靶向銅死亡相關基因治療類風濕關節(jié)炎生物信息學分析及干預中藥的預測

楊會軍，郭 響，李偉青，蘇小軍，田雪梅，王海東，金芳梅*

·數(shù)據(jù)挖掘與循證醫(yī)學·

靶向銅死亡相關基因治療類風濕關節(jié)炎生物信息學分析及干預中藥的預測

楊會軍1，郭 響2，李偉青1，蘇小軍1，田雪梅1，王海東1，金芳梅1*

1. 甘肅省中醫(yī)院 風濕骨病中心，甘肅 蘭州 730050 2. 浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310003

探索銅死亡相關基因在類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）中的表達及其作用機制，并篩選通過靶向銅死亡基因治療RA的潛在中藥。通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫獲得RA芯片數(shù)據(jù)，分析銅死亡基因在RA中表達水平；依據(jù)銅死亡基因表達情況構建高表達亞型和低表達亞型，并進行差異分析，篩選出與RA相關的銅死亡基因。按不同分組對基因表達矩陣進行免疫浸潤分析，并分析免疫浸潤細胞與銅死亡基因之間的相關性。利用Kobas在線工具對差異基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。通過Herb數(shù)據(jù)庫檢索靶向銅死亡基因治療RA的潛在中藥及其有效成分，使用Autodock vina軟件模擬藥物與銅死亡靶蛋白結合活性。通過收集臨床樣本驗證銅死亡相關基因在RA中表達水平。、、、、、和7個銅死亡相關基因在RA中差異表達。免疫浸潤分析結果顯示，在RA中活化的記憶CD4+T細胞、靜息自然殺傷（natural killer，NK）細胞和中性粒細胞與銅死亡相關。富集分析結果顯示，銅死亡主要與趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、核因子-κB信號通路、p53信號通路和過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路相關?；⒄热~可能是靶向銅死亡基因治療RA的潛在中藥。分子對接結果顯示，虎杖葉有效成分均有與銅死亡靶蛋白結合的可能。、、、在RA患者外周血單個核細胞中mRNA表達水平升高。銅死亡相關基因表達水平與RA病程進展相關，并預測虎杖葉是潛在靶向銅死亡基因治療RA的藥物，為RA的臨床診療及藥物開發(fā)提供了新的方向和理論基礎。

類風濕關節(jié)炎；銅死亡相關基因；免疫浸潤；生物信息學；虎杖葉；二氫硫辛酰胺脫氫酶；谷氨酰胺酶；鐵氧還原蛋白1；二氫硫辛酸轉乙?；?/p>

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床上常見的一種炎癥性疾病，癥狀主要表現(xiàn)為持續(xù)性疼痛、壓痛和關節(jié)破壞[1]。祖國醫(yī)學認為RA屬于“痹證”范疇，主要因氣血痹阻，經(jīng)脈不通而痛；氣行不暢而痹阻經(jīng)絡；血瘀氣阻而化熱[2]。目前我國RA患病率約0.42%，全球患病率約0.27%[3-4]。RA作為慢性疾病已成為全世界關注的公共衛(wèi)生問題之一。RA的標準治療手段主要用于控制炎癥和關節(jié)疼痛，但常用的非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、改善病情的抗風濕藥物和生物制劑長期服用會引起不良反應[4-5]。因此，尋找安全、有效的治療藥物或治療策略對RA臨床治療具有重要意義。RA的病理過程受T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞等免疫細胞與成纖維樣滑膜細胞之間的串擾影響[6]。免疫細胞的激活會分泌多種炎癥因子，進而影響軟骨細胞、破骨細胞和成纖維細胞導致軟骨損傷和骨骼破壞[5-6]。干預這些免疫細胞或免疫因子作為RA治療相關研究的新方法和新靶點具有很大的潛力，相關的治療方案仍在研究中[6]。

