二甲雙胍通過AMPK/STAT3信號通路抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性*

林海旭 管徒晨 巫榮華

(南通大學(xué), 江蘇 南通 226000)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病,具有較高的致死率和致殘率,其導(dǎo)致的運(yùn)動及感覺功能障礙給患者及社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[1-3]。脊髓損傷后神經(jīng)再生困難的主要原因有中樞系統(tǒng)神經(jīng)元軸突再生能力有限,軸突生長的微環(huán)境中存在抑制因素,以及膠質(zhì)瘢痕的形成阻礙了軸突再生[4]。脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生,形成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(Reactive astrocytes,RAs)。研究[5]發(fā)現(xiàn),按照反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元軸突生長的影響,可以分別分為:抑制軸突生長作用的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(A1型星膠)和促進(jìn)軸突生長或神經(jīng)保護(hù)作用的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(A2型星膠)。另有研究[6]指出,創(chuàng)傷后微環(huán)境中的腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素1α(IL-1α)、補(bǔ)體1q(C1q)三種因子(簡稱三因子)的含量上升,將其加入正常狀態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞中可以誘導(dǎo)其成為A1型星膠,而補(bǔ)體成分3(Complement component 3, C3)被認(rèn)為是A1型星膠的標(biāo)記物[7]。2019年,Vismara等[8]發(fā)現(xiàn)在小鼠脊髓損傷后選擇性抑制A1型星膠進(jìn)程可以促進(jìn)功能恢復(fù),提示調(diào)節(jié)A1型星膠可以作為治療脊髓損傷修復(fù)的方向之一。

二甲雙胍是Ⅱ型糖尿病的經(jīng)典用藥,被廣泛報(bào)道[9-11]在多種領(lǐng)域中具有潛在功效,比如可以作用于肺部、腸道等。近年有研究[12-13]報(bào)道二甲雙胍具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)的作用,其主要機(jī)制包括激活A(yù)MPK通路增加細(xì)胞代謝、線粒體呼吸和葡萄糖攝取[14]、抑制mTOR通路抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)自噬等。二甲雙胍可以促進(jìn)大鼠脊髓損傷后后肢運(yùn)動功能恢復(fù),其機(jī)制可能與抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)、與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)、通過對自噬通量的調(diào)節(jié)、與穩(wěn)定微管和抑制氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙有關(guān)[13, 15-17]。另有研究[18-19]表明,二甲雙胍可以通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)髓鞘碎片清除,加速脊髓損傷后的神經(jīng)修復(fù)。并顯著促進(jìn)軸突生長。本研探討二甲雙胍對體外培養(yǎng)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性的作用及可能機(jī)制,為二甲雙胍治療脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 TNF-α、IL-1α、C1q及二甲雙胍溶液配制 實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞因子TNF-α(貨號: abs04232-10 μg)購自上海愛必信生物科技公司;IL-1α(貨號:400-01A)購自Peprotech公司;C1q(貨號:NBP2-62410)購自Novus公司;鹽酸二甲雙胍(貨號:M107827)購自上海阿拉丁生化科技公司。藥物在超凈工作臺中分別使用相應(yīng)的溶劑溶解至儲存濃度,使用一次性注射器及無菌濾器過濾并分裝,置于-80 ℃長期保存,見表1。

表1 細(xì)胞因子及二甲雙胍的使用濃度Table 1 Concentrations of cytokines and metformin

1.2 原代脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用SPF級SD大鼠乳鼠由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,并在南通大學(xué)動物護(hù)理和使用委員會的指導(dǎo)方針下進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)(倫理號為S20200330-003)。對出生1 d的SD乳鼠進(jìn)行取材,具體過程如下:將乳鼠使75%酒精擦拭消毒后,用眼科剪斷頭處理,隨后沿脊柱將皮膚剪開,暴露乳鼠脊椎椎骨。使用顯微剪插入錐孔沿脊柱將脊椎剖開,暴露脊髓。使用顯微彎鑷沿脊髓兩側(cè)對神經(jīng)束進(jìn)行離斷,將脊髓完整取出,浸泡于含2%青鏈霉素(碧云天,貨號:C0222)的Hanks液(美侖生物,貨號:MA0015)中。體式顯微鏡下,使用顯微直鑷與顯微彎鑷將脊髓表面脊膜剝離,剝離后的脊髓浸泡于含2%青鏈霉素的Hanks液中。使用1000 μL移液器將組織吹散,然后收集至15 mL離心管中,1200 rpm室溫離心3 min。去上清,加入2 mL 0.25%胰酶(Gibco,貨號:25200072)消化,置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化15 min,每5 min振蕩1次,每次15 s。加入2倍體積含有10%胎牛血清 (LONSERA,貨號:S711-001S)的DMEM/F12(Corning,貨號:10092022)完全培養(yǎng)基終止消化,過40 μm篩網(wǎng)后收集細(xì)胞懸液至15 mL離心管中,1000 rpm離心5min后棄上清。加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按5×106的細(xì)胞量接種至T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,隨后使用含10%胎牛血清、1% 青鏈霉素、1% L-谷氨酰胺(碧云天,貨號:C0212)及0.1% 兩性霉素B(美侖生物,貨號:MB1014)的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),2～3 d換液,至其長滿后備用。

