不同產(chǎn)地蒙古黃芪莖葉UPLC指紋圖譜建立及化學(xué)模式識(shí)別研究

王強(qiáng)雄，郭 盛，李會(huì)偉，謝逸俊，尚爾鑫，段金廒

不同產(chǎn)地蒙古黃芪莖葉UPLC指紋圖譜建立及化學(xué)模式識(shí)別研究

王強(qiáng)雄，郭 盛*，李會(huì)偉，謝逸俊，尚爾鑫，段金廒*

南京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210023

建立蒙古黃芪莖葉UPLC指紋圖譜及含量測(cè)定方法，并對(duì)不同產(chǎn)地多個(gè)批次蒙古黃芪莖葉樣品進(jìn)行比較分析，為蒙古黃芪莖葉資源的利用與質(zhì)量控制提供參考。采用ACQUITYTMUPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm，建立蒙古黃芪莖葉指紋圖譜；采用電噴霧離子源-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF/MS）對(duì)共有峰進(jìn)行鑒定；同時(shí)建立其含量測(cè)定方法。結(jié)合聚類分析和主成分分析法，對(duì)不同批次蒙古黃芪莖葉進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。建立了蒙古黃芪莖葉UPLC指紋圖譜，共標(biāo)定了25個(gè)共有峰，并鑒定了其中13個(gè)色譜峰，均為黃酮類成分；建立了異槲皮苷、紫云英苷、異鼠李素-3--葡萄糖苷的含量測(cè)定方法；17批黃芪莖葉的相似度在0.933～0.987；通過聚類分析將樣品分為2大類；主成分分析與聚類分析結(jié)果一致。通過UPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法，建立了一種快速、有效的蒙古黃芪莖葉品質(zhì)評(píng)價(jià)方法，可為蒙古黃芪莖葉的資源化利用提供客觀依據(jù)。

黃芪；蒙古黃芪莖葉；品質(zhì)評(píng)價(jià)；異槲皮苷；紫云英苷；異鼠李素-3--葡萄糖苷；資源化利用

黃芪為我國(guó)常用大宗藥材，截至2019年，全國(guó)黃芪種植面積已超6.5萬(wàn)km2，年產(chǎn)量約7萬(wàn)t[11]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，作為黃芪藥材的主要基原植物，蒙古黃芪(Fisch.) Bunge var.(Bge.) Hsiao，每年在藥材的種植和采收過程中會(huì)產(chǎn)生近20萬(wàn)t的莖葉資源，長(zhǎng)久以來(lái)未得到有效利用，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[22]。事實(shí)上早在漢末的《名醫(yī)別錄》中就記載了黃芪莖葉具有“療渴及筋攣，癰腫疽瘡”的功效[33]；清代《本草正義》中也記載：“黃耆莖葉療渴，亦升清滋液之功。治筋攣者，亦稟溫和之性，而且有宣通絡(luò)詠之力也。其治癰腫疽瘡，則莖葉有外行性，乃能疏通氣血，而消腫化壅，與根之偏于補(bǔ)益者，固自有別耳”[44]?，F(xiàn)代研究表明，蒙古黃芪莖葉中含有黃酮類、皂苷類、多糖類等多種活性成分[55-66]，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、改善胃腸道功能等生物學(xué)作用[77-88]。近年來(lái), 人們逐漸發(fā)現(xiàn)蒙古黃芪莖葉資源的潛在價(jià)值，并已將其開發(fā)為茶飲[99]、功能性食品[1010]、畜禽飼料、中獸藥[1111]等產(chǎn)品，應(yīng)用于食品、保健品、畜禽養(yǎng)殖等多個(gè)領(lǐng)域。其中，蒙古黃芪莖葉作為飼料原料用于畜禽養(yǎng)殖，呈現(xiàn)出促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)繁殖、提高免疫性能、調(diào)節(jié)腸道健康等多種功能，并可改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)[1212]，是目前蒙古黃芪莖葉資源的主要利用形式。

隨著蒙古黃芪莖葉資源價(jià)值的逐漸發(fā)現(xiàn)和開發(fā)利用，有效保證其資源品質(zhì)、控制其產(chǎn)品質(zhì)量將成為蒙古黃芪莖葉資源可持續(xù)利用的重要環(huán)節(jié)，因此亟需建立其質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)方法。據(jù)此，本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法建立蒙古黃芪莖葉的指紋圖譜及含量測(cè)定方法，并采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-Q- TOF/MS）對(duì)共有峰進(jìn)行定性鑒別。結(jié)合聚類分析、主成分分析等化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)，探討不同產(chǎn)地蒙古黃芪莖葉的品質(zhì)差異。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），SynaptTMQ-TOF質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司），MassLynxTM4.1質(zhì)譜工作站軟件（美國(guó)Waters公司），Milli-Q超純水制備儀（美國(guó)Milli-pore公司），BSA224S-CN萬(wàn)分之一天平（德國(guó)賽多利斯公司），DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），MicroCL17R型高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司），KH-500型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

