1株梅花鹿源化膿隱秘桿菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性分析

李俊鋒 ,趙自亮,朱桓奕,田宇森,王迎平,馮旭東,劉 霞,趙光偉,,張立武,楊曉偉,*

(1.西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,重慶 榮昌 402460;2.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心,貴州 貴陽550008;3.重慶三杰眾鑫生物工程有限公司,重慶 榮昌 402460)

化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes,TP),原稱化膿放線菌(Actinomycespyogenes)、化膿棒狀桿菌(Corynebacteriumpyogenes),屬于放線菌科(Actinomycetaceae)隱秘桿菌屬(Trueprerella),是一種無莢膜、無芽孢、無鞭毛、多形態(tài)的革蘭陽性短棒狀桿菌,兼性厭氧[1]。該菌于1893年首次在牛膿汁中分離到,目前在歐美、日本、巴西、中國等全球各地均有報道,其宿主范圍很廣,在家畜動物(如豬、牛、山羊)、野生動物(如大象、梅花鹿、麝香鹿等)以及伴侶動物(犬、貓等)均有報道[2-4]。該菌為條件性致病菌,是隱秘桿菌屬中致病力最強的成員[5],能引起動物發(fā)生心內(nèi)膜炎、肝膿腫、肺炎、乳房炎等多種組織器官膿腫以及流產(chǎn)、不孕等[6-7],給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失。

迄今,已證實化膿隱秘桿菌毒力基因主要包括溶血素(PLO)、神經(jīng)氨酸酶(NanA、NanP)、膠原結(jié)合蛋白(CbpA)和菌毛結(jié)合蛋白(FimA、FimC、FimE、FimG)。其中,PLO是一種外毒素,免疫原性強,為膽固醇依賴性溶細(xì)胞素家族的成員(cholesterol dpendent cytolysin,CDC)[8],能溶解多種動物的血細(xì)胞,是化膿隱秘桿菌最重要的1個致病因子[9],因PLO普遍存在于野生型的化膿隱秘桿菌菌株中,其特征在不同宿主源化膿隱秘桿菌中存在差異,因而是實驗室檢測以及細(xì)菌分型的常用靶標(biāo)[10]。

本試驗自重慶永川地區(qū)1只病死梅花鹿的肺臟組織中分離到疑似化膿隱秘桿菌的致病菌,進而對該菌進行系統(tǒng)的鑒定,并對其主要的生物學(xué)特性進行研究,以期為后續(xù)病原學(xué)研究和開發(fā)有效的生物制品提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料及實驗動物重慶永川某梅花鹿人工飼養(yǎng)場1只病死梅花鹿(18月齡),患病期間精神沉郁,食欲廢絕,鼻有膿性分泌物,剖檢其肺臟病變明顯,有出血壞死。SPF昆明鼠120只(20～25 g,雌性),購自重慶國家生物產(chǎn)業(yè)基地實驗動物中心。

1.2 主要試劑胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管及藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司;特級胎牛血清(FBS)和一管式臨床樣品DNA抽提試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司;2×Rapid Taq Master Mix和DL2000 Plus DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司;革蘭染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;引物合成及測序均由北京六合華大基因公司完成。

1.3 細(xì)菌分離無菌采集梅花鹿肺臟病變組織接種兔血TSA平板,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中5%CO2培養(yǎng)24～48 h,觀察生長狀況及菌落特征,并繼續(xù)傳代純化培養(yǎng)。挑取純化后的單個菌落接種于含有5%胎牛血清(FBS)的TSB培養(yǎng)基中進行增菌傳代,后加無菌甘油,凍存于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16S rDNA測序鑒定及同源性分析使用一管式臨床樣品DNA抽提試劑盒提取純培養(yǎng)細(xì)菌基因組,用于后續(xù)相關(guān)試驗。細(xì)菌16S rDNA通用引物見表1,反應(yīng)體系:2×Rapid Taq Master Mix 25 μL,上、下游引物各2 μL,基因組模板2 μL,加ddH2O補足至50 μL。反應(yīng)條件94℃ 3 min;94℃ 15 s,54℃ 15 s,72℃ 15 s,35個循環(huán);72℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的片段,送華大基因科技有限公司進行測序。測序結(jié)果在NCBI進行BLAST對比,并用DNAStar 7.0進行同源性分析。

