土壤微生物對環(huán)丙氟蟲胺的降解研究

王少敏，秦子為，段米芳，謝天晨，朱詠華，卓睿

(湖南大學生物學院植物功能基因組學與發(fā)育調控湖南省重點實驗室，長沙 410082)

農藥是防治農業(yè)病蟲害和控制雜草的化學藥品，也是控制某些昆蟲(如蚊、蠅等)的重要藥劑[1]。環(huán)丙氟蟲胺(cyproflanilide)，分子式C28H17BrF12N2O2，是由南通泰禾化工股份有限公司以雙酰胺類殺蟲劑為先導將環(huán)溴蟲酰胺結構中環(huán)甲基引入間二酰胺的骨架中合成的一種間二酰胺類殺蟲劑[2]，于2019 年獲得中國專利授權(專利號ZL201811555432.3)，開發(fā)代號CAC-I-785，CAS 登錄號為2375110-88-4，結構式如圖1 所示[3]。該藥劑作用機制新穎、殺蟲譜廣，對鱗翅目二化螟、稻縱卷葉螟、甜菜夜蛾、小菜蛾、草地貪夜蛾、鞘翅目跳甲和部分薊馬防效優(yōu)異，尤其對水稻二化螟具有杰出的防效[3-4]。其用藥量低，對環(huán)境安全，但不當使用該殺蟲劑對生態(tài)系統(tǒng)具有潛在風險。目前對于環(huán)丙氟蟲胺的微生物降解尚未有研究報道，因此本研究圍繞環(huán)丙氟蟲胺的微生物降解展開探索。

圖1 環(huán)丙氟蟲胺的合成路線

土壤中的細菌、真菌、放線菌、藻類等都具有降解農藥的功效[5]。放線菌(actinobacteria)是一類具有絲狀結構、以孢子繁殖的革蘭氏陽性菌，在自然界中分布廣泛，種類繁多，且孢子抗逆性強，多存在于土壤和根際中[6]。研究發(fā)現(xiàn)某些放線菌具有降解有機物的能力，如余臣磊等[7]從農藥污染場地中分離得到一株對敵百蟲具有降解特性的鏈霉菌屬的菌株Lin F-1，此外研究發(fā)現(xiàn)該菌株具有較強的廣譜降解特性，可降解有機磷和菊酯類農藥、部分有機氯農藥。細菌由于其基因突變性較強，容易誘導多種突變菌株從而有更強的適應能力，因此被廣泛運用于農藥降解[8]。研究顯示，細菌降解有機物表現(xiàn)優(yōu)異，如Demequina salsinemorusBJ1 和Pseudomonassp.strain GJY 分別對蒽和HBCD 降解率高達92.00%和85.38%[9-11]。真菌是一類具備較強環(huán)境應用潛力的微生物資源，以白腐真菌為例，其具備強大的生物降解能力，可以分泌一系列木質素分解酶和細胞內酶，以進行復雜木質素大分子和異生素的降解和轉化[12]。由于白腐真菌特色降解酶系的底物廣譜性和環(huán)境友好性，被廣泛應用于工業(yè)廢水[13-14]、多環(huán)芳烴[15]、農藥抗生素[16]、有機污染物的降解修復領域。

本文以環(huán)丙氟蟲胺為研究對象，首先探究了實驗室現(xiàn)有放線菌、細菌和真菌對環(huán)丙氟蟲胺的降解作用，然后通過平板分離技術，篩選環(huán)丙氟蟲胺的耐藥和降解菌。研究發(fā)現(xiàn)實驗室現(xiàn)有菌株對環(huán)丙氟蟲胺有一定的降解效果，此外成功篩選出對環(huán)丙氟蟲胺有耐受以及降解能力的微生物菌株，最終證明環(huán)境微生物具備對環(huán)丙氟蟲胺的降解能力。這將為環(huán)丙氟蟲胺防治水稻等農作物上的蟲害以及水稻等農作物的保產和增產提供保障，減少該類殺蟲劑對環(huán)境的不良影響。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

2 種放線菌：Amycolatopsissp.MtRt-6(GenBank登錄號：GCA_017308975.1，中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏號：CGMCC No. 23411)，以下簡稱菌株為MtRt-6；Streptomycessp.CoT10(GenBank登錄號：JAIQYX000000000.1，中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏號：CGMCC No.22968)，以下簡稱菌株為CoT10。

