法尼醇對白念珠菌生物膜葡聚糖的影響及白念珠菌耐藥相關(guān)性

張琴琴,馬 鳴,花 榮,呂 盈,史般若,吳翹楚,魏 昕

白念珠菌是機體常見條件致病菌[1],生物膜是其主要致病狀態(tài)。由于胞外基質(zhì)的保護,生物膜狀態(tài)的白念珠菌致病性和耐受性較浮游狀態(tài)更強[2-3]。葡聚糖是白念珠菌細胞壁的主要成分,與生物膜的形成密切相關(guān)[4]。細胞壁和細胞外基質(zhì)中的葡聚糖成分還能和抗真菌藥物結(jié)合,以阻止藥物到達深層細胞。因此,葡聚糖的改變可影響傳統(tǒng)抗真菌藥物對白念珠菌生物膜細胞的作用[5]。

法尼醇是一種重要的密度感應分子(quorum sensing molecular,QSM),當微生物種群密度增加引起細胞外環(huán)境中QSM的積累達到閾值濃度時,可以誘導或抑制微生物基因表達[3,6]。在白念珠菌中,法尼醇參與抑制菌絲及生物膜形成,并且一定濃度的法尼醇還可以抑制白念珠菌的生長,誘導其凋亡[7-8]。目前,關(guān)于法尼醇能否通過影響真菌細胞壁的葡聚糖來改變白念珠菌細胞壁的形態(tài),并通過這種細胞壁形態(tài)的改變影響白念珠菌生物膜耐藥性的相關(guān)研究罕見報道。

本實驗擬探究法尼醇對白念珠菌生物膜形態(tài)、葡聚糖基因表達的影響及白念珠菌耐藥相關(guān)性,以期為白念珠菌感染的治療和真菌耐藥機制的探索提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

白念珠菌標準株(SC5314)由上海第二軍醫(yī)大學藥學院遺傳工程國家重點實驗室饋贈。沙堡瓊脂培養(yǎng)基(Sabourd's dextroseagar,SDA)(63.0 g/L)(上 海樊客生物科技有限公司,中國),YPD培養(yǎng)液(2%葡萄糖、1%酵母提取物,BioFroxx,德國),2%胰蛋白胨(Oxoid,英國),PBS緩沖液(索萊寶,中國),RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco,美國),氟康唑、法尼醇(Sigma,美國),2.5%戊二醛(北京雷根生物技術(shù)有限公司,中國),KONT真菌顯色MIC藥敏系統(tǒng)(溫州康泰生物科技有限公司,中國),逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(大連寶生物工程有限公司,中國),iTaq SYBR Green預混酶(BIO-RAD,美國),YCP系列二氧化碳培養(yǎng)箱(上海易亮醫(yī)療器械有限公司,中國),低溫高速離心機(Eppendorf,德國),透射電鏡(FEI公司,美國)。

1.2 白念珠菌菌懸液的配制

將-70 ℃保存的白念珠菌標準株SC5314接種到SDA培養(yǎng)基上,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,取單克隆菌株于YPD培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min搖床過夜。2 100 ×g離心10 min,收集YPD培養(yǎng)液中的細胞,無菌PBS洗滌2次,細胞重懸于RPMI 1640培養(yǎng)液中,血細胞計數(shù)法制備成濃度為5×105CFU/mL的標準菌懸液。

1.3 氟康唑誘導耐藥株形成

根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)CLSI M27-A3文件,檢測氟康唑?qū)Π啄钪榫鷺藴手闟C5314的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。

在96孔培養(yǎng)板中加入100 μL氟康唑溶液(濃度依次為128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/mL),再加入100 μL用RPMI 1640稀釋的白念珠菌菌懸液(稀釋后為2.5×103CFU/mL),空白組加入100 μL去離子水和100 μL白念珠菌菌懸液。將96孔板放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后讀取結(jié)果。MIC為抑菌數(shù)量達80%的實驗組所用的最低藥物濃度。