對(duì)照品異鼠李素-3--葡萄糖苷（批號(hào)CFS202102）購(gòu)自武漢天植生物技術(shù)有限公司；異槲皮苷（批號(hào)PRF8030703）、紫云英苷（批號(hào)PRF9072622）購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；山柰素（批號(hào)Y05J9H63012）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。乙腈和甲酸均為色譜純，均購(gòu)自德國(guó)Merck公司，超純水為實(shí)驗(yàn)室自制，其他化學(xué)試劑均為分析純（南化試劑公司）。17批黃芪莖葉樣品信息見表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bunge var.(Bge.) Hsiao的莖和葉。17批樣品均置于熱風(fēng)烘箱55 ℃烘干，粉碎后過40目篩，于陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同批次蒙古黃芪莖葉樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的異鼠李素-3--葡萄糖苷、異槲皮苷、紫云英苷、山柰素對(duì)照品適量，用甲醇分別配成質(zhì)量濃度為0.192、0.106、0.149、0.218 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取上述不同批次蒙古黃芪莖葉樣品粉末2.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入40 mL 75%乙醇，靜置30 min后室溫超聲（40 kHz）提取1 h，放至室溫后補(bǔ)足減失質(zhì)量，13 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITYTMUPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，95%～90% A；1～31 min，90%～75% A；31～36 min，75%～55% A；36～37 min，55%～20% A；37～38 min，20%～5% A；38～39 min，5%～95% A；體積流量0.4 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。

2.4 質(zhì)譜條件

ESI源；掃描方式：ESI+、ESI-模式；萃取電壓4.0 V；錐孔電壓30 V；毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑氣溫度400 ℃；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；錐孔氣流量50 L/h；碰撞能量6～40 eV，離子能量1 V；質(zhì)量掃描范圍100～1000。

2.5 UPLC指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算各色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果表明，各共有峰保留時(shí)間的RSD值均小于0.21%，峰面積的RSD值均小于2.73%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算各色譜峰保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果表明，各共有峰保留時(shí)間的RSD值均小于0.16%，峰面積的RSD值均小于2.82%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算各色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果表明，各共有峰保留時(shí)間的RSD值均小于0.28%，峰面積的RSD值均小于2.87%，說(shuō)明樣品在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.6 蒙古黃芪莖葉UPLC指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.6.1 指紋圖譜的建立及參照峰的確定 取17批蒙古黃芪莖葉樣品，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖，并導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（國(guó)家藥典委員會(huì)，2012.130723版），去除溶劑峰（0～3 min）及尾部雜峰（37～40 min），以S1分析得到的圖譜為參照?qǐng)D譜，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1，采用中位數(shù)法生成疊加指紋圖譜（圖1-A），采用多點(diǎn)校正，經(jīng)全譜峰匹配后生成對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果見圖1-B。在所有樣品圖譜中19號(hào)峰分離度良好，位置較為居中，峰面積較大且穩(wěn)定，因此選擇19號(hào)峰為參照峰。

2.6.2 共有峰的指認(rèn) 根據(jù)所有蒙古黃芪莖葉樣品的UPLC圖譜分析，指認(rèn)了25個(gè)共有峰（圖1-B），共有峰的峰面積之和大于90%。共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值在0～0.903%，相差較?。幌鄬?duì)峰面積的RSD值相差較大，在0～80.578%，表明不同批次蒙古黃芪莖葉中的化學(xué)成分含量差異較大。

