人參PgWRKY22基因的克隆及在磷脅迫下的表達分析

梁 浩，孫 海，邵 財，錢佳奇，張亞玉, 2*

? 藥材與資源?

人參基因的克隆及在磷脅迫下的表達分析

梁 浩1，孫 海1，邵 財1，錢佳奇1，張亞玉1, 2*

1. 中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 長春 130112 2. 成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106

克隆人參轉錄因子基因，進行生物信息學、亞細胞定位及外源磷脅迫表達分析。根據(jù)人參轉錄組數(shù)據(jù)庫設計特異性引物，PCR擴增全長cDNA序列，命名為，并對其進行生物信息分析；構建綠色熒光融合表達載體PgWRKY22-eGFP，利用農桿菌侵染煙草葉片的瞬時表達法分析亞細胞定位；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測在人參組織中的表達特異性以及在外源磷作用下的表達模式。人參轉錄因子基因的cDNA序列為975 bp，編碼324個氨基酸；PgWRKY22蛋白屬于WRKY超家族蛋白，具有典型的WRKY結合域，該蛋白不穩(wěn)定，屬于親水性蛋白，無規(guī)則卷曲為主要組成部分；PgWRKY22蛋白與丹參SmWRKY、葡萄VvWRKY22、長春花CrWRKY22、獨腳金SaWRKY27蛋白具有較高的同源性，與西洋參PqWRKY1、PqWRKY2，人參PgWRKY1、PgWRKY3、PgWRKY4具有較近的系統(tǒng)發(fā)育關系；亞細胞定位顯示PgWRKY22定位于細胞核上；qRT-PCR表明在人參的側根和主根中表達較高，在葉和莖中次之；在外源磷濃度為2 mmol/L下的表達顯著高于其他磷濃度下的表達?？寺～@得的cDNA序列及表達信息，可為后續(xù)進行基因功能鑒定和人參栽培的磷營養(yǎng)調控提供參考。

人參；轉錄因子；生物信息學；亞細胞定位；表達分析

人參C. A. Meyer為五加科多年生草本植物，具有“百草之王”的美譽，作為珍貴的藥用植物在中國、韓國、日本等國頗受歡迎。人參的生物活性成分包括皂苷、多糖、多肽等，其中人參皂苷作為人參的主要活性成分，由于其獨特的藥理功效及在保健食品中的應用潛能，目前已被廣泛研究[1]。人參的有效成分為次生代謝產物，其生物合成和積累過程受到植物生長環(huán)境中各種生物和非生物脅迫的調節(jié)[2]。在這些環(huán)境脅迫中，植物體內的相關基因會啟動表達，以此來適應逆境[3]。

轉錄因子在植物應對各種生物和非生物脅迫的響應中發(fā)揮著關鍵作用[4]。WRKY是一類重要的轉錄因子，廣泛參與植物的發(fā)育和逆境響應[5]。WRKY蛋白在N端含有保守的WRKYGQK延伸，在C端含有鋅指基序Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC[6]。WRKY根據(jù)其結構可分為3類（I、II和III）[7]。WRKY蛋白通過與啟動子區(qū)域的W-box元件（T）TGAC（C/T）特異性結合來調控靶基因的轉錄，這些序列元件（T）TGAC（C/T）包含響應生物脅迫轉錄反應的TGAC核心序列，所以TGAC核心序列被認為是在啟動子區(qū)域響應植物參與防御相關基因的啟動表達。大量的體內和體外結合實驗已證明WRKY結構域和W-box之間的相互作用以響應植物生長發(fā)育和各種生物或非生物脅迫反應。隨著高通量技術的發(fā)展，在植物中參與生長發(fā)育和逆境響應的WRKY型轉錄因子已從多種植物中鑒定出來，其中擬南芥中有74個，水稻中有103個，雙穗短柄草中有86個，大豆中有197個，菠蘿中有54個[8]。此外，WRKY型轉錄因子參與植物生長發(fā)育和逆境響應的機制也被進一步研究。例如，在擬南芥中，可以部分介導GA3對擬南芥開花時間和次生壁形成的調控作用[9-11]；、、、參與葉片衰老的調控[8, 12-14]。在水稻中，通過調節(jié)下游靶基因正向調控水稻的耐寒性[15]。在葡萄中，過表達系在鹽脅迫下具有較高的抗氧化活性和較低的活性氧含量，從而增強了其對鹽脅迫的抗性[16]。在大豆的全基因組鑒定中發(fā)現(xiàn)，66個響應鹽脅迫的表達模式不同，其中12個無顯著變化，35個下調，19個上調[17]。