1.3 A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的建立 P2代星形膠質(zhì)細(xì)胞用0.25% 胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)后按5×104個/孔接種到6孔板中。待細(xì)胞貼壁2 h后,按照表1加入三因子(TNF-α、IL-1α、C1q)繼續(xù)培養(yǎng)3 d。使用徠卡DMi8顯微鏡拍攝細(xì)胞形態(tài),并使用實(shí)時熒光定量PCR檢測基因的mRNA表達(dá)水平。

1.4 二甲雙胍和Compound C處理A1型星膠二甲雙胍處理 A1型星膠實(shí)驗(yàn)中將P2代星形膠質(zhì)細(xì)胞用0.25% 胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)后按5×104個/孔接種到6孔板中。待細(xì)胞貼壁1 h后按照表1加入三因子(TNF-α、IL-1α、C1q)和不同濃度的二甲雙胍,繼續(xù)培養(yǎng)3 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);將細(xì)胞分為對照組、A1型星膠組、二甲雙胍處理組(5、10、20 mM)。使用Compound C處理星膠實(shí)驗(yàn)中待細(xì)胞貼壁后使用不同濃度(5 μM、15 μM)Compound C(簡稱CC, MCE公司,貨號:1219168-18-9)處理細(xì)胞1 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);細(xì)胞分組為對照組、CC處理組(5 μM、15 μM)。二甲雙胍和Compound C處理星膠細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中待細(xì)胞貼壁1 h后使用20 mM二甲雙胍預(yù)處理細(xì)胞1 h,后加入三因子繼續(xù)培養(yǎng)2 d,然后加入15 μM Compound C處理細(xì)胞1 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);細(xì)胞分組為對照組、A1型星膠組、20 mM二甲雙胍處理組、20 mM二甲雙胍+15 μM CC處理組。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測不同處理組的星膠細(xì)胞 使用1×PBS洗滌3次后使用微量RNA提取試劑盒(Magen,貨號:R4012-02)提取總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊,貨號:R312-01/02)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用TB Green?Premix Ex TaqTMII試劑盒(takara,貨號:RR820)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測,反應(yīng)體系總體積為10 μL:TB Green?Premix Ex TaqTMII 5 μL,cDNA 1 μL,Sense Primer(10 μM)0.5 μL,Antisense Primer(10 μM)0.5 μL,RNase-Free H2O 3 μL。通過2-△△Ct方法分析相對基因表達(dá),GAPDH作為內(nèi)參基因。引物序列,見表2。

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物信息Table 2 The sequences of the primers for RT-qPCR

1.6 Westernblot實(shí)驗(yàn) 不同處理組的星膠細(xì)胞使用1×PBS洗滌3次后加入適量含有1% PMSF(碧云天,貨號:ST506)、2%磷酸酶抑制劑(碧云天,貨號:P1045)的細(xì)胞裂解液(碧云天,貨號:P0013B)冰上裂解30 min。然后收集至1.5 mL EP管中,4 ℃,12,000 rpm離心15 min。收集上清,采用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天,貨號:P0012)測定濃度,將蛋白樣品的終濃度定為2 mg/mL,按比例加入6×SDS loading buffer,置于100 ℃水浴鍋煮沸5 min。使用Express cast Page彩色凝膠快速試劑盒(新賽美,貨號:P2011)配置凝膠,進(jìn)行SDS蛋白電泳,隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(默克,貨號:ISEQ00010)。將膜置于5%脫脂牛奶中封閉2 h后,4 ℃使用一抗(C3(Abcam,ab200999,1∶1000)、p-AMPK(Cellsignalingtechnology,#2535,1∶1000)、AMPK(Cellsignalingtechnology,#5832,1:1000)、STAT3(Cellsignalingtechnology ,#9139,1∶1000)、p-STAT3(Cellsignalingtechnology,#9145,1:1000)和α/β-Tubulin(Cellsignalingtechnology,#2148,1∶2500))孵育過夜,1×TBST搖床洗滌PVDF膜3次,每次10 min,然后室溫孵育相應(yīng)二抗(1∶2500)2 h,使用1×TBST洗滌3次,每次20 min。采用High-sig ECL發(fā)光試劑(Tanon,貨號:180-501)曝光條帶,使用Tanon儀器進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 三因子誘導(dǎo)A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的建立 為了驗(yàn)證原代培養(yǎng)的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞是否可以誘導(dǎo)為A1型星膠,使用三因子(TNF-α、IL-1α、C1q)進(jìn)行誘導(dǎo),在第1～3 d收集細(xì)胞并提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-qPCR檢測。結(jié)果顯示加入細(xì)胞因子后,星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)由星形轉(zhuǎn)變到狹長的梭形(見圖1A);同時A1型星膠標(biāo)記物C3基因在mRNA水平上的表達(dá)量顯著上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05, 見圖1B)。上述結(jié)果表明,在原代培養(yǎng)的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入三因子后,可以成功誘導(dǎo)成A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。