3-異槲皮苷 6-紫云英苷 7-異鼠李素-3-O-葡萄糖苷 25-山柰素

2.6.3 共有峰的鑒定 通過UPLC-Q-TOF/MS分析，共鑒定出13個(gè)共有峰（表2），分別為異槲皮苷（峰3）、槲皮素-3--(6''--丙二?；?-β--葡萄糖苷（峰5）、紫云英苷（峰6）、異鼠李素---葡萄糖苷（7）、山柰酚-3--(6''--丙二?；?-葡萄糖苷（峰8）、異鼠李素-3--(6''--丙二?；?-葡萄糖苷（峰9）、沙苑子苷（峰10）、6''-丙二酸沙苑子苷單酯（峰13）、isorhamnetin-3--robinobioside-7--glucoside（峰14）、rhamnocitrin-3--β- neohesperidoside（峰17）、kaempferol-4￠-methylether- 3-β--glucoside（峰19）、kaempferol-4￠- methylether-3-β--malonylglucoside （峰21）、山柰素（峰25）。其中峰3、6、7、25經(jīng)對(duì)照品品指認(rèn)（圖1-C），其余共有峰通過質(zhì)譜信息結(jié)合參考文獻(xiàn)推測(cè)得出。通過紫外吸收特征可推測(cè)25個(gè)共有峰均為黃酮類化合物（最大吸收波長(zhǎng)在250 nm和350 nm附近）。從質(zhì)譜信息中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)多數(shù)化合物有162、146、308等糖基碎片離子掉落，因此可推測(cè)多為黃酮苷類化合物[1313]。此外，中性丟失、C環(huán)的重排和開裂得到的特征性碎片離子可以進(jìn)一步幫助推測(cè)環(huán)上的取代基以及苷元母核結(jié)構(gòu)[1414]。以峰10為例，其在負(fù)離子模式下有623.158 8的準(zhǔn)分子離子峰，可初步推測(cè)該化合物相對(duì)分子質(zhì)量為624，分子式為C28H32O16，碎片離子461.110 3是由其失去1個(gè)六碳糖基所得，再失去1個(gè)六碳糖基得到碎片299.055 0，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè)其為沙苑子苷。

表2 蒙古黃芪莖葉樣品UPLC指紋圖譜共有峰的鑒定

*表示通過對(duì)照品確認(rèn)

*means that confirmed by reference substance

已有研究顯示黃芪植物中分布著大量的丙二?；忘S酮苷類化合物[1515]。以峰8為例，其紫外吸收特征與紫云英苷（峰6）基本一致，在負(fù)離子模式下有533.108 8的準(zhǔn)分子離子峰，可初步推測(cè)該化合物相對(duì)分子質(zhì)量為534，分子式為C24H22O14，碎片離子489.101 1為其脫羧產(chǎn)生[M－H－CO2]?，碎片離子285.044 3則是準(zhǔn)分子離子失去1分子六碳糖基以及碎片86（推測(cè)其為丙二酰基）所得，因此推測(cè)該化合物為山柰酚-3--(6''--丙二?；?-葡萄糖苷。

此外，還有5個(gè)共有峰代表的化合物由于質(zhì)譜信息不足，暫時(shí)無(wú)法確定糖苷鍵的取代位置及糖的種類。分別為quercetin--hexoside-pentoside（峰1）、quercetin--hexoside-pentoside（峰2）、 isorhamnetin--hexoside（峰16）、isorhamnetin--malonyl-hexoside（峰18）、rhamnocitrin-- malonyl-neohesperidoside（峰20）。具體結(jié)果及質(zhì)譜信息見表2及圖2。

圖2 蒙古黃芪莖葉正離子(A) 和負(fù)離子(B) 模式下總離子流圖

2.6.4 相似度計(jì)算 以對(duì)照?qǐng)D譜為參照（設(shè)置為1），計(jì)算各批次樣品相似度，結(jié)果見表3。17批蒙古黃芪莖葉樣品的相似度在0.933～0.987，提示這17批蒙古黃芪莖葉樣品的化學(xué)成分組成基本相似。

2.7 3個(gè)主要成分含量測(cè)定

在前期實(shí)驗(yàn)中用對(duì)照品共比對(duì)出蒙古黃芪莖葉指紋圖譜共有峰中的4個(gè)峰，分別為異槲皮苷（峰3）、紫云英苷（峰6）、異鼠李素-3--葡萄糖苷（峰7）和山柰素（峰25），其中前3個(gè)成分含量相對(duì)較高，因此選擇這3個(gè)成分建立其含量測(cè)定方法并測(cè)定17批樣品中含量。

表3 17批蒙古黃芪莖葉樣品相似度分析結(jié)果

2.7.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的異槲皮苷、紫云英苷、異鼠李素-3--葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇配成質(zhì)量濃度分別為0.212、0.298、0.192 mg/mL的混合對(duì)照品溶液貯備液。

2.7.2 供試品溶液制備及色譜條件 供試品溶液制備方法同“2.2”項(xiàng)，色譜條件同“2.3”項(xiàng)。

2.7.3 線性關(guān)系考察 取適量混合對(duì)照品溶液貯備液，用甲醇稀釋成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（）。結(jié)果見表4，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系（均≥0.999 5）。

