豬圓環(huán)病毒體外高效增殖研究進(jìn)展

雷白時(shí),薛擁志,李秀麗,包銀莉,張武超,2,趙 款,2*,袁萬哲,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071001;2.河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071001;3.河北北方學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院,河北 張家口075131;4.龍巖學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 龍巖 364012)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,已報(bào)道的PCV分為4個(gè)基因型:PCV1～PCV4。PCV1發(fā)現(xiàn)于被污染的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物中[1],不引起細(xì)胞病變,對(duì)豬也無致病性,可在PK-15細(xì)胞中連續(xù)感染。PCV2主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning pigs multi-systemic wasting syndrome,PMWS),最早于1991年在加拿大豬群中發(fā)現(xiàn)該疾病,之后該病原在全球各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并廣泛流行,引發(fā)了一系列豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus diseases,PCVDs),對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害[2-4]。PCV3為2015年在美國發(fā)現(xiàn)的新病原,它所引起的感染臨床上主要呈現(xiàn)為豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)[5-7],也有報(bào)道單獨(dú)感染不引起明顯臨床癥狀[8-9],但在與其他病原共感染中發(fā)揮作用。PCV4為2019年我國湖南的新發(fā)病原[10],對(duì)豬各器官組織的致病性已經(jīng)得到證實(shí)[11]。PCV3和PCV4作為新發(fā)病原,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的威脅不容忽視,同時(shí)也對(duì)食品安全和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅。

在全球各國,對(duì)于各種傳染性動(dòng)物疫病的預(yù)防主要靠疫苗的應(yīng)用來實(shí)現(xiàn),疫苗開發(fā)與病原的體外培養(yǎng)緊密相連,尤其是滅活疫苗。當(dāng)前對(duì)疫病防控構(gòu)成威脅的3種PCV中,僅PCV2有商業(yè)化疫苗,但因病原的不斷變異導(dǎo)致原有疫苗免疫保護(hù)效果不佳,亟需對(duì)現(xiàn)有PCV2疫苗進(jìn)行更新?lián)Q代[12-13]。PCV3和PCV4病毒的規(guī)?；囵B(yǎng)至今還無法實(shí)現(xiàn),完全限制了其疫苗的研發(fā)和應(yīng)用。鑒于4種PCV在基因組結(jié)構(gòu)、復(fù)制機(jī)制和生物學(xué)特性等方面的相似性,本研究對(duì)其中已實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)的PCV2,在促進(jìn)其病毒增殖方面的方法和研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和概括,對(duì)更廣泛影響病毒復(fù)制的因素不做討論(如抑制或解除抑制作用,實(shí)際并未提高),以期進(jìn)一步提升現(xiàn)有PCV2增殖水平,并對(duì)實(shí)現(xiàn)PCV3或PCV4的體外培養(yǎng)研究提供助力,從而促進(jìn)PCV疫苗的研發(fā)和相關(guān)病原學(xué)與發(fā)病機(jī)制的深入研究。

1 不同基因型PCV基因組結(jié)構(gòu)的分析比較

4種PCV粒子在物理結(jié)構(gòu)和基因組結(jié)構(gòu)上均有相似之處,該類病毒為一類單股正鏈、閉合環(huán)狀、無囊膜的DNA病毒,病毒粒子均為17～20 nm的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)[14],基因組大小PCV1為1 759 nt,PCV2為1 767或1 768 nt,PCV3為2 000 nt,PCV4為1 770 nt。通過對(duì)其基因序列分析表明均包含2個(gè)病毒復(fù)制所必需的反向開放閱讀框架(ORF1和ORF2),其他ORF可能與病毒復(fù)制有關(guān),但非必需。其中ORF1均編碼復(fù)制酶相關(guān)蛋白(Rep),PCV1～PCV4的ORF1分別為939,945,891,891 nt。ORF2編碼的Cap蛋白是唯一衣殼蛋白,PCV1～PCV4的ORF2分別為702,702,645,687 nt。4種PCV在ORF1與ORF2之間存在一段莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop structure),是圓環(huán)病毒滾環(huán)復(fù)制的起始位點(diǎn),位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)頂端的一段保守堿基序列對(duì)病毒基因組的復(fù)制起始至關(guān)重要,一旦發(fā)生突變將使病毒喪失復(fù)制能力[15-16](圖1)。

圖1 4種PCV基因組結(jié)構(gòu)比較

PCV1與PCV2因序列同源性較高,接近80%[17],兩者間ORF1或ORF2等基因元件的互換不影響病毒復(fù)制。而新發(fā)現(xiàn)的PCV3和PCV4兩者間及其與前2種PCV相比,同源性均較低,僅為30%～50%,Cap蛋白氨基酸同源性更低,提示相互之間不能產(chǎn)生交叉免疫保護(hù),現(xiàn)有PCV2疫苗對(duì)PCV3或PCV4的感染無效[10,18]。