細胞死亡與RA的疾病發(fā)展密切相關。如成纖維樣滑膜細胞死亡減少導致滑膜細胞過度增殖，從而引發(fā)滑膜炎[7]。自身免疫性T細胞和B細胞的細胞死亡失衡也會增加自身免疫反應和炎癥反應[8]。隨著細胞死亡研究領域的快速發(fā)展，針對RA細胞死亡的相關臨床治療策略也取得了一定的進展[7-8]。銅死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡方式，其機制與線粒體呼吸相關[7]。銅離子通過與三羧酸循環(huán)過程中的脂酰化蛋白質(zhì)結合，使脂?；鞍拙奂瘜е妈F硫簇蛋白丟失，進而誘發(fā)蛋白質(zhì)毒性應激并造成細胞死亡[7,9]。相關研究結果顯示RA患者血液中銅含量升高，且與炎癥標志物呈正相關[10]。銅死亡相關基因丙酮酸脫氫酶E1 α1亞基（pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1，）可能與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）協(xié)同調(diào)節(jié)RA中的巨噬細胞炎癥反應，且銅死亡另一相關基因丙酮酸脫氫酶E1亞基β（pyruvate dehydrogenase E1 subunit beta，）可能與成纖維樣滑膜細胞的異常增殖相關[11]。由此可見，闡明銅死亡在RA發(fā)病過程中的作用機制并探尋相關治療藥物具有重要的研究意義。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥是中華文化的瑰寶，治療RA已有近千年歷史。臨床上中醫(yī)主要通過祛風除濕、散瘀活血、通絡止痛來消除痹癥，代表性的復方有蠲痹湯、獨活寄生湯、烏頭湯和桂枝芍藥知母湯[2,12]。有實驗表明傳統(tǒng)中藥及其有效成分可以通過促進細胞凋亡、抑制成纖維樣滑膜細胞異常增殖和抗炎等作用緩解RA癥狀[2,13]。然而中藥及其活性成分能否通過靶向銅死亡治療RA尚未見相關研究報道。本研究旨在通過生物信息學方法闡明銅死亡相關基因在RA中的表達及作用機制，篩選靶向銅死亡相關基因的中藥及其活性成分。為明確銅死亡在RA中的調(diào)控機制并開發(fā)用于防治RA的靶向調(diào)節(jié)藥物提供理論基礎。

1 方法

1.1 銅死亡相關基因集獲取

以“cuproptosis”和“銅死亡”為關鍵詞分別檢索PubMed數(shù)據(jù)庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（https://www.cnki.net/）截至2022年9月30日收錄的與銅死亡相關文獻，構建銅死亡相關基因集。共獲得10個與銅死亡密切相關的基因：細胞周期依賴性激酶抑制基因（cell cycle-dependent kinase inhibitory gene，）、鐵氧還原蛋白1（ferridoxin 1，）、二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，）、二氫硫辛酸轉乙?；福╠ihydrolipoamide acetyltransferase，）、硫辛酸合成酶（lipoic acid synthetase，）、谷氨酰胺酶（glutaminase，）、脂酰轉移酶1（lipoyltransferase 1，）、金屬調(diào)節(jié)轉錄因子1（metal regulatory transcription factor 1，）用于后續(xù)分析[9]。

1.2 RA滑膜基因表達數(shù)據(jù)集獲取

以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞檢索由美國國立生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）創(chuàng)建并維護的基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲取RA基因表達數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集篩選要求：（1）數(shù)據(jù)集包含RA組和正常對照組，且每組樣本量不少于3；（2）RA組未經(jīng)藥物或其他手段干預治療；（3）數(shù)據(jù)集信息完整無缺失。

1.3 RA樣本分型

基于銅死亡相關基因在GEO數(shù)據(jù)集RA樣本中的表達水平，使用Consensus Cluster Plus R語言包對所有RA樣本進行表達一致性聚類分析，將樣本分為銅死亡基因表達模式不同的亞型。

1.4 基因表達差異分析

通過RStudio 2022.02.1軟件的“Limma”R語言包，對檢索得到的基因表達數(shù)據(jù)集根據(jù)不同分組進行基因表達差異分析。以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）絕對值大于2及矯正后＜0.05為差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）篩選標準。差異分析結果通過微生信（https://www. bioinformatics.com.cn/）在線網(wǎng)頁工具對結果進行可視化處理。

1.5 免疫浸潤分析

基于基因表達數(shù)據(jù)矩陣使用CIBERSORT去卷積法評估每個樣本中22種免疫細胞占比。比較不同分組間（正常對照組RA組、RA1組RA2組）22種免疫細胞豐度差異。

1.6 富集分析

將需要分析的基因簡稱導入在線網(wǎng)頁工具Kobas（http://bioinfo.org/kobas）進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。分析物種設置為“智人（homo sapiens）”，以＜0.05為篩選標準。