磷是植物必需的大量營養(yǎng)元素，在植物中參與多種代謝過程，對其生長發(fā)育起著至關重要的作用。植物對磷環(huán)境的適應包括形態(tài)生理基礎和基因表達調控[18]。例如，磷轉運體的調控，氨基酸及衍生物、類黃酮、磷酸酶的分泌以及根結構的改變[19]。磷的代謝途徑受多種基因調控，在不同的磷條件下，這些基因的表達也不同[20]。如在水稻中，低磷反應的主要轉錄調節(jié)因子OsPHR2（phosphate starvation response 2）通過激活磷饑餓誘導的基因（phosphate transporter 1）與基因啟動子區(qū)域中的P1BS（PHR1結合序列：GNATATNC）基序結合[21-22]，以此來調控對磷環(huán)境的適應[23-28]。也有研究在玉米[29]、大豆[30]、黑麥草[31]、大麥[32-33]和小麥等作物中分析了植物對磷脅迫反應的分子機制[34]。由于WRKY型轉錄因子具有W-box（含TTGAC序列）的蛋白特異識別元件，因此，在磷脅迫下也發(fā)現(xiàn)該類轉錄因子能夠與磷轉運相關基因啟動子的W-box相結合，進而參與調控植物磷脅迫響應。在擬南芥中，、均能與基因啟動子結合，進而參與磷脅迫響應；AtWRKYb、AtWRKYc、AtWRKY28 也參與 AtPHO1基因的表達調控，以響應磷饑餓過程；At WRKYd、AtWRKYe、AtWRKY42、At WRKY45等還可通過與磷轉運體PHT1；1或PHT1；4的互作，參與擬南芥低磷脅迫的誘導響應[35-37]。此外，在水稻中過表達OsWRKY21和OsWRKY108能顯著增加低磷脅迫條件下水稻體內磷的積累量，而將這2個基因突變則使水稻體內磷積累量顯著減少[38]。水稻的OsWRKY75也有類似的功能，過表達OsWRKY75不僅能顯著提高水稻對磷饑餓的耐受性，且使水稻根系和地上部的生物量以及磷含量均高于野生型[39]。鑒于WRKY在響應磷脅迫中的重要作用，本研究進行基因克隆，分析其亞細胞定位、組織表達及磷脅迫表達特征，為進一步研究WRKY型轉錄因子應答人參營養(yǎng)脅迫的分子機制提供科學依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料

二年生人參苗采自人參主產區(qū)吉林省撫松縣人參種植基地，經中國農業(yè)科學院特產研究所張亞玉研究員鑒定為五加科草本植物人參C. A. Meyer。

1.2 試劑、載體及菌株

RNAsimple Total RNA Kit試劑盒（天根生物科技有限公司）；FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒（天根生物科技有限公司）；2×Trans Taq?High Fidelity（HiFi）PCR SuperMixII（北京全式金生物科技有限公司）；TIANgel Midi Purfication Kit試劑盒（天根生物科技有限公司）；pEASY ?-T5 Zero Cloning Kit試劑盒（北京全式金生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