表4 蒙古黃芪莖葉3個(gè)成分線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.7.4 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分的峰面積，并計(jì)算RSD值。RSD值均小于0.74%，表明儀器精密性良好。

2.7.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析，記錄各色譜峰峰面積，并計(jì)算RSD值。RSD值均小于2.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，記錄各色譜峰的峰面積，并計(jì)算RSD值。RSD值均小于2.42%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取S1號(hào)樣品6份，每份1.0 g，按照對(duì)照品量-樣品中含量約1∶1的比例分別加入3個(gè)對(duì)照品粉末，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，記錄各色譜峰的峰面積，并計(jì)算回收率和RSD值。異鼠李素-3--葡萄糖苷、異槲皮苷、紫云英苷的加樣回收率分別為100.97%、102.34%、102.59%，RSD值均小于1.99%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.7.8 樣品含量測(cè)定 取17批蒙古黃芪莖葉樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，并根據(jù)線性回歸方程計(jì)算各樣品中3個(gè)成分的含量，結(jié)果見表5，17批樣品中異鼠李素-3--葡萄糖苷、異槲皮苷、紫云英苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.121 5～1.068 6、0.203 2～1.603 7、0.068 3～0.260 0 mg/g。不同產(chǎn)地蒙古黃芪莖葉中3個(gè)黃酮類成分含量無(wú)顯著差異，但不同生長(zhǎng)時(shí)期的樣品間存在較大差異，如甘肅岷縣產(chǎn)的2年生蒙古黃芪莖葉，9月底采收的樣品（S3）中異鼠李素-3--葡萄糖苷、異槲皮苷、紫云英苷含量分別為10月底采收樣品（S4）的2.1、2.8、1.5倍；10月上旬在甘肅宕昌縣采收的2年生蒙古黃芪莖葉（S7）中異鼠李素-3--葡萄糖苷、異槲皮苷、紫云英苷含量分別為3年生蒙古黃芪莖葉（S8）的2.0、1.8、1.3倍。

表5 17批蒙古黃芪莖葉樣品中3個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果

2.8 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.8.1 聚類分析 將17批蒙古黃芪莖葉的25個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用組間聯(lián)接的聚類方法，以平方歐氏距離為樣品間距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。從圖中可知，當(dāng)距離為25時(shí)，17批蒙古黃芪莖葉樣品可以分成2大類，產(chǎn)地為甘肅的S1、S2、S3、S5、S6、S7號(hào)樣品歸為I類，剩余的3個(gè)甘肅產(chǎn)樣品（S4、S8、S9）與其他2個(gè)產(chǎn)地的樣品歸為II類。當(dāng)距離為15時(shí)，I類樣品又可以分為a、b 2小類，其中S1號(hào)樣品為一類，S2、S3、S5、S6、S7號(hào)樣品分為一類。S1號(hào)樣品采收時(shí)間為7月，其余樣品則集中在9月下旬至10月，由此推測(cè)采收時(shí)間跨度大導(dǎo)致了S1號(hào)樣品與其他樣品出現(xiàn)差異。當(dāng)距離為5時(shí)，產(chǎn)地為內(nèi)蒙古的S10、S11、S12、S13號(hào)樣品可以分為一小類，甘肅產(chǎn)的S4、S8、S9號(hào)樣品與產(chǎn)地為寧夏的4個(gè)樣品為另一小類。造成部分甘肅產(chǎn)的蒙古黃芪莖葉樣品無(wú)法與寧夏產(chǎn)蒙古黃芪莖葉樣品區(qū)分開的原因可能是寧夏與甘肅在地理位置上相鄰，緯度相近，氣候條件相似，因此蒙古黃芪莖葉的品質(zhì)相對(duì)接近。以上結(jié)果表明聚類分析可在一定程度上區(qū)分不同產(chǎn)地蒙古黃芪莖葉，推測(cè)產(chǎn)地是引起蒙古黃芪莖葉出現(xiàn)質(zhì)量差異的重要因素之一，除產(chǎn)地因素外，采收時(shí)間等因素也會(huì)在一定程度上影響蒙古黃芪莖葉的質(zhì)量差異。