2 種細菌：Sphingobacterium mizutaiiGEMB-CSS-01(GenBank 登錄號：MW832242.1)和Pseudomonas aeruginosaGEMB-CSS-02 (GenBank 登錄號：ON025930.1)，以下分別簡稱菌株為CSS-01 和CSS-02。

1 種真菌：白腐真菌Pleurotus ostreatusGEMBPO1(中國典型培養(yǎng)物保藏中心編號：CCTCC NO M2023358)，以下簡稱菌株為PO1。

1.2 試驗材料

環(huán)丙氟蟲胺原藥(南通泰禾化工股份有限公司)。

環(huán)丙氟蟲胺不易溶于培養(yǎng)基，因此試驗所選用的以下培養(yǎng)基均加入1%吐溫80 助溶劑。

酵母麥芽提取物(ISP2)培養(yǎng)基：麥芽浸粉10 g，酵母浸膏4 g，葡萄糖14 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

LB 培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉18～20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

GYP 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母浸膏5 g，蛋白胨5 g，七水硫酸鎂1 g，五水硫酸銅0.002 g，去離子水1000mL，磷酸調pH5.0，115℃滅菌20min。

PDA 培養(yǎng)基：稱取200 g 馬鈴薯塊，加水煮沸20 min，紗布過濾，加入20 g 葡萄糖，使用去離子水補齊1 000 mL。分裝時，每100 mL 培養(yǎng)基內加入1.5～2.0 g 瓊脂糖，121 ℃滅菌20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 放線菌的培養(yǎng)

MtRt-6、CoT10 分別接種于ISP2 固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，收集成熟孢子制成孢子懸浮液，血球計數(shù)板計數(shù)后稀釋至1.0×107CFU/mL 轉接至液體ISP2 培養(yǎng)基，置于搖床，30 ℃、170 r/min恒溫培養(yǎng)。

1.3.2 細菌CSS-01 和CSS-02 的培養(yǎng)

CSS-01 和CSS-02 菌株分別劃線于LB 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落再次于LB 固體培養(yǎng)基劃線活化，然后再接種至LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h 作為種子液。

1.3.3 白腐真菌PO1 的培養(yǎng)

平板種：使用無菌的接種環(huán)從4 ℃保存的種子管中挑取少量的白腐真菌菌絲于新鮮的PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)至菌絲生長較快的時期(約5 d)，成為平板種。

液體種：用無菌的接種針將平板種上的菌絲和其依托的培養(yǎng)基切成小塊，取適量接種于液體的GYP 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)約7 d，成為一級液體種。用剪口無菌的槍頭從一級液體種中取1 mL 到新鮮的GYP 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)3～4 d，此時為二級液體種。

1.3.4 環(huán)丙氟蟲胺的降解

原藥降解：將環(huán)丙氟蟲胺(終濃度為20 mg/L)原藥添加至生長對數(shù)期菌株的液體培養(yǎng)基中，以不接菌含20 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺的空白培養(yǎng)基為對照組(即CK)，按照菌株正常生長條件培養(yǎng)，定期取樣，利用高效液相色譜儀測定剩余環(huán)丙氟蟲胺濃度。

高效液相色譜儀檢測條件：Shim-pack GIST C18柱，流動相：甲醇∶0.1%磷酸水=75∶25(體積比)，流速：1/1.5 mL/min，進樣量：10 μL，檢測波長：240 nm，柱溫：40℃。

環(huán)境微生物對環(huán)丙氟蟲胺的降解率計算：環(huán)丙氟蟲胺終濃度與環(huán)丙氟蟲胺初始濃度差與環(huán)丙氟蟲胺初始濃度比值。

1.3.5 農田土壤中環(huán)丙氟蟲胺耐受菌的分離及其降解特性

土壤樣品采集于湖南省水稻研究所(1 號地)(28°11′52″N，113°4′42″E)和湖南春華金鼎山社區(qū)(2 號地)(28°17′42″N，113°15′52″E)，用無菌取樣勺分別采集水稻所5 個土壤樣品和金鼎山社區(qū)6 個土壤樣品，放入無菌密封袋。