將從種植基地所采的人參苗置于實驗室的智能人工氣候室（溫度20，光照2000 lx）內使用不同磷濃度的霍格蘭氏營養(yǎng)液進行水培，設置5個磷濃度水平處理：P0（0 mmol/L）、P1（0.5 mmol/L）、P2（1.0 mmol/L）、P3（2.0 mmol/L）、P4（4.0 mmol/L），每個處理3次重復，將人參苗水培至第8周1次性取樣。

2.2 RNA提取與純化

參照天根的RNAsimple Total RNA Kit試劑盒提取樣品總RNA并純化，采用微量核酸蛋白儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。反轉錄參照天根生物有限公司的FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒說明進行。

2.3 PgWRKY22基因的克隆及測序

基于本實驗室前期經高通量測序所得的轉錄組數(shù)據(jù)庫，篩選出基因為模板，利用DNAMAN和Primer Premier 6軟件設計擴增引物（PgWRKY22-F：5’-ATGGGAGAATTTGTTAGTAT- GGAG-3’，PgWRKY22-R：5’-TTACCTAAAAT- GTTCCGTAGAGCA-3’）。以人參根莖cDNA為模板，配制反應體系：12.5 μL 2×Trans Taq ?High Fidelity（HiFi）PCR SuperMixII，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，9.5 μL的ddH2O。PCR擴增反應程序為：95 ℃預變性4 min；95 ℃、30 s，51 ℃、30 s，72 ℃、90 s，進行35個循環(huán)；72 ℃、7 min。反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠純化回收PCR產物，使用pEASY ?-T5 Zero Cloning Kit試劑盒將目的片段連接到T5載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞涂板，挑取陽性菌株提取質粒送上海生工測序。

2.4 PgWRKY22基因的生物信息分析

將基因編碼的氨基酸序列分別提交到NCBI和Protparam上在線分析其理化性質；SOPMA分析蛋白二級結構；采用SWISS-MODEL在線工具進行三維同源建模；TMHMM在線預測跨膜結構域；SMART在線分析保守結構域；利用DNAMAN軟件對PgWRKY22與其他物種WRKY蛋白的氨基酸序列進行同源性分析；利用MEGA6.0軟件構建PgWRKY22蛋白家族的系統(tǒng)進化樹。

2.5 PgWRKY22基因的亞細胞定位

根據(jù)基因的CDS區(qū)設計含有EcoRI和XbaI酶切位點的引物（PgWRKY22-EcoRIF：5’-CATGGGAGAATTTGTTAGTA-3’；PgWRKY22-XbaIR：5’-CGCCTAAAATG- TTCCGTAGAG-3’；劃線部分為酶切位點），通過同源重組方法連接至pCAMBIA2300-35S-eGFP載體的EcoRI和XbaI酶切位點之間，獲得重組質粒pCAMBIA 2300-35S-eGFP-PgWRKY22，然后連接pEASY ?-T5載體轉化大腸桿菌涂板，挑取陽性克隆進行測序驗證。將測序正確的載體通過農桿菌GV3101介導注射煙草葉片，空載體作為對照同時注射煙草，然后將注射的煙草葉片制作成玻片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察eGFP信號。

2.6 PgWRKY22基因的組織及磷脅迫表達分析

使用LightCycler?96實時熒光定量PCR儀（瑞士）分析基因在人參不同組織中及磷脅迫下的表達模式。依據(jù)的CDS區(qū)設計qRT-PCR特異性引物（PgWRKY22q-F：5’-TCATTCGGTTCACTGGATTACA-3’；PgWRK- Y22q-R：5’-GCTCATCTAACTCATCCACAAG-3’），以為內參基因（GAPDH-F：5’-ATGGA- CCATCAGCAAAGGAC-3’；GAPDH-R：5’-GGT- AGCACTTTCCCAACAGC-3’）。反應體系為：FastStart Universal 2×SYBR Green（金佰特；北京）12.5 μL，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），cDNA模板1 μL，10.5 μL的dd H2O，同時以1μL的dd H2O代替模板作為陰性對照。反應程序：94 ℃、2 min；94 ℃、15 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s，進行40個循環(huán)；72 ℃、7 min。每個樣品分別設置3次技術性和生物學重復，采用2?ΔΔCt法[40]計算相對表達水平。