2 病毒自身?xiàng)l件的利用與開發(fā)

不同來源的PCV2病毒株,因其在基因序列上的差異,導(dǎo)致其在病毒培養(yǎng)中的滴度差異,目前已有一些關(guān)于病毒基因或序列影響病毒復(fù)制效率和培養(yǎng)滴度的報(bào)道,但尚無系統(tǒng)性研究結(jié)果。如周繼勇等[19]發(fā)現(xiàn)PCV2基因組1 376位堿基缺失的突變株比親本病毒效價(jià)高出10倍以上;李佳暖等[20]通過突變PCV2-Rep蛋白上的1個(gè)N糖基化位點(diǎn),使病毒滴度有所提高。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PCV2-ORF5蛋白通過抑制豬上皮細(xì)胞中的Ⅰ型干擾素的表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來增強(qiáng)PCV2在豬上皮細(xì)胞中的復(fù)制[21-22]。這些研究表明PCV2本身的序列就可能促進(jìn)病毒復(fù)制,主要在于如何發(fā)現(xiàn)和利用其本身的優(yōu)勢,另外也可通過點(diǎn)突變圓環(huán)病毒基因組序列特定位點(diǎn)來提高病毒復(fù)制效率,但關(guān)鍵在于特定序列和位點(diǎn)的識(shí)別與發(fā)現(xiàn),隨著PCV2在感染傳播過程中基因組的不斷變異和深入系統(tǒng)的序列分析研究,一定還能發(fā)現(xiàn)其他促進(jìn)其病毒復(fù)制增殖的序列和位點(diǎn)。

3 宿主細(xì)胞功能的挖掘與改造

病毒的復(fù)制和增殖必須借助適當(dāng)細(xì)胞的代謝才能完成,因病毒對(duì)動(dòng)物的感染一般存在種屬特異性和組織特異性,同一病毒感染不同來源的同一種細(xì)胞也存在差異,因此病毒的體外培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞的種類和來源有要求,大多數(shù)病毒僅能在已知的一種或幾種細(xì)胞系中傳代培養(yǎng),而在其他細(xì)胞中適應(yīng)性較差或完全不適應(yīng)。

具體來說,通過宿主細(xì)胞來提高PCV2滴度的方法,首先,需要選擇最佳的細(xì)胞系,目前PCV2實(shí)驗(yàn)室研究和商業(yè)化滅活疫苗的生產(chǎn)主要是在PK-15細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng),其復(fù)制需要依賴于S期細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白和酶類[23]。除PK-15外,PCV2還可以在豬單核細(xì)胞(3D4/31)、豬睪丸細(xì)胞(ST)、豬小腸上皮細(xì)胞、豬氣管上皮細(xì)胞、牛外周血單核細(xì)胞等細(xì)胞中傳代復(fù)制[24-28]。其次,還可以進(jìn)一步從細(xì)胞系中篩選易感細(xì)胞株,傳統(tǒng)PK-15細(xì)胞系感染PCV2后細(xì)胞無病變,其病毒滴度僅為104～105TCID50/mL[29-30],姜平等[31-35]通過對(duì)PK-15細(xì)胞有限稀釋單克隆篩選獲得PCV2易感細(xì)胞株,使PCV2病毒滴度可達(dá)107TCID50/mL;所以就算是在不同來源的同一種細(xì)胞中增殖病毒也會(huì)因細(xì)胞的組成不均一而有所不同,如李基棕[36-37]發(fā)現(xiàn)Dulac細(xì)胞比PK-15細(xì)胞更適合嵌合型PCV1-2b的增殖。再次,通過人工改造現(xiàn)有細(xì)胞系也可提高PCV2病毒滴度,如PK-15細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染IFN-γ或IL-2等基因,并獲得能穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)細(xì)胞因子的PK-15細(xì)胞后,PCV2在該細(xì)胞中的病毒產(chǎn)量顯著增加[38-39];同樣的方法可從宿主的角度出發(fā),對(duì)一些篩選得到的與PCV2復(fù)制相關(guān)的宿主細(xì)胞因子進(jìn)行克隆或過表達(dá),通過調(diào)控原有宿主細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)PCV2與相關(guān)宿主因子相互作用,從而促進(jìn)病毒復(fù)制,如PK-15宿主蛋白G3BP1、alphaB-crystallin(CRYAB)、Elf4和ISCU的基因過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)PCV2的復(fù)制[40-42]。另外,崔紅杰[43]對(duì)豬口腔黏膜上皮細(xì)胞永生化后,再將PCV2在該細(xì)胞系進(jìn)行傳代培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生病變,病毒復(fù)制增殖能力高于PK-15細(xì)胞。