1.7 潛在治療中藥預測

對在RA病理過程中發(fā)揮重要作用的銅死亡相關基因，通過本草圖鑒數(shù)據(jù)庫（HERB，http://herb.ac.cn/）檢索其相應中藥。針對涵蓋靶點較多的中藥，通過檢索相關文獻，確定其有效成分。通過SwissADME在線工具（http://www.swissadme. ch）依據(jù)里賓斯基五規(guī)則（Lipinski’s rule of five，RO5）篩選出成藥性較好的有效成分，并使用ProTox-II在線工具對有效成分進行安全性評估[14]。借助AutoDockTools 1.5.6軟件模擬中藥有效成分結合銅死亡相關基因，預測其治療RA的潛在可能。

1.8 臨床樣本收集

本研究獲得甘肅省中醫(yī)院倫理委員會批準（批準文號2020-031-01），所有研究對象均簽署知情同意書。本研究于甘肅省中醫(yī)院共收集5例健康志愿者外周血樣本（健康對照組）及5例臨床診斷為RA患者（RA組）外周血樣本，所有外周血樣本通過提取試劑分離出單核細胞，放入?80 ℃冰箱保存。

納入標準：（1）RA組患者經(jīng)臨床醫(yī)生診斷符合2010年美國風濕病學會聯(lián)合歐洲抗風濕病聯(lián)盟提出的RA診斷標準；（2）RA組患者處于RA疾病活動期；（3）年齡18～80歲；（4）性別不限；（5）簽署知情同意書者。排除標準：（1）患有精神疾病或其他原因無法配合者；（2）合并其他急慢性疾病者；（3）近期有生育要求或正處于妊娠期或哺乳期的女性；（4）入組前4周內(nèi)使用過藥物干預治療者。

1.9 實時熒光定量-PCR（real-time fluorescence quantification-PCR，RT-qPCR）分析

通過Trizol法提取外周血樣本單個核細胞總RNA，檢測濃度后取1000 ng RNA為模板逆轉錄為cDNA（Takara，RR047A）。引物序列如表1所示，使用SYBR green染料（諾唯贊，批號Q141-02）按20 μL體系進行40個循環(huán)的擴增。t值以磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參按2???Ct法分析。

表1 引物序列

1.10 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 銅死亡相關基因在RA中表達情況

通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫得到物種為人的RA滑膜基因表達數(shù)據(jù)集GSE89408。數(shù)據(jù)集基于芯片GPL11154，包括對照組樣本28例，RA樣本152例?；贕SE89408數(shù)據(jù)集，10個銅死亡相關基因表達差異分析結果顯示（圖1-A），與正常對照組相比，RA組關節(jié)滑膜、、、、、、、和表達上調(diào)且差異具有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。

2.2 銅死亡相關基因表達分型

基于10個銅死亡相關基因在RA樣本關節(jié)滑膜表達情況，將152例RA滑膜樣本進行一致性聚類分析（圖1-B），分為RA1和RA2 2種亞型。主成分分析（principal component analysis，PCA）結果顯示（圖1-C），RA1與RA2 2種亞型間存在差異，可用于進一步分析。銅死亡相關基因在RA1和RA2 2種亞型表達差異分析結果顯示（圖1-D），與RA1組相比，RA2組、、、、、、、和表達下調(diào)且差異具有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。

2.3 差異分析結果

基于數(shù)據(jù)集GSE89408將RA組與正常對照組相比，根據(jù)DEGs篩選條件，共得到10 558個RA滑膜DEGs（圖2-A）。銅死亡2個亞型RA1與RA2分組間差異分析共得到652個DEGs（圖2-B）。對2次差異分析結果進行交集分析，得到501個共同DEGs。

2.4 通路富集分析結果

501個共同DEGs通路分析結果（圖2-C）顯示，趨化因子（chemokine）信號通路、Toll樣受體（Toll-like receptor）信號通路、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路、p53信號通路和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisomeproliferators-activated receptor，PPAR）信號通路與銅死亡相關，在RA病理過程中發(fā)揮重要作用。