3 結果與分析

3.1 PgWRKY22基因的克隆及序列分析

基于實驗室測序得到的轉錄組數(shù)據(jù)庫設計擴增引物，以反轉錄的cDNA做模板進行PCR擴增，得到的擴增條帶（圖1）。將PCR產物切膠純化回收并連接到pEASY?-T5載體，轉化提質粒測序顯示：基因的全長為975 bp，編碼324個氨基酸（圖2）。

M-Marker 1-PgWRKY22回收條帶

方框分別代表起始密碼子和終止密碼子

3.2 PgWRKY22基因的生物信息學分析

3.2.1 PgWRKY22編碼蛋白的理化性質及結構分析 將PgWRKY22編碼的氨基酸序列分別提交到NCBI和Protparam上進行在線分析，結果顯示其編碼的蛋白屬于WRKY超家族蛋白，具有WRKY DNA結合域（圖3-A）。PgWRKY22編碼蛋白的相對分子質量為36 539.53，理論等電點為5.17，分子式為C1616H2465N431O518S10，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為49.75，屬于不穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為64.69，總平均親水性為?0.632，屬于親水性蛋白。SOPMA在線分析顯示，PgWRKY22編碼蛋白的二級結構包含85個α螺旋（25.63%），209個無規(guī)則卷曲（64.51%）、18個折疊形態(tài)延伸鏈（5.56%）以及12個β轉角（3.70%），無規(guī)則卷曲是主要組成部分（圖3-B）。利用SWISS-MODEL在線建立PgWRKY22蛋白的三維結構模型（圖3-C）。TMHMM在線預測PgWRKY22蛋白的跨膜結構域顯示該蛋白不含跨膜區(qū)域，屬于非跨膜蛋白（圖4-A）。SMART在線分析發(fā)現(xiàn)PgWRKY22蛋白具有2個結構域，分別是組成復雜性較低域和WRKY域（圖4-B）。

3.2.2 PgWRKY22編碼蛋白的同源性及系統(tǒng)進化樹分析 將編碼蛋白序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫與其他植物的WRKY蛋白序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)PgWRKY22蛋白與丹參Bunge（AKA27922.1）、葡萄L.（RVX04199.1）、長春花(L.) G. Don（AFK88675.1）和獨腳金(L.) Kuntze.（GER33041.1）中的WRKY蛋白具有較高的同源性（圖5-A）。將PgWRKY22與人參和西洋參中的WRKY蛋白進行進化樹分析顯示，PgWRKY22蛋白與西洋參PqWRKY1、PqWRKY2，人參PgWRKY1、PgWRKY3、PgWRKY4具有較近的系統(tǒng)發(fā)育關系，與人參PgWRKY2，西洋參PqWRKY5、PqWRKY8關系較遠（圖5-B）。

圖3 PgWRKY22編碼蛋白的二級結構(A，B) 及三級結構預測(C)

3.3 PgWRKY22蛋白的亞細胞定位

為了確定該蛋白在細胞中的分布情況，構建pCAMBIA2300-35S-eGFP-PgWRKY22載體，并通過根癌農桿菌介導煙草葉片的瞬時轉化體系，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)eGFP-PgWRKY22融合蛋白在細胞核內具有明顯的GFP信號（圖6-A），對照組pCAMBIA2300-35S-eGFP載體在整個細胞中均能觀察到GFP信號（圖6-B），初步表明PgWRKY22蛋白定位在細胞核上。

圖4 PgWRKY22編碼蛋白的跨膜結構域(A) 和保守結構域分析(B)