1.5 分離菌革蘭染色及生化鑒定勾取細(xì)菌制作涂片,對其進行革蘭染色,觀察細(xì)菌形態(tài);純化菌接種15種生化發(fā)酵管(杭州天河微生物試劑有限公司)進行生化試驗,記錄結(jié)果。

1.6 分離菌的生長曲線挑取純培養(yǎng)單菌落接種于含5%FBS的TSB中37℃ 180 r/min培養(yǎng)36 h。將上述菌液按1%的比例接種于5 mL/管的TSB(5%FBS)中,設(shè)3個平行組,利用未接菌培養(yǎng)基做空白對照,37℃、220 r/min培養(yǎng),從0 h開始每隔2 h 取1組測定D600 nm值,連續(xù)監(jiān)測28 h,繪制該菌的生長曲線。

1.7 分離菌對小鼠的致病性試驗吸取純培養(yǎng)的菌液,0.2 mL/只(D600 nm=0.753)分別接種于小鼠皮下和腹腔,每組3只,觀察小鼠的存活情況,并對病死小鼠的心臟、肝臟、肺臟及皮下化膿灶進行細(xì)菌分離培養(yǎng);死亡小鼠迅速取其肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及皮下化膿灶固定于福爾馬林溶液,制作病理組織切片,HE染色觀察病理變化。

1.8 分離菌對小鼠毒力的測定78只小鼠隨機分為13組,每組6只,1～12組為感染組,分別經(jīng)腹腔接種不同濃度的分離菌,分離菌濃度稀釋參考趙明迪等[5]報道的方法;第13組為陰性對照組,僅注射等量生理鹽水。連續(xù)7 d觀察并記錄小鼠的發(fā)病情況與死亡情況,根據(jù)改良寇氏法計算該分離株的半數(shù)致死量(LD50)。

1.9 分離菌的藥敏試驗根據(jù)抗菌譜選取β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和四環(huán)素類共23種藥物,利用K-B紙片法進行藥敏試驗。

1.10 分離菌毒力基因檢測參考林昶等[10]的報道,針對化膿隱秘桿菌PLO、NanH、NanP、CbpA、FimA、FimC、FimE和FimG共8個主要毒力基因?qū)Ψ蛛x菌進行檢測,引物序列詳見表1。

1.11 分離菌PLO基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建PLO基因拼接后將其序列上傳至GenBank,將其氨基酸序列與牛、羊、犬、霍加狓等多種動物源化膿隱秘桿菌及其他相近屬細(xì)菌構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 本試驗使用的引物信息

2 結(jié)果

2.1 分離菌形態(tài)分離菌接種兔鮮血瓊脂平板培養(yǎng)48 h后,形成圓形、光滑、濕潤、隆起、邊緣整齊、直徑1 mm的白色半透明小菌落,菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明β溶血環(huán)(圖1A);在含5%FBS的TSB中時,37℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h,可見培養(yǎng)基輕度渾濁,試管底部出現(xiàn)少量白色絮狀沉淀;革蘭染色為陽性小桿菌,有兩極濃染的現(xiàn)象(圖1B),將該菌命名為YC-1。

2.2 生化鑒定結(jié)果YC-1能發(fā)酵木糖、蜜二糖、葡萄糖、棉子糖、阿拉伯糖、D-核糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖,不能發(fā)酵覃糖、枸櫞酸鹽、甘露醇、動力試驗陰性,MR和VP試驗均為陰性。

A.分離菌在兔血平板培養(yǎng)結(jié)果;B.分離菌革蘭染色結(jié)果(×1 000)