隨后,按照上面獲得的白念珠菌標準株SC5314的MIC值誘導氟康唑耐藥株。根據(jù)CLSI M27-A3 氟康唑耐藥株的判斷標準,MIC≥ 64 μg/mL為耐藥菌株。本實驗選用MIC≥128 μg/mL的菌株為耐藥株。將-70 ℃保種的白念株菌標準株SC5314接種到SDA培養(yǎng)基上,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,挑取單克隆菌株于5 mL RPMI 1640中(含2×MIC藥物濃度的氟康唑),30 ℃、180 r/min搖床生長24 h,取100 μL菌懸液涂布于SDA培養(yǎng)基上(含4×MIC藥物濃度的氟康唑),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。用KONT真菌顯色MIC藥敏系統(tǒng)檢測上述在含藥物SDA培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)后白念珠菌的MIC。如果此次檢測所得MIC值<128 μg/mL,則重復上述步驟,直至MIC≥128 μg/mL。將取得的耐藥株菌懸液加入等體積30%甘油,-70 ℃保種。誘導成功的耐藥株在不含藥物的SDA培養(yǎng)基上每傳2代測1次MIC,以判斷其穩(wěn)定性。按照1.2的方法制備濃度為5×105CFU/mL的耐藥株菌懸液待用。

1.4 白念珠菌生物膜的構(gòu)建及法尼醇干預

將白念珠菌分為對照組、法尼醇處理組和耐藥株組,制備各組菌懸液并調(diào)整濃度為5×105CFU/mL,對照組及法尼醇處理組加入白念珠菌標準株SC5314菌懸液,耐藥株組加入耐藥株菌懸液,分別加入6孔板中。37 ℃、5% CO2孵育1 h后,移除培養(yǎng)液,無菌PBS輕洗3次以去除未黏附的細胞,加入RPMI 1640培養(yǎng)液。法尼醇處理組中加入法尼醇(濃度為100 μmol/L),對照組和耐藥株組中加入等體積的去離子水。在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)至6、12、24、36 h。

1.5 透射電鏡觀察生物膜

將上述3組6、12、24、36 h生物膜用無菌刮刀剝離,收集于1.5 mL EP管中,2 100×g離心10 min,棄上清液。加入2.5%戊二醛1 mL,4 ℃固定6 h,送電鏡室脫水,包埋,切片,觀察。白念珠菌生物膜成熟大約需要24 h,因此本實驗選擇24 h這一具有代表性時相的生物膜,分析細胞壁電子顆粒層和厚度。

1.6 白念珠菌總RNA提取

分組同1.4。選用50 mL的培養(yǎng)瓶作為生物膜構(gòu)建的載體,將6 mL濃度為5×105CFU/mL菌懸液加入培養(yǎng)瓶中,37 ℃、5% CO2孵育1 h,此時在培養(yǎng)瓶底壁部形成白念珠菌早期生物膜。移出培養(yǎng)液,無菌PBS緩慢沖洗培養(yǎng)瓶3次,加入6 mL RPMI 1640培養(yǎng)液。法尼醇處理組中加入法尼醇(濃度為100 μmol/L),對照組和耐藥株組中加入等體積的去離子水,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。用無菌細胞刮刀刮取上述3組的24 h白念珠菌生物膜,并收集于15 mL離心管中,2 100×g離心10 min。棄上清液,每管加入400 μL TES和400 μL水飽和酚,劇烈振蕩混勻,63 ℃水浴1 h,其間每隔10 min劇烈振蕩1次。隨后,4 ℃冰浴5 min,12 000 r/min離心15 min。上層水相移至1.5 mL EP管中,加入400 μL水飽和酚劇烈振搖混勻,4 ℃、12 000 r/min離心15 min后將上層水相移至1.5 mL EP管中,加入400 μL氯仿劇烈振搖混勻,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,再將上層水相移至1.5 mL EP管中,加入40 μL的醋酸鈉(NaAc 3 mol/L,pH 5.2)及1 mL無水乙醇,-20 ℃靜置30 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min,棄上清液,加入700 μL 75%乙醇,8 000 r/min 離心5 min。棄上清液,室溫干燥后,加入30 μL DEPC水溶解,提取獲得RNA用于qPCR檢測。

1.7 qPCR檢測葡聚糖相關(guān)基因表達

葡聚糖相關(guān)基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司根據(jù)genebank白念珠菌SC5314基因序列設計并合成(表1),18S rRNA為內(nèi)參。使用前引物用無菌雙蒸水稀釋至20 μmol/L,參照逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒說明書,將反應物放在基因擴增儀內(nèi)反應。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后,采用iTaq SYBR Green預混酶進行反應,反應體系:10.0 μL iTaq SYBR Green預混酶,20 μmol/L的上下游引物各0.4 μL,10倍稀釋的cDNA 1.0 μL,滅菌蒸餾水8.2 μL,反應總體積20 μL。加好樣本的孔板放在ABI 7300 FAST型熒光定量PCR儀中進行反應,設置熒光定量PCR循環(huán)條件:95 ℃,2 min;95 ℃,10 s,循環(huán)40次;60 ℃,30 s;72 ℃,20 s;最后4 ℃冷卻。采用 2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