4 培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化與刺激

病毒的高效增殖首先需要對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化,如細(xì)胞營養(yǎng)配方、培養(yǎng)條件的優(yōu)化;另外細(xì)胞密度、病毒接種時(shí)機(jī)、接種劑量、培養(yǎng)時(shí)間、傳毒方法等培養(yǎng)工藝的優(yōu)化也能促進(jìn)病毒的增殖。如高睿等[44]對(duì)PCV2在PK-15規(guī)模化增殖工藝的研究表明,單層接毒、同步接毒以及帶毒傳代3種傳毒方法生產(chǎn)的PCV2病毒滴度均符合規(guī)程要求,但帶毒傳代生產(chǎn)效果顯著優(yōu)于其他2種工藝。樊銘玉等[45]發(fā)現(xiàn),與常規(guī)培養(yǎng)方法相比,PK-15細(xì)胞于43℃條件下熱應(yīng)激處理12 h,可顯著促進(jìn)嵌合PCV1-2在細(xì)胞內(nèi)的增殖。PCV2接種PK-15等上皮細(xì)胞后,病毒黏附細(xì)胞迅速但內(nèi)化比較緩慢,且呈時(shí)間依賴性,接毒后適當(dāng)延長PCV2的孵育時(shí)間可增加PCV2的感染效率[46]。延長PCV2在PK-15細(xì)胞上的培養(yǎng)時(shí)間,也可以獲得良好的病毒增殖效果[47]。這些都是最簡單和最有效的手段和方法,而且是進(jìn)一步提高病毒培養(yǎng)效果的基礎(chǔ)。

在環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞和病毒時(shí)刻接受著外部環(huán)境中各種理化因素的刺激,在此過程中細(xì)胞和病毒會(huì)不斷調(diào)整自身的代謝和功能來適應(yīng)變化后的新環(huán)境。因此,為了實(shí)現(xiàn)病毒的高效增殖,除了最優(yōu)化的培養(yǎng)環(huán)境之外,還需要找到能促進(jìn)病毒增殖的各種外部理化刺激信號(hào),并綜合加以利用,才能進(jìn)一步提高病毒滴度。從其促進(jìn)病毒增殖的機(jī)制方面進(jìn)行總結(jié),一般主要是通過作用于細(xì)胞或病毒本身,來調(diào)節(jié)細(xì)胞功能或病毒活性,如促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)化作用和促進(jìn)細(xì)胞增殖,以及通過影響細(xì)胞的氧化應(yīng)激和自噬等,進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制。

通過外源添加物刺激細(xì)胞,使病毒能更容易進(jìn)入細(xì)胞,促進(jìn)病毒內(nèi)化,增強(qiáng)病毒感染細(xì)胞的效率和數(shù)量,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)提高病毒滴度的方法。如經(jīng)D-氨基葡萄糖預(yù)處理的PK-15細(xì)胞,對(duì)病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核有著促進(jìn)作用,可大大增強(qiáng)病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率,細(xì)胞感染數(shù)量增加50倍[23,48]。Tween-20等各種非離子表面活性劑預(yù)處理PK-15細(xì)胞,可暫時(shí)改變PK-15細(xì)胞膜的物理性質(zhì)和表面形態(tài),從而增加PCV2對(duì)細(xì)胞的感染效率并提高病毒滴度[49]。氯化銨、二磷酸氯喹(chloroquine diphosphate,CQ)、莫能菌素(monensin)等溶酶體系統(tǒng)酸化抑制劑可促進(jìn)PCV2感染PK-15細(xì)胞的效率,可使細(xì)胞感染數(shù)量提高5～10倍,如聯(lián)合使用IFN-γ可使PCV2的產(chǎn)量增加50倍[50]。溶酶體系統(tǒng)酸化抑制劑能促進(jìn)PCV2感染豬上皮細(xì)胞(PK-15、SK、ST等),卻抑制PCV2對(duì)單核細(xì)胞3D4/31的感染[24,51]。IFN-α和IFN-γ的添加可促進(jìn)PCV2感染PK-15和3D4/31細(xì)胞的內(nèi)化作用,感染細(xì)胞數(shù)量增加3～7倍,且呈劑量依賴性[52]。