2.5 免疫浸潤分析結果

免疫浸潤分析結果顯示，與正常對照組相比（圖3-A），RA組關節(jié)滑膜樣本中記憶B細胞（B cell memory，＜0.001）、漿細胞（plasma cells，＜0.05）、未活化的記憶CD4+T細胞（T cells CD4 memory resting，＜0.000 1）、活化的記憶CD4+T細胞（T cells CD4 memory activated，＜0.000 1）、濾泡輔助性T細胞（T cells follicular helper，＜0.05）、調(diào)節(jié)性T細胞（T cells regulatory，＜0.000 1）、γδT細胞（T cells gamma delta，＜0.05）、靜息自然殺傷（natural killer，NK）細胞（NK cells resting，＜0.01）、活化NK細胞（NK cells activated，＜0.000 1）、單核細胞（monocytes，＜0.05）、M1型巨噬細胞（macrophages M1，＜0.000 1）、靜息樹突細胞（dendritic cells resting，＜0.05）、靜息肥大細胞（mast cells resting，＜0.01）和中性粒細胞（neutrophils，＜0.000 1）豐度存在差異。

RA1組與RA2組免疫浸潤分析結果（圖3-B）顯示，兩組間初始CD4+T細胞（T cells CD4 naive，＜0.01）、活化的記憶CD4+T細胞（＜0.05）、靜息NK細胞（＜0.05）、M2型巨噬細胞（macrophages M2，＜0.001）、嗜酸性粒細胞（eosinophils，＜0.05）和中性粒細胞（＜0.01）豐度存在差異。

2.6 銅死亡相關基因診斷價值分析

結合在正常對照組與RA組及RA1與RA2組間差異表達的銅死亡相關基因，共有8個共同銅死亡相關基因（、、、、、、和）表達存在差異。借助微生信在線網(wǎng)頁工具構建基因受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線，獲得基因對RA診斷的靈敏度和特異度，評估基因對RA診斷價值。結果（圖4）顯示，（AUC＝0.862）、（AUC＝0.826）、（AUC＝0.880）、（AUC＝0.901）、LIAS（AUC＝0.852）、LIPT1（AUC＝0.851）和PDHB（AUC＝0.857）特異性較高。此外，PDHA1（AUC＝0.658）特異性較低。

A-銅死亡相關基因在正常對照組和RA組表達水平，與正常對照組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001 ****P＜0.000 1；B-基于銅死亡相關基因表達水平對RA樣本聚類分析；C-RA不同亞型組PCA分析結果；D-RA不同亞型組銅死亡相關基因表達水平，與RA1組比較：****P＜0.000 1

2.7 相關性分析結果

7個共同銅死亡相關基因與3個共同差異免疫細胞（活化的記憶CD4+T細胞、靜息NK細胞和中性粒細胞）相關性分析結果如圖5所示，、、、、、和之間表達相關性均為正相關（＞0.05）。活化的記憶CD4+T細胞與7個銅死亡相關基因表達均呈正相關。與之相反，靜息NK細胞與7個銅死亡相關基因表達的相關性系數(shù)均小于0。中性粒細胞與7個銅死亡相關基因表達相關性較弱。

2.8 靶向銅死亡基因治療RA的潛在中藥及其有效成分確定

基于Herb數(shù)據(jù)庫檢索能靶向7個共同銅死亡相關基因的潛在中藥，其中未能找到能靶向、和基因的中藥，潛在靶向、、和基因的治療RA的中藥如表2所示。通過檢索相關文獻確定中藥的有效成分，無相關文獻則通過Herb數(shù)據(jù)庫補充。共獲得7種潛在中藥（草莓車軸草、虎杖葉、白罌粟、麗春花果實、水團花、粟殼和罌粟嫩苗），并確定41種有效成分。

A-正常對照組與RA組差異分析火山圖；B-RA1組與RA2組差異分析火山圖，藍色代表表達下調(diào)基因，紅色代表表達上調(diào)基因，灰色代表無統(tǒng)計學差異基因；C-RA不同亞型組差異基因與RA相關基因韋恩圖；D-交集基因相關通路