圖1 三因子誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞為A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞Figure 1 Astrocytes induced by three factors are A1 type reactive astrocytes注:A.星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入三因子1 d和3 d的形態(tài)變化;B.加入三因子1～3 d后星形膠質(zhì)細(xì)胞中C3的mRNA表達(dá)情況。

2.2 二甲雙胍對A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性的影響 在A1型星膠中加入了不同濃度的二甲雙胍,3 d后提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行RT-qPCR檢測。A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞C3的表達(dá)在mRNA和蛋白水平都隨著二甲雙胍濃度的增加而逐漸降低并呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),特別是二甲雙胍濃度為20 mM時,C3的蛋白表達(dá)水平恢復(fù)到與對照組一致。上述結(jié)果表明二甲雙胍可以抑制A1型星膠的產(chǎn)生。見圖2。

圖2 二甲雙胍抑制A1型星膠細(xì)胞標(biāo)志物C3的表達(dá)Figure 2 Metformin inhibits the expression of type A1 astrocyte marker C3注:A.不同濃度二甲雙胍處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞中C3的mRNA表達(dá)水平;B.不同濃度二甲雙胍處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞中C3的蛋白表達(dá)水平。a.代表性的Westernblot圖;b.C3蛋白水平統(tǒng)計(jì)圖。

2.3 二甲雙胍對星形膠質(zhì)細(xì)胞AMPK和STAT3表達(dá)的影響 檢測AMPK和STAT信號通路,結(jié)果顯示,在星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入不同濃度的二甲雙胍后p-AMPK表達(dá)升高,同時抑制p-STAT3的表達(dá),且呈濃度依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),見圖3。

圖3 二甲雙胍對星形膠質(zhì)細(xì)胞中AMPK和STAT3表達(dá)的影響Figure 3 Effect of metformin on AMPK and STAT3 expression in astrocytes注:A.不同濃度二甲雙胍處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞中AMPK和STAT3的蛋白表達(dá)水平;B.AMPK和STAT3蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)圖。

2.4 二甲雙胍通過AMPK/STAT3信號途徑抑制A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞 為了進(jìn)一步確認(rèn)二甲雙胍是否通過AMPK/STAT3信號軸來發(fā)揮作用,在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入5 μM和15 μM的AMPK信號通路抑制劑(Compound C,簡稱CC)來抑制AMPK的活性,發(fā)現(xiàn)加入15 μM CC后具有較好的抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05,見圖4A)。然后在三因子誘導(dǎo)的A1星膠和二甲雙胍處理A1型星膠中,加入15 μM CC處理(見圖4B),結(jié)果提示,抑制AMPK活性后,STAT3的活性升高,同時C3表達(dá)也升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4C)。上述結(jié)果表明,二甲雙胍通過AMPK信號通路抑制A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性。

圖4 二甲雙胍通過AMPK/STAT3信號途徑抑制A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞Figure 4 Metformin inhibits type A1 reactive astrocytes through AMPK/STAT3 signaling pathway注:A.不同濃度Compound C對AMPK的抑制作用;B.二甲雙胍和Compound C處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后AMPK、STAT3和C3的蛋白表達(dá);C.二甲雙胍和Compound C處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)。