3.4 PgWRKY22基因的組織表達及磷脅迫表達分析

為進一步分析的表達模式，采用天根的RNAsimple Total RNA Kit試劑盒提取人參的主根、側根、莖、葉以及不同磷處理的側根組織的RNA，反轉錄為cDNA后作為模板，通過qRT-PCR技術檢測在不同組織和不同磷濃度下的表達量。實驗結果表明，在人參的主根、側根、莖和葉組織中均有表達，但表達存在明顯的差異，在側根和主根中的表達量最高，其次是葉，在莖中的表達量最低（圖7-A）。在外源磷處理下，各部位在P3（2.0 mmol/L）濃度下表達量最高，P4（4.0 mmol/L）濃度下次之，在P0（0 mmol/L）、P1（0.5 mmol/L）和P2（1.0 mmol/L）濃度下表達量相對較低（圖7-B）。

4 討論

植物在生長發(fā)育過程中會遭受各種生物或非生物脅迫，這些環(huán)境脅迫會影響植物體內的轉錄和代謝過程，尤其在藥用植物中會影響有效成分的形成和積累，而植物為了避免和緩解各種脅迫，便會啟動一系列的基因進行表達調控，在這些調控中，WRKY型轉錄因子發(fā)揮了重要作用。本研究通過人參轉錄組數(shù)據(jù)庫克隆了一個人參WRKY型轉錄因子基因，該基因編碼324個氨基酸，具有典型的WRKY保守結構域，該基因編碼蛋白與丹參、葡萄、長春花和獨腳金中的WRKY家族蛋白成員具有較高的同源性，而目前在丹參和葡萄中也有較多關于WRKY型轉錄因子的研究，如丹參SmWRKY14、SmWRKY40、SmWRKY44等[41-43]；葡萄VvWRKY54、VvWRKY48等[44-45]。

圖5 PgWRKY22與其他植物氨基酸序列比對(A) 和進化樹分析(B)

A-pCAMBIA2300-35S-eGFP-PgWRKY22載體 B-pCAMBIA2300-35S-eGFP載體

已有研究從人參中鑒定并克隆了9個WRKY型轉錄因子（PgWRKY1～9），并確定了這9個WRKY型轉錄因子在水楊酸、脫落酸、NaCl和茉莉酸甲酯處理下的表達模式[46-47]?；谶M化樹分析呈現(xiàn)的PgWRKY22蛋白與PgWRKY1、PgWRKY3、PgWRKY4具有較近的系統(tǒng)發(fā)育關系，比較了PgWRKY22蛋白與PgWRKY1、PgWRKY3、PgWRKY4在鹽脅迫下的表達特征，即使用磷酸鹽處理能誘導的表達，這與使用NaCl處理誘導、、的表達結果相似，但前人研究還表明茉莉酸甲酯處理能下調、、的表達，因此，當植株受到鈉鹽或磷酸鹽脅迫時，通過茉莉酸甲酯處理可能是一種有效的緩解途徑，但這仍然需要進一步的實驗去證實。

不同字母表示經多重t檢驗分析各組間差異顯著（P＜0.05）

WRKY型轉錄因子是一種細胞核靶向蛋白且具有組織特異性[48-49]。在人參中已鑒定了1個WRKY型轉錄因子，亞細胞定位表明PgWRKY1定位于細胞核，是一種核定位蛋白，在各種組織中的表達分析表明，與葉、莖和種子相比，它優(yōu)先在側根和根中表達[46]。本研究結果也顯示，PgWRKY22屬于一種核定位蛋白，并與PgWRKY1具有較近的系統(tǒng)進化關系，且在側根和主根中的表達優(yōu)先于在葉和莖中的表達。這些結果顯示在各種組織中廣泛表達，表明它可能在人參器官組織的多個發(fā)育階段發(fā)揮調節(jié)作用，且可能對人參的高價值根具有重要意義。