2.9 分子對接模擬藥物分子與蛋白結合

通過SwissADME在線工具共篩選出符合RO5原則的藥物成分13種（表3），安全性評估結果顯示咖啡酸、庫明吉啶、大黃素、考邁斯托醇、阿魏酸、沒食子酸和白藜蘆醇毒性較低（毒性等級＞3，出現(xiàn)毒性反應數(shù)≤1）。以甲氨蝶呤為陽性對照。將以上7個安全性較高的成分與7個共同銅死亡相關基因進行分子對接，藥物分子配體與蛋白受體結合能如圖6-A所示。結合能均小于0，表明藥物分子與蛋白受體有結合可能。盡管嗎啡與DLAT結合能最低，但鑒于嗎啡屬于危險藥物，成為RA治療藥物可能性較低。本研究展示其他結合能較低的構象。DLD與大黃素結合構象、庫明吉啶與FDX1結合構象如圖6-B、C所示。

2.10 兩組受試者基線資料

最終正常對照組和RA組各納入5例受試者。兩組受試者基線資料如表4所示。

2.11 銅死亡相關基因在RA患者中mRNA表達水平

銅死亡相關基因、、、在健康受試者和RA患者外周血單個核細胞中mRNA表達水平如圖7所示。與健康對照組相比，RA患者外周血單個核細胞中、、、的mRNA表達水平明顯升高且差異具有統(tǒng)計差異（＜0.05、0.01）。

3 討論

銅死亡是新發(fā)現(xiàn)的一種細胞死亡方式，可能會影響RA中的各種細胞，從而涉及炎癥、血管生成和骨破壞的發(fā)展過程[11]。本研究通過下載GEO芯片數(shù)據(jù)，對RA滑膜基因表達數(shù)據(jù)分析結果顯示，大部分銅死亡相關基因在RA患者樣本中表達上調(diào)，這表明銅死亡與RA的疾病進展相關。基于銅死亡基因在RA樣本中的表達水平，將RA樣本分為銅死亡基因高表達亞型組和低表達亞型組。對正常對照組與RA組、銅死亡基因高表達組與低表達組分別進行免疫浸潤分析，確定了RA中3個與銅死亡相關的免疫細胞，分別為活化的記憶CD4+T細胞、靜息NK細胞和中性粒細胞。大量記憶CD4+T細胞、NK細胞存在于RA患者外周血、關節(jié)滑膜與滑液中，這些細胞能夠高效地產(chǎn)生促炎細胞因子進而導致關節(jié)炎癥，同時促進骨破壞[17-18]。同樣在RA環(huán)境中，中性粒細胞表達多種趨化因子受體，并釋放大量炎癥介質(zhì)[19]。因此，靶向抑制這些免疫細胞，降低促炎細胞因子水平是一種有前景的RA治療策略[5]。銅死亡基因與免疫細胞可能在RA免疫浸潤方面發(fā)揮重要作用，能否通過調(diào)節(jié)免疫細胞死亡緩解RA癥狀，有待進一步研究。

A-正常對照組vs RA組 B-RA1組vs RA2組 *P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 ****P＜0.000 1

基于差異分析共得到501個DEGs，KEGG通路富集分析結果顯示，RA中銅死亡可能與趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、NF-κB信號通路、p53信號通路和PPAR信號通路相關。NF-κB信號通路是細胞因子與炎癥反應之間的橋梁，銅元素可以通過激活NF-κB信號通路促進炎癥和線粒體自噬障礙[20]。在長期銅暴露或銅誘導的條件下，p53表達增加且腫瘤壞死因子信號通路被激活，進一步促進細胞凋亡[21-22]。Liu等[23]研究顯示，銅元素可能通過激活PPAR信號通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。PPAR也已被證實對CD4+T細胞的存活、激活和分化具有調(diào)節(jié)作用[24]。在RA中，各種趨化因子通過靶向中性粒細胞、成骨細胞、NK細胞、T細胞、軟骨細胞和巨噬細胞等促進血管生成，加重關節(jié)滑膜炎癥，并使關節(jié)長期處于慢性炎癥環(huán)境中[25]。此外，IL-17通過與其受體結合刺激TNF-α、IL-1β、IL-6和趨化因子產(chǎn)生，以及NF-κB活化[25]。而NF-κB通路被認為是RA炎癥反應的主要途徑之一[26]。由此可見，通過干預銅死亡相關通路促進促炎細胞群銅死亡可以有效緩解RA炎癥。

圖4 銅死亡相關基因ROC曲線

圖5 相關性分析結果

表2 靶向銅死亡基因治療RA的潛在中藥

表3 潛在治療RA藥物成分化學性質(zhì)與毒性參數(shù)