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,隨著研究進(jìn)展,星形膠質(zhì)細(xì)胞越來越被認(rèn)為在大腦和脊髓中都具有關(guān)鍵功能。在生理?xiàng)l件下,星形膠質(zhì)細(xì)胞主要參與維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)相關(guān)的多種功能,包括血腦屏障 (bLOOD BRAIN BARRIER,BBB) 和血脊髓屏障(Blood spinal cord barrier,BSCB) 的形成和維持、跨突觸的信號傳遞、維持神經(jīng)元功能和代謝調(diào)節(jié)[20]。然而,在病理背景下,星形膠質(zhì)細(xì)胞會被激活,這些細(xì)胞的終生適應(yīng)性、可塑性和疾病背景下的復(fù)雜性決定了損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群的多樣性[21]。2017 年,Liddelow 等[5]發(fā)現(xiàn)了他們命名為 A1 型星形膠質(zhì)細(xì)胞具有神經(jīng)毒性,其神經(jīng)毒性作用已在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中得到證實(shí)[22, 23-24]。研究[25-27]表明,脊髓損傷后,A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增多,抑制A1型反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞的活化可以促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。因此,通過藥物、基因調(diào)控等手段抑制A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化可能是治療脊髓損傷一個有效的方向。

二甲雙胍是用于治療Ⅱ型糖尿病的降糖藥,且已用于各個方面的實(shí)驗(yàn)性研究,如生殖醫(yī)學(xué)、腫瘤化療、代謝性疾病[28]并且對多種不同病因的神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型具有保護(hù)作用[29]。最近,Song等[13]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以促進(jìn)小鼠脊髓損傷后后肢運(yùn)動功能恢復(fù),目前,其對神經(jīng)系統(tǒng)的研究主要在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中探討其可能的作用[16, 18],在脊髓損傷后對星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性方面還未曾見報(bào)道。AMPK作為調(diào)控能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶,是真核生物細(xì)胞和有機(jī)體代謝的中心調(diào)節(jié)劑之一,負(fù)責(zé)監(jiān)管細(xì)胞的能力輸入和輸出,維持細(xì)胞生理活動的平穩(wěn)運(yùn)轉(zhuǎn)。Zhang 等[30]發(fā)現(xiàn),miR-299a-5p通過激活A(yù)MPK通路對脊髓損傷有保護(hù)作用。Hu等[31]表明鋅通過激活A(yù)MPK途徑來調(diào)節(jié)脊髓和神經(jīng)元的葡萄糖代謝,進(jìn)而促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入不同濃度二甲雙胍后P-AMPK表達(dá)升高,同時抑制P-STAT3的表達(dá),且呈濃度依賴性。已有文獻(xiàn)[14]表明,二甲雙胍的主要作用靶點(diǎn)是AMPK,而活化的AMPK可以起到神經(jīng)保護(hù)作用。STAT3是反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中一個重要的轉(zhuǎn)錄因子,研究[32]表明AMPK可以負(fù)性調(diào)節(jié)STAT3的磷酸化。

有研究報(bào)[5,27]道通過三因子(TNF-α、IL-1α、C1q)可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性,然而對于體外培養(yǎng)的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞往A1型反應(yīng)性星膠誘導(dǎo)的模型尚未有明確文獻(xiàn)。本研究通過三因子處理原代培養(yǎng)的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)A1星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志分子C3的轉(zhuǎn)錄水平在24 h已有明顯升高,而在72 h增加了數(shù)千倍,蛋白水平有顯著升高,表明成功建立了體外A1星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性模型。進(jìn)而在此模型中,研究了二甲雙胍對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響,發(fā)現(xiàn)不同濃度的二甲雙胍可以明顯減少A1型標(biāo)記物C3的表達(dá)且呈現(xiàn)濃度依賴性。脊髓損傷后,小膠質(zhì)細(xì)胞激活產(chǎn)生三因子等細(xì)胞因子進(jìn)而活化星形膠質(zhì)細(xì)胞[25],由于二甲雙胍具有抗炎作用,我們首先檢測了NF-κB信號通路,結(jié)果顯示二甲雙胍處理A1型星膠后,其NF-κB的磷酸化水平未發(fā)生明顯改變(數(shù)據(jù)未顯示)。本研究檢測了AMPK/STAT3通路,結(jié)果顯示二甲雙胍可以升高AMPK的磷酸化,降低STAT3的磷酸化水平;進(jìn)一步地通過AMPK的特異性抑制劑,發(fā)現(xiàn)二甲雙胍激活A(yù)MPK是其作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性的信號通路。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,二甲雙胍可以通過AMPK/STAT3信號途徑抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞A1型反應(yīng)性,為二甲雙胍治療脊髓損傷提供參考。