2.8.2 主成分分析 將17批蒙古黃芪莖葉樣品共有峰的峰面積結(jié)果導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，進(jìn)行主成分分析。以特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn)[2121]，得到3個(gè)主成分（PC1、PC2、PC3），PC1的方差貢獻(xiàn)率最高，為74%，PC2和PC3的貢獻(xiàn)率分別為9.5%和7.3%，三者累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)90.8%，可以解釋絕大部分變量信息。以PC1和PC2為坐標(biāo)軸建立坐標(biāo)系進(jìn)行投影，得到17批蒙古黃芪莖葉樣品的PCA得分散點(diǎn)圖（圖4），從圖中可以較為明顯地區(qū)分3個(gè)產(chǎn)地的蒙古黃芪莖葉樣品，這與聚類分析結(jié)果一致。此外，從圖中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地為甘肅的9個(gè)批次樣品較為分散，推測(cè)基于這9個(gè)批次樣品的采收時(shí)間（7、9、10月）和種植年限（1、2、3、3～10年）相差較大，由此提示蒙古黃芪莖葉的品質(zhì)可能與采收時(shí)間及種植年限相關(guān)。根據(jù)各個(gè)批次蒙古黃芪莖葉樣品的主成分得分，結(jié)合3個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率，可計(jì)算出各批次蒙古黃芪莖葉的綜合得分（乙醇），公式為綜=0.741＋0.0952＋0.0733，結(jié)果見表6。綜合得分越高，表明峰面積相對(duì)越大，對(duì)應(yīng)的成分含量相對(duì)越高[2222]。由結(jié)果可知，甘肅產(chǎn)蒙古黃芪莖葉排名靠前，寧夏產(chǎn)蒙古黃芪莖葉次之，而內(nèi)蒙古產(chǎn)蒙古黃芪莖葉排名較后。出現(xiàn)此差異的原因可能是內(nèi)蒙古平均緯度較高，入冬較早，蒙古黃芪地上部分提前枯萎，從而導(dǎo)致活性成分含量下降。在甘肅所有樣品中S4、S8、S9號(hào)樣品排名最后，其中S4號(hào)樣品采收時(shí)間為10月底，S8號(hào)樣品種植年限為3年，S9號(hào)樣品種植年限為3～10年。在寧夏的4個(gè)樣品中，S16號(hào)樣品排在最后，其采收時(shí)間也為10月底，再次提示蒙古黃芪莖葉的質(zhì)量可能與采收時(shí)間以及種植年限相關(guān)。

圖3 17批蒙古黃芪莖葉樣品聚類分析樹狀圖

圖4 17批蒙古黃芪莖葉樣品PCA得分圖

表6 17批蒙古黃芪莖葉樣品主成分得分和綜合得分

3 討論

在黃芪藥材的種植及采收過程中，大量的莖葉資源常被遺棄或者就地焚燒，造成資源浪費(fèi)。近年來(lái)，蒙古黃芪莖葉的資源價(jià)值逐步被發(fā)現(xiàn)，并被開發(fā)為茶飲、功能性食品、畜禽飼料及中獸藥等產(chǎn)品，但由于缺少質(zhì)量控制方法，導(dǎo)致其原料質(zhì)量參差不齊。為建立蒙古黃芪莖葉質(zhì)量控制方法，本研究通過考察提取溶劑、提取方式、料液比、流動(dòng)相體系、檢測(cè)波長(zhǎng)等條件，首次建立了蒙古黃芪莖葉UPLC指紋圖譜及含量測(cè)定方法，并對(duì)指紋圖譜共有峰進(jìn)行了定性鑒別。同時(shí)結(jié)合聚類分析、主成分分析等化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)，進(jìn)一步分析了不同產(chǎn)地、不同批次蒙古黃芪莖葉樣品間的化學(xué)組分差異。