基因表達分析是了解基因可能的生物學功能所必需的[50]。磷已被證明影響許多基因的表達，調節(jié)植物的多種發(fā)育過程以及植物對逆境的反應。最典型的便是（無機磷酸鹽轉運蛋白1）基因，在擬南芥中，AtPHT1、AtPHT5在衰老葉片的維管束韌皮部中表達，介導磷從源向庫器官的再分配[51-52]。除了基因，在高等植物中，許多轉錄因子也參與了磷信號途徑，如擬南芥中的、、，水稻中的、、等[39, 53-55]。此外，WRKY型轉錄因子也被報道參與低磷脅迫響應，在擬南芥中有、、、，在水稻中有[56-60]。本實驗研究了的表達譜是否與磷脅迫有關，根據(jù)研究結果顯示，轉錄本的表達在P3（2.0 mmol/L）和P4（4.0 mmol/L）磷濃度下顯著上調，且表達從P0（0 mmol/L）濃度至P3（2.0 mmol/L）濃度呈上升趨勢，從P3（2.0 mmol/L）濃度至P4（4.0 mmol/L）濃度呈下降趨勢。這與擬南芥和水稻等植物中低磷誘導相關WRKY型轉錄因子表達上調相比，似乎呈現(xiàn)出一種相反的趨勢，因此，推測可能是一個高磷誘導表達的轉錄本，而不是受低磷誘導，但這仍需要進一步通過基因功能研究去證實。

綜上所述，本研究克隆了1個人參WRKY型轉錄因子基因，該基因主要在人參根中表達，且編碼的蛋白可能參與磷脅迫相關途徑。雖然的基因功能仍需要進一步通過實驗驗證，但本研究可為深入探究該基因參與人參代謝途徑中元素轉運的分子機制提供理論基礎，同時也為在人參健康栽培中開展營養(yǎng)調控提供重要參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Molecular cloning offromand its expression in response to external phosphorus supply

LIANG Hao1, SUN Hai1, SHAO Cai1, QIAN Jia-qi1, ZHANG Ya-yu1, 2

1. Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China 2. College of Pharmacy and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China

To clone a transcription factor genefromfollowed by bioinformatics, subcellular localization and expression in response to external phosphorus supply were performed.According totranscriptome database to design the specific primer, by PCR to amplify the cDNA sequence of, which was named as, and its bioinformatics was analyzed. Enhanced green fluorescent protein (eGFP) fused expression vector PgWRKY22-eGFP was constructed and subcellular localization of PgWRKY22 was observed bytransient expression method in tobacco. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression specificity ofin plant tissues and its expression in response to external phosphorus supply.The cDNA sequence of thetranscription factor genewas 975bp, encoding 324 amino acids; PgWRKY22 protein was a WRKY superfamily protein with a typical WRKY binding domain. It was an unstable hydrophilic protein with random coils as its main component; PgWRKY22 protein has high homology withSmWRKY,VvWRKY22,CrWRKY22,SaWRKY27 protein, and has a close phylogenetic relationship withPqWRKY1, PqWRKY2,PgWRKY1, PgWRKY3, PgWRKY4; subcellular localization shows that PgWRKY22 was localizted to the nuclei; real-time fluorescence quantitative PCR showed thatwas highly expressed in the lateral roots and main roots of, followed by the leaves and stems; the expression at exogenous phosphorus concentration of 2 mmol/L was significantly higher than that at other phosphorus concentrations.The cDNA sequence and expression information ofwere obtained by cloning, which could provide reference for gene function identification and phosphorus nutrition regulation incultivation.

Panax ginseng C. A. Meyer; transcription factor; bioinformatics; subcellular localization; expression analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2023)13 - 4286 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.021

2023-02-03

財政部和農業(yè)農村部國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系（CARS-21）；中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程協(xié)同創(chuàng)新任務（CAAS-XTCX20190025-6）；國家重點研發(fā)計劃項目子課題（2021YFD1600902）；非林地老參地再利用研究與示范項目（LNFYZBDL-JL18-246C）

梁 浩（1991—），男，博士研究生，研究方向為藥用植物栽培。E-mail: 380278954@qq.com

通信作者：張亞玉，研究員，研究方向為藥用植物栽培。E-mail: zyy1966999@sina.com

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