奶（親本不詳）和黑巴拉多遺傳相似系數(shù)為0.844，87-1（親本未知）和秋黑遺傳相似系數(shù)為0.875，猜測二者可能具有直接親本關(guān)系或為姊妹品種，SCoT標(biāo)記對這類種質(zhì)的親本預(yù)測工作提供依據(jù)。

本研究利用SCoT分子標(biāo)記客觀評價了37份葡萄種質(zhì)的遺傳多樣性，為拓寬葡萄種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)提供了理論依據(jù)。同時，該方法可鑒定葡萄潛在的親緣關(guān)系，為鑒定未知親緣關(guān)系的品種提供參考依據(jù)。