通過外源添加物的刺激來促進(jìn)細(xì)胞增殖,提高細(xì)胞密度和數(shù)量,也可實(shí)現(xiàn)提高病毒滴度。如外源性添加或內(nèi)源性表達(dá)IL-2均能刺激PK-15細(xì)胞的增殖,能顯著促進(jìn)PCV2的復(fù)制和提高病毒滴度[53]。刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)具有強(qiáng)力的促有絲分裂作用,能促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,選擇性激活抑制性T淋巴細(xì)胞。因此,ConA可刺激和促進(jìn)PCV2在外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中的復(fù)制,尤其是促進(jìn)PCV2在被處理后T淋巴細(xì)胞中的復(fù)制[54]。

一些刺激物能影響細(xì)胞的氧化應(yīng)激和自噬以及調(diào)節(jié)細(xì)胞功能,進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制,一定程度上也能提高病毒滴度。赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是由曲霉菌和青霉菌產(chǎn)生的霉菌毒素,能誘導(dǎo)體外和體內(nèi)細(xì)胞自噬促進(jìn)PCV2復(fù)制[55];通過H2O2處理誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,可使細(xì)胞培養(yǎng)物中被PCV2感染的細(xì)胞數(shù)量和基因拷貝數(shù)顯著增加,表明H2O2可以促進(jìn)PCV2在PK-15細(xì)胞中的復(fù)制[56],氧化應(yīng)激也可通過誘導(dǎo)自噬來促進(jìn)PCV2的復(fù)制[57];miRNA-98可調(diào)節(jié)免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控宿主免疫功能,幫助PCV2逃逸宿主免疫,促進(jìn)PCV2在3D4/21細(xì)胞中的復(fù)制[58]。

另外,可以考慮各種刺激物的聯(lián)合使用,可協(xié)同促進(jìn)PCV2的病毒復(fù)制,如ConA、甲基β環(huán)糊精(MβCD)和D-氨基葡萄糖聯(lián)合處理PK-15細(xì)胞,可顯著提高PCV2的產(chǎn)量,在病毒感染72 h后病毒滴度可達(dá)108.6TCID50/0.1 mL[59]。

5 展望

綜上所述,病毒體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞中病毒的增殖效果,與多種因素有關(guān),是細(xì)胞、病毒、環(huán)境、外源刺激物等因素綜合作用的結(jié)果,各因素之間可能相互協(xié)同又相互制約,如何才能實(shí)現(xiàn)病毒培養(yǎng)的高效增殖,還需要進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析和嘗試。

病毒的體外培養(yǎng)與病毒病原學(xué)、發(fā)病機(jī)制和疫苗開發(fā)等密切相關(guān),當(dāng)前存在危害的3種PCV中,僅有PCV2實(shí)現(xiàn)了病毒體外培養(yǎng),現(xiàn)有相關(guān)研究資料也最多,但現(xiàn)有的病毒增殖效果與其他類型疫苗病毒培養(yǎng)滴度水平還有較大差距,限制了PCV2滅活疫苗在養(yǎng)豬業(yè)的應(yīng)用,通過以上提高病毒滴度方法的總結(jié),希望能找到進(jìn)一步提高PCV2增殖效果的新方法,或綜合應(yīng)用多種手段和方法協(xié)同解決當(dāng)前PCV2體外培養(yǎng)過程中的一些問題。隨著PCV3和PCV4的相繼報(bào)道及其對(duì)公共衛(wèi)生安全的潛在威脅,也迫切需要實(shí)現(xiàn)PCV3和PCV4的體外細(xì)胞培養(yǎng),但目前這2種新發(fā)病原的體外培養(yǎng)均存在一些問題。PCV3的體外培養(yǎng)至今是一個(gè)難題,研究表明該病毒在PK-15中普遍存在傳代不穩(wěn)定[8,60],可能需要尋找其他更合適的宿主細(xì)胞系[61],或嘗試對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞系的改造。有韓國學(xué)者利用原代豬腎臟細(xì)胞進(jìn)行PCV3病毒培養(yǎng)的報(bào)道,但病毒滴度較低,且原代細(xì)胞不適合于規(guī)模化病毒增殖[62]。2022年首次報(bào)道PCV4感染性克隆拯救后可在PK-15細(xì)胞中傳代[11],但至今尚無自然毒株分離培養(yǎng)的報(bào)道。因4種PCV間相似的基因組結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性,可以借助PCV2體外培養(yǎng)技術(shù)的經(jīng)驗(yàn)和總結(jié),為PCV3和PCV4的體外增殖提供參考。

最后,相信隨著對(duì)各種PCV相關(guān)分子機(jī)制的深入研究和培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步,終將解決PCV體外高效增殖的問題,促進(jìn)PCV病原學(xué)和發(fā)病機(jī)制研究,助推相關(guān)疫苗產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用和疫病防控手段的技術(shù)進(jìn)步。