Y-出現(xiàn)毒性反應 N-無毒性反應

Y-toxic reaction occurs N-no toxic reaction occurs

A-潛在治療藥物與靶點蛋白分子對接結合能 B-DLD與大黃素結合構象 C-庫明吉啶與FDX1結合構象

表4 兩組受試者基線資料

HC-健康對照組 RA-RA組 與HC組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

銅死亡基因在RA芯片數(shù)據(jù)中表達分析結果顯示，、、、、、和7個基因在2次差異分析中均為差異表達基因，提示其可能是靶向銅死亡干預RA的重要基因。目前尚無在RA中的研究報道，主要促進糖酵解和脂肪酸氧化，并改變氨基酸代謝參與炎癥反應[27]。主要與線粒體功能、氧化應激和炎癥有關，過表達可以增加調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）的數(shù)量并減少了T細胞浸潤，抑制NF-κB活性，減輕慢性炎癥反應并保護線粒體功能[11,28-29]。在RA成纖維樣滑膜細胞中表達上調(diào)，抑制表達水平可以抑制RA成纖維樣滑膜細胞增殖并抑制關節(jié)炎小鼠的炎癥反應[30]。主要調(diào)節(jié)線粒體呼吸、乳酸和丙酮酸的產(chǎn)生，并與RA患者的滑膜細胞增殖和血管生成相關[11,31]。也能通過影響線粒體功能參與RA的發(fā)展[11]。已被確定為RA的易感基因，可能與帕金森病蛋白7共同調(diào)節(jié)Treg細胞并保持其功能完整性；表達下調(diào)可能導致RA成纖維樣滑膜細胞異常增殖[11]。ROC曲線分析7個重要基因，AUC值均高于0.5。以上結果表明這些基因可作為RA的診斷標志物和潛在治療靶點。

通過檢索相關數(shù)據(jù)庫獲得干預RA銅死亡基因的中藥及其有效成分，得到7種中藥及其41個有效成分。其中罌粟雖然具有斂肺澀腸、固腎鎮(zhèn)痛等功效，但其主要成分嗎啡和可待因等生物堿具有成癮性，已被國家列入麻醉精神類藥品目錄嚴格管制[32]。本研究不探討此類藥物及相關成分?！侗静菔斑z》和《本草推陳》記載傳統(tǒng)中藥虎杖葉具有平肝潛陽、祛痰熄風等功效，臨床上主要應用于治療風濕關節(jié)疼痛、消炎和消腫等[15]。相關研究表明，虎杖中有效成分具有抗炎和抗痛風作用，在血管生成方面具有雙重作用，且長期高劑量應用虎杖會產(chǎn)生毒性，造成肝臟損傷，但毒性反應具有可逆性[33]。因此，虎杖葉有成為靶向銅死亡緩解RA炎癥癥狀治療藥物的潛在可能，但虎杖葉中發(fā)揮主要治療作用的有效成分尚不明確，需要進一步篩選鑒定。根據(jù)RO5成藥原則及毒性預測結果，篩選出咖啡酸、庫明吉啶、大黃素、考邁斯托醇、阿魏酸、沒食子酸和白藜蘆醇7個藥物成分。分子對接結果顯示，這些藥物成分均有與RA銅死亡靶點結合的可能。白藜蘆醇已被應用于臨床治療RA，且治療效果較好。在RA中，白藜蘆醇對p53通路具有調(diào)控作用并促進成纖維樣滑膜細胞、巨噬細胞和浸潤的炎性細胞凋亡[34]。通過構建佐劑性關節(jié)炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)咖啡酸和阿魏酸可減輕關節(jié)炎大鼠炎癥，緩解爪子水腫和炎癥細胞浸潤，保護關節(jié)組織免受血管翳形成以及軟骨和骨破壞[35-36]。大黃素通過抑制NF-κB通路在膠原誘導關節(jié)炎小鼠中發(fā)揮抗炎作用[37]。沒食子酸可降低促炎細胞因子水平并誘導成纖維樣滑膜細胞凋亡[38]。在骨關節(jié)炎中，考邁斯托醇可以抑制IL-1β誘導的炎癥[39]。由此可見，虎杖葉可以作為靶向銅死亡治療RA的潛在治療藥物。