2.3 分離菌16S rDNA基因擴增及進化樹分析分離菌(YC-1)的16S rDNA擴增圖見圖2A。測序后經(jīng)BLAST比對顯示YC-1與各來源化膿隱秘桿菌同源性均在98%以上(圖2B),其中與分離自野豬、野牛、黃牛、狒狒、猞猁等動物化膿隱秘桿菌同源性為100%,可以確認(rèn)分離菌YC-1為化膿隱秘桿菌,這應(yīng)是國內(nèi)首次在此宿主分離到該菌。

A．YC-1株16S rDNA擴增電泳圖(M.DL2000 DNA Marker;1.PCR產(chǎn)物);B．YC-1株16S rDNA與其他動物源化膿隱秘桿菌的同源性比對結(jié)果

2.4 YC-1的生長曲線 化膿隱秘桿菌YC-1在37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至2 h時細(xì)菌增長數(shù)量不明顯,2～6 h 細(xì)菌生長開始加快,但此階段生長速率仍較低;從6～10 h細(xì)菌增長速率明顯加快,其生長曲線近似直線,此階段為YC-1的生長對數(shù)期;生長至24 h 細(xì)菌生長達到最高峰,此時D600 nm值為0.946,隨后細(xì)菌轉(zhuǎn)入平臺期至觀察期結(jié)束(28 h)。

2.5 YC-1對小鼠的致病性YC-1皮下和腹腔接種小鼠后均能引起小鼠發(fā)病,皮下注射小鼠在注射部位形成約2 cm的膿腫(圖3A),小鼠在感染后7 d死亡;腹腔注射小鼠在感染后3 d即發(fā)生死亡,剖檢可見小鼠肝臟、腎臟、脾臟出血腫脹,腹腔中布滿濃汁(圖3B)。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟細(xì)胞顆粒變性,壞死,細(xì)胞間質(zhì)中有大量滲出物(圖3C);脾臟白髓出血,淋巴細(xì)胞彌漫性增生(圖3D);肺泡壁結(jié)果較完整,肺泡腔中有少量漿液性滲出物,內(nèi)有炎性細(xì)胞(圖3E);腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞增生,并伴有中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(圖3F);化膿灶中有大量中性粒細(xì)胞以及壞死的淋巴細(xì)胞(變性壞死的白細(xì)胞),結(jié)締組織疏松或發(fā)生溶解,伴有出血(圖3G)。

2.6 YC-1對小鼠的半數(shù)致死量根據(jù)改良寇氏法計算出化膿隱秘桿菌YC-1對小鼠的LD50為 6.80×1010CFU/mL。

A.皮下注射形成膿包(紅色箭頭指示);B.腹腔感染后白色膿汁充斥腹腔(藍色箭頭指示);C.肝臟組織病變(×200);D.脾臟組織病變(×100);E.肺臟組織病變(×200);F.腎臟組織病變(×200);G.化膿灶組織病變(×100)

2.7 YC-1藥敏試驗結(jié)果藥敏結(jié)果顯示(表2),YC-1對氨芐西林、青霉素、卡那霉素、四環(huán)素4種藥物表現(xiàn)出不敏感,而對其藥物仍較為敏感,藥敏試驗詳細(xì)信息見表2。

表2 YC-1藥敏試驗結(jié)果

2.8 YC-1 毒力基因的檢測結(jié)果PCR擴增(圖4A)及測序結(jié)果顯示,YC-1菌株中具有2種神經(jīng)氨酸酶(NanH、NanP)、2種菌毛蛋白(FimA、FimE)和溶血素(PLO)共5個毒力基因,FimG、FimC和Cbpa 3個毒力因子未檢測到。對溶血素PLO基因的測序結(jié)果顯示其全長共1 605 bp,GC含量51.53%,共編碼534個氨基酸,相對分子質(zhì)量57.99 kDa,序列已上傳至GenBank,登錄號為OK513198。將YC-1菌PLO氨基酸序列與其他動物源化膿隱秘桿菌及相近種PLO序列構(gòu)建遺傳進化樹(圖4B),顯示YC-1與霍加狓(長頸鹿科動物)源化膿隱秘桿菌最為接近,與山羊、牛、豬等哺乳動物源化膿隱秘桿菌次之,與其他相近種細(xì)菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