本課題組前期研究[6]及文獻(xiàn)報(bào)道[2323]顯示，蒙古黃芪莖葉中次生代謝產(chǎn)物以黃酮類成分居多，且含量高于皂苷類、酚酸類等化學(xué)成分。據(jù)此，本研究選擇黃酮類成分作為蒙古黃芪莖葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)。本研究從蒙古黃芪莖葉中共鑒定出13個(gè)黃酮類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中包括5個(gè)丙二?；S酮類化合物。有研究表明，多種豆科植物可以通過連接丙二?；鶃?lái)儲(chǔ)存不易溶解的黃酮苷或苷元類成分，當(dāng)植物細(xì)胞受到侵害時(shí)易水解其儲(chǔ)存形式釋放苷或苷元[2424]，且在提取過程中，丙二?；S酮苷及其水解后的黃酮苷總量不會(huì)發(fā)生明顯變化[2525]。上述研究結(jié)果提示可以其總量來(lái)評(píng)價(jià)蒙古黃芪莖葉的質(zhì)量。同時(shí)，采用聚類分析和主成分分析對(duì)17批蒙古黃芪莖葉樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從一定程度上區(qū)分了內(nèi)蒙古、甘肅以及寧夏3個(gè)產(chǎn)地的蒙古黃芪莖葉，并推測(cè)產(chǎn)地、采收時(shí)間等因素均會(huì)對(duì)蒙古黃芪莖葉的聚類結(jié)果產(chǎn)生影響，但限于樣本數(shù)量及代表性有限，相關(guān)結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，發(fā)現(xiàn)甘肅產(chǎn)蒙古黃芪莖葉質(zhì)量較優(yōu)，內(nèi)蒙古產(chǎn)蒙古黃芪莖葉質(zhì)量稍差，推測(cè)這可能與地理位置以及氣候等環(huán)境因素相關(guān)。目前，人工栽培的蒙古黃芪種植年限多為2年，采收時(shí)間為9月下旬至10月上旬，本研究發(fā)現(xiàn)采收時(shí)間晚于藥材采收期、種植年限超過2年均會(huì)對(duì)蒙古黃芪莖葉的質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，具體表現(xiàn)為黃酮類成分含量顯著下降。提示在利用蒙古黃芪莖葉資源時(shí)，應(yīng)在采收1年生、2年生黃芪根部后及時(shí)收集其莖葉，避免資源的低效利用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速、穩(wěn)定的蒙古黃芪莖葉品質(zhì)評(píng)價(jià)及含量測(cè)定方法，為蒙古黃芪莖葉資源的精細(xì)化利用和開發(fā)提供了客觀依據(jù)，并為控制和評(píng)價(jià)蒙古黃芪莖葉品質(zhì)提供了參考。同時(shí)，后續(xù)研究還可基于蒙古黃芪莖葉指紋圖譜信息與其生物學(xué)活性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，通過譜-效關(guān)系分析建立反映其內(nèi)在質(zhì)量的品質(zhì)評(píng)價(jià)方法[2626]。此外，本研究主要以黃酮類成分為依據(jù)對(duì)蒙古黃芪莖葉進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，后續(xù)可結(jié)合蒙古黃芪莖葉中的皂苷類、多糖類等其他活性成分，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on establishment of UPLC fingerprints and chemical pattern recognition of the stems and leaves ofvar.(Bge.) Hsiao from different regions

WANG Qiang-xiong, GUO Sheng, LI Hui-wei, XIE Yi-jun, SHANG Er-xin, DUAN Jin-ao

National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources Recycling Utilization, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing, 210023, China

To establish the UPLC fingerprint and content determination method of the stems and leaves ofvar.（Bge.）Hsiao(SLAM), and to compare and analyze multiple batches of SLAM from different origins, so as to provide reference for the utilization and quality control of SLAM resources.ACQUITYTMUPLC BEH C18column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) was used. Mobile phase was 0.1% formic acid water and acetonitrile, gradient elution, detection wavelength was 350 nm; The common peaks were identified by electrospray ion source-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (ESI-Q-TOF/MS); At the same time, the content determination method was established. Cluster analysis and principal component analysis were used to evaluate the quality of SLAM of different batches.The UPLC fingerprint of SLAM was established, 25 common peaks were calibrated, and 13 chromatographic peaks were identified, all of which were flavonoids; The content determination method of isoquercitrin, astragalin and isorhamnetin-3--glucopyranoside was established; The similarities of 17 batches of SLAM were in the range of 0.933—0.987. The samples were divided into two categories by cluster analysis. The results of principal component analysis and cluster analysis are consistent.A rapid and effective method for quality evaluation of SLAM was established by UPLC fingerprint and chemical pattern recognition method, which can provide objective basis for the resource utilization of SLAM.

Radix Astragali; stems and leaves ofvar.; quality evaluation; resource utilization; isoquercitrin; astragalin; isorhamnetin-3--glucopyranoside

R286.2

A

0253 - 2670(2023)13 - 4312 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.024

2022-12-09

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（ZYYCXTD-D-202005）；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302）；寧夏重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017BY079）

王強(qiáng)雄（1997—），男，碩士研究生，從事中藥資源化學(xué)與資源循環(huán)利用研究。E-mail: wqx0906@163.com

通信作者：郭 盛，副研究員。E-mail: guosheng@njucm.edu.cn

段金廒，教授。E-mail: dja@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]