表1 qPCR引物Tab.1 qPCR primer

1.8 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 17.0軟件對對照組和耐藥組、對照組和法尼醇處理組的細胞壁厚度和qPCR結(jié)果分別進行獨立樣本t檢驗,P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 氟康唑耐藥株模型構(gòu)建成功

氟康唑?qū)Π啄钪榫鷺藴手闟C5314的MIC為0.5 μg/mL(圖1A)。經(jīng)KONT真菌顯色MIC藥敏系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測顯示,當誘導株的MIC≥128 μg/mL時,表示氟康唑耐藥菌株構(gòu)建完成(圖1B),每傳2代進行菌株MIC的鑒定。

A:白念珠菌標準株SC5314,MIC值為0.5 μg/mL;B:氟康唑誘導耐藥株,MIC≥128 μg/mL

2.2 透射電鏡觀察白念珠菌生物膜

透射電鏡結(jié)果見圖2。白念珠菌標準株SC5314的6、12、24、36 h生物膜的細胞壁、細胞膜及其他細胞器結(jié)構(gòu)完整,未見明顯異常。法尼醇處理后,各時相生物膜出現(xiàn)細胞壁厚度不均勻、細胞壁溶解、細胞壁膜分離、波浪狀的細胞壁及細胞器形態(tài)改變等,法尼醇對各時相生物膜的抑制作用。在耐藥株組,可以觀察到各時相的細胞壁厚度有所增加,同時結(jié)構(gòu)完整,細胞器形態(tài)正常。

A～D:對照組;E～H:法尼醇處理組;I～L:耐藥株組

選取24 h白念珠菌生物膜,在200 000倍透射電鏡下觀察法尼醇干預后白念珠菌生物膜細胞壁結(jié)構(gòu)變化(圖3)。對照組中白念珠菌生物膜的細胞壁內(nèi)、外層分別是低密度電子層和高密度電子層,同時存在很多散在的電子顆粒,厚度約為(220.10±2.25)nm。與對照組相比,法尼醇處理組中白念珠菌生物膜細胞壁中電子顆粒減少,細胞壁的厚度((145.90±4.05)nm)也明顯更薄(P<0.05);耐藥株組白念珠菌生物膜細胞壁中電子顆粒增多,并且細胞壁的厚度((299.47±3.33)nm)也有所增加,存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

A:對照組;B:法尼醇處理組;C:耐藥株組

2.3 葡聚糖相關(guān)基因表達

葡聚糖相關(guān)基因qPCR結(jié)果見圖4。與對照組相比,法尼醇處理組PIR1表達上調(diào)(P<0.01),PHR2表達上調(diào)(P<0.05),GSC1表達下調(diào)(P<0.05),BGL2表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);耐藥株組PHR2表達下調(diào)(P<0.05),GSC1表達上調(diào)(P<0.01),PIR1和BGL2表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

與對照組相比,*:P<0.05,**:P<0.01

3 討 論

由于廣譜抗生素和皮質(zhì)類固醇濫用、侵入性醫(yī)療程序增加等,白念珠菌感染患者數(shù)不斷上升且耐藥株開始出現(xiàn)[9-11]。生物膜狀態(tài)下的白念珠菌被細胞外基質(zhì)覆蓋保護,能夠有效對抗藥物殺菌作用,維持微生物的毒性作用[2-3],耐藥性較浮游狀態(tài)大大增加[12],是目前臨床治療白念珠菌感染的難題。因此本實驗選用生物膜狀態(tài)下的白念珠菌作為研究對象。氟康唑是臨床上治療白念珠菌感染的一線藥物,臨床分離的耐藥株中常見氟康唑耐藥株,故本實驗選用氟康唑誘導構(gòu)建白念珠菌耐藥模型,探索其耐藥的機制。