盡管化膿隱秘桿菌是一種條件致病菌,但其致病力卻不容忽視,當(dāng)皮膚和黏膜出現(xiàn)機械損傷或其他病原感染時,該菌可迅速擴散至肺臟、肝臟、腎臟及其他組織器官,引起化膿性感染,繼而導(dǎo)致敗血癥導(dǎo)致動物死亡[11]。本試驗中分離的YC-1株就是1株典型的引起梅花鹿肺臟組織感染的致病菌,其臨床病理表現(xiàn)與牛、羊、駱駝等偶蹄獸相似。由于梅花鹿經(jīng)濟價值高,本試驗動物回歸未采用原動物,而以小鼠作為替代,發(fā)現(xiàn)該菌在不同的接種途徑下,既能導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生膿腫,又能使小鼠的主要臟器出血、水腫,腹腔中膿汁蓄積,能夠復(fù)制出與臨床相似的癥狀;進一步的組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)小鼠主要臟器產(chǎn)生壞死、出血和炎性細(xì)胞浸潤為主要特征的病變,這與以往的報道[12-13]一致,進一步的LD50試驗說明YC-1株為一株較高致病力菌株,這為后續(xù)開發(fā)化膿隱秘桿菌的生物制劑奠定了基礎(chǔ)。

A．YC-1株毒力基因檢測結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker,1～9.毒力基因FimE、Cbpa、FimG、FimA、NanH、NanP、FimC、PLOg1、PLOg2;B．YC-1株P(guān)LO氨基酸序列與其他動物源化膿隱秘桿菌及相近種的系統(tǒng)進化樹,紅色三角代表本試驗所分離的YC-1

細(xì)菌的致病力與其所攜帶的致病因子密切相關(guān),溶血素、神經(jīng)氨酸酶、膠原結(jié)合蛋白和菌毛結(jié)合蛋白是目前已經(jīng)證實的與化膿隱秘桿菌毒力相關(guān)的致病因子[14]。本試驗中YC-1株檢測到2種神經(jīng)氨酸酶(NanH,NanP)、2種菌毛蛋白(FimA,FimE)和溶血素(PLO)共5個毒力基因,其中PLO進化樹分析顯示與霍加狓源化膿隱秘桿菌最為接近,與其他動物源相對較遠(yuǎn)。根據(jù)以往的報道[12],PLO普遍存在于野生型化膿隱秘桿菌中,并且該基因的序列在不同宿主來源的菌株中會有所差別,本試驗結(jié)果充分證實了這一點,因此根據(jù)PLO信息推測菌株宿主來源是可行的,同時該基因也是臨床檢測的優(yōu)選靶點。

對于化膿隱秘桿菌的防控目前仍依賴于藥物的治療,篩選敏感的治療藥物是必由之路。本試驗中YC-1株表現(xiàn)出對多種抗生素均敏感,利用篩選出的敏感藥物對其他患病梅花鹿治療取得較好的治療效果。盡管如此,也不能忽視對該菌耐藥性的跟蹤監(jiān)測,以防過度使用藥物造成多重耐藥菌株的出現(xiàn)。此外,本試驗也對YC-1株在TSB培養(yǎng)基中的生長曲線進行了測定,其結(jié)果對了解化膿隱秘桿菌的生長特點,為后續(xù)開展發(fā)酵生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)參考。

綜上,本試驗在梅花鹿中分離到1株較強致病力的化膿隱秘桿菌,并對其主要的生物學(xué)特性進行了分析檢測,其結(jié)果有助于化膿隱秘桿菌的防控;鑒于該菌對家畜、野生動物、伴侶動物乃至人類均具有潛在的致病威脅,因此對其進行深入的致病機制進行研究,開發(fā)有效的預(yù)防制劑等工作是十分必要的。