4 結論

靶向銅死亡基因促進免疫細胞死亡，從而緩解RA炎癥，是一種很有前景的治療策略。本研究分析了銅死亡基因在RA中表達水平差異，且可能與記憶CD4+T細胞、NK細胞和中性粒細胞免疫浸潤相關。同時本研究預測虎杖葉有效成分可能靶向銅死亡基因緩解RA炎癥。本研究的分析結果為靶向銅死亡治療RA的相關研究提供了新的方向和理論基礎，為臨床RA治療提供新的選擇藥物。但研究仍存在一些問題，如未能檢索到草莓車軸草有效成分及其藥理作用的相關文獻，有待進一步深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Bioinformatics analysis of targeting cuproptosis-related genes therapy for rheumatoid arthritis and prediction of intervention traditional Chinese medicine

YANG Hui-jun1, GUO Xiang2, LI Wei-qing1, SU Xiao-jun1, TIAN Xue-mei1, WANG Hai-dong1, JIN Fang-mei1

1. Osteopathy and Rheumatology Center, Lanzhou 730050, China 2. The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China

To explore the expression of cuproptosis-related genes in rheumatoid arthritis (RA) and mechanism, and to screen the potential traditional Chinese medicine in the treatment RA by targeting cuproptosis-related genes.The RA microarray data were obtained by searching the GEO database, and the expression levels of cuproptosis-related genes in RA were analyzed. The high expression subtypes and low expression subtypes were constructed according to the expression of cuproptosis-related genes, and differential analysis was performed to screen out the cuproptosis-related genes related to RA. Immune infiltration analysis was performed on the gene expression matrix by different groups and the correlation between immune infiltrating cells and cuproptosis-related genes was analyzed. The Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis was performed on differential expressed genes by the Kobas online tool. The Herb database was used to search for potential traditional Chinese medicines and their active ingredients in the treatment of RA by targeting cuproptosis-related gene, and the Autodock vina software was used to simulate the possible binding of drugs and cuproptosis-related target proteins. The expression levels of cuproptosis-related genes in RA were verified by clinical samples.A total of seven cuproptosis-related genes (,,,,,, and) were differentially expressed in RA. The result of immune infiltration analysis showed that activated memory CD4+T cells, resting NK cells, and neutrophils were associated with cuproptosis in RA. The results of pathway enrichment analysis showed that cuproptosis was mainly associated with the chemokine signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, interleukin-17 (IL-17) signaling pathway, tumor necrosis factor signaling pathway, nuclear factor-κB signaling pathway, p53 signaling pathway, and peroxisome proliferators-activated receptors signaling pathways. Leaf of Huzhang () may be a potential drug in the treatment of RA by targeting cuproptosis-related gene, and the molecular docking results showed that the active components in leaf ofmay bind to cuproptosis-related proteins. The mRNA expression levels of,,andin peripheral blood mononuclear cells of RA patients increased.The expression level of cuproptosis -related genes is related to the progression of RA disease, and predicted thatleaf is a potential drug in treatment of RA by targeting cuproptosis-related genes, which provides a new direction and theoretical basis for the clinical diagnosis and treatment of RA and drug development.

rheumatoid arthritis; cuproptosis-related genes; immune infiltraton; bioinformatics; leaf of; DLD; GLS; FDX1; DLAT

R285

A

0253 – 2670(2023)13 - 4253 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.018

2022-12-23

國家中醫(yī)藥管理局高水平中醫(yī)藥重點學科建設項目實施方案（國中醫(yī)藥人教函[2022]226號）；國家自然科學基金項目（82260880）；國家重點研發(fā)計劃（2018YFC1705202，2018YFC1705203）；國家中醫(yī)藥管理局行業(yè)專項（20150700107）；甘肅省中醫(yī)藥項目（GZKP-2021-12）；蘭州市科技指導性計劃項目（2022-ZD-73）；王海東甘肅省名中醫(yī)傳承工作室建設項目（甘衛(wèi)中醫(yī)函[2022]50號）

楊會軍（1985—），男，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，研究方向為風濕骨病發(fā)病機制及中醫(yī)特色療法和中藥干預研究。E-mail: yhj_16999@163.com

通信作者：金芳梅，女，主治醫(yī)師，研究方向為風濕骨病發(fā)病機制及中醫(yī)特色療法和中藥干預研究。E-mail: 13909406533@163.com

[責任編輯 潘明佳]