葡聚糖作為白念珠菌細胞壁的主要成分,與念珠菌耐藥密切相關(guān)。有研究表明,當靜止相白念珠菌生長相關(guān)葡聚糖增多時,白念珠菌對兩性霉素B的易感性減弱[13]。葡聚糖酶處理后,可明顯增強氟康唑和兩性霉素B對生物膜的抑制作用[5,14-15]。念珠菌細胞壁的低密度電子層和電子顆粒主要是葡聚糖和殼多糖[16]。葡聚糖起初為顆粒狀,繼而形成細纖維,隨后分出許多細絲形成纖維結(jié)構(gòu),接著大量β-葡聚糖分子聚集,形成念珠菌細胞壁的纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[17]。本實驗通過透射電鏡觀察24 h的白念珠菌生物膜,發(fā)現(xiàn)耐藥株較白念珠菌標準株細胞壁厚度增加,電子顆粒增多,增多的電子顆?？赡苁浅跗诘钠暇厶穷w粒。葡聚糖含量的改變導致細胞壁厚度的改變。此外,葡聚糖可以與抗真菌藥物結(jié)合,隨著結(jié)合的藥物增多,外來的藥物就不能到達深層的細胞。這表明耐藥株組的細胞壁厚度和葡聚糖含量增加可能與其耐藥性相關(guān)。

法尼醇由念珠菌分泌,能抑制白念珠菌酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)變,進而抑制生物膜的形成[6,18]。本實驗觀察到在100 μmol/L的法尼醇作用下,白念珠菌細胞壁變形,厚度變薄,同時電子顆粒減少,表明細胞壁中葡聚糖含量減少。法尼醇可能通過降低細胞壁的厚度及細胞壁中葡聚糖的含量來增加抗真菌藥物的易感性。

本實驗采用qPCR檢測葡聚糖相關(guān)基因PIR1、PHR2、BGL2和GSC1的表達。PIR1基因編碼的Pir1p是β-1,3葡聚糖連接的細胞壁結(jié)構(gòu)蛋白,當念珠菌從酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)變時,PIR1的表達下降[19]。單臂敲除PIR1基因后,缺陷菌株生長緩慢、形態(tài)異常,細胞之間抱團成簇,并且表現(xiàn)出對剛果紅和卡爾科弗盧爾熒光染色劑的高度敏感性,表明PIR1基因在念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)變和維持細胞壁結(jié)構(gòu)完整性上起重要作用[4]。本實驗中,法尼醇處理后,PIR1表達上調(diào),推測原因可能是法尼醇處理后酵母相細胞增多所致。PHR2基因編碼β-1,6葡聚糖所需的糖苷酶,其主要作用在白念珠菌細胞壁上β-1,6-葡聚糖的連接處,可水解葡聚糖,同時也可直接作為pH感應受體起作用。在酸性環(huán)境下,PHR2基因表達,抑制白念珠菌由酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)變[20-21]。本實驗中,PHR2在法尼醇處理組表達上調(diào),細胞中糖苷酶含量升高,進而促進葡聚糖分解。法尼醇作用后使原本在酸性環(huán)境中高表達的PHR2基因在堿性培養(yǎng)基中表達也出現(xiàn)了上調(diào),抑制了白念珠菌形態(tài)的轉(zhuǎn)換。相反,在耐藥株組中,PHR2基因表達下調(diào),細胞中糖苷酶含量下降,葡聚糖的降解減少,菌絲相白念珠菌增加,有利于生物膜的形成,葡聚糖含量增多增加了白念珠菌生物膜細胞的耐藥性。GSC1基因編碼β-1,3葡聚糖酶催化亞基[22],當敲除該基因后,會造成葡聚糖合成酶活性減弱以及葡聚糖合成量降低,導致細胞壁完整性的破壞。本實驗中法尼醇組GSC1的表達降低,造成β-1,3葡聚糖含量減少,細胞壁的形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變;而耐藥株高表達GSC1基因,通過促進葡聚糖的合成,增加白念珠菌生物膜的耐藥性。BGL2基因表達的蛋白Bgl2p屬于白念珠菌細胞壁葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,其主要參與催化β-1,3-葡聚糖末端二糖的合成過程[4]。BGL2基因的表達在對照組、法尼醇處理組和耐藥組間沒有明顯差異,推測BGL2基因與白念珠菌的耐藥不相關(guān),也不是法尼醇作用的機制之一。

本研究結(jié)果表明,法尼醇可以在一定程度上改變葡聚糖相關(guān)基因的表達,進而影響細胞壁的結(jié)構(gòu)和成分,而細胞壁的結(jié)構(gòu)變化與白念珠菌耐藥性相關(guān)。