在無菌條件下將土壤樣品用無菌水制備成懸液作為分離微生物源，之后梯度稀釋涂布于含有不同濃度環(huán)丙氟蟲胺原藥的LB 平板上，篩選并分離其中對環(huán)丙氟蟲胺有較高耐藥性的菌株。將生長狀態(tài)良好的耐藥菌培養(yǎng)至生長對數(shù)期轉接于含環(huán)丙氟蟲胺濃度為20 mg/L 的液體培養(yǎng)基(含1%吐溫80)中，以不接菌含20 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺的空白培養(yǎng)基(含1%吐溫80)為對照組，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)，于第2 天取樣，然后采用高效液相色譜儀測定培養(yǎng)基中環(huán)丙氟蟲胺的剩余濃度。

1.3.6 土壤微生物DNA 提取和鑒定

使用DNA 提取試劑盒(EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit，Transgen)對篩選得到的菌株進行基因組DNA 提取，用引物27F (5′-agagtttgatcctggctcag-3′)和1492R(5′-tacggytaccttgttacgactt-3′)擴增其16S rRNA基因后測序，測序結果與NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)和EZBioCloud (www.ezbiocloud.net/)中16S rRNA基因序列進行比對。

2 結果與討論

2.1 放線菌對環(huán)丙氟蟲胺的降解

Amycolatopsissp.MtRt-6 是實驗室前期從經表面消毒后的多年生紫花苜蓿的根部分離得到的一株稀有放線菌，Streptomycessp.CoT10 是實驗室前期從湘林系列油茶的根部分離得到的油茶內生放線菌，MtRt-6 和CoT10 對20 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺原藥的降解情況如圖2 和表1 所示。處理2 d 后，MtRt-6 和CoT10 處理中環(huán)丙氟蟲胺的檢測濃度分別為1.29、1.46 mg/L，MtRt-6 和CoT10 對環(huán)丙氟蟲胺的降解率分別為62.28%和57.18%。可見，MtRt-6和CoT10 對20 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺原藥具有較好的降解能力。

圖2 CK、MtRt-6、CoT10 的高效液相色譜圖

表1 MtRt-6、CoT10 對環(huán)丙氟蟲胺原藥的降解

2.2 細菌CSS-01 和CSS-02 對環(huán)丙氟蟲胺的降解

Sphingobacterium mizutaiiGEMB-CSS-01 和Pseudomonas aeruginosaGEMB-CSS-02 是實驗室前期從長沙市桃子湖底泥樣品中篩選到的能夠在含磺胺培養(yǎng)基和含雙酚A 培養(yǎng)基上生長的菌株，CSS-01和CSS-02 對20 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺原藥的降解情況如圖3 和表2 所示。

圖3 CK、CSS-01、CSS-02 的高效液相色譜圖

表2 CSS-01 和CSS-02 對環(huán)丙氟蟲胺原藥的降解

CSS-02 對環(huán)丙氟蟲胺有明顯的降解效果，但CSS-01 未顯示出對環(huán)丙氟蟲胺的降解效果。處理2 d 后，CSS-01 和CSS-02 處理中的環(huán)丙氟蟲胺檢測濃度分別為5.14、1.59 mg/L，CSS-02 對環(huán)丙氟蟲胺的降解率為69.70%?？梢?，CSS-02 對20 mg/L環(huán)丙氟蟲胺原藥有較好的降解效果。

2.3 白腐真菌PO1 對環(huán)丙氟蟲胺的降解

白腐真菌Pleurotus ostreatusGEMB-PO1 對20 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺原藥的降解如圖4 和表3 所示。處理3 d 后，白腐真菌PO1 處理中環(huán)丙氟蟲胺的檢測濃度為1.15 mg/L，對環(huán)丙氟蟲胺原藥的降解率達78.86%?？梢?，白腐真菌PO1 對20 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺原藥有較好的降解效果。

圖4 CK、PO1 的高效液相色譜圖

表3 白腐真菌PO1 對環(huán)丙氟蟲胺原藥的降解

2.4 農田土壤中環(huán)丙氟蟲胺耐受菌分離及其降解特性

利用平板篩選技術在無菌條件下將土壤樣品用無菌水制備成懸液作為分離微生物源，之后梯度稀釋涂布于含20、80、200 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺原藥的LB 平板上，篩選并分離其中對環(huán)丙氟蟲胺有較高耐藥性的菌株(圖5)。研究發(fā)現(xiàn)，在含200 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺的平板中，依然有微生物能夠生長并顯現(xiàn)出單菌落，最終成功篩選并分離得到12 株在含200 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺的平板上正常生長的菌株。

圖5 土壤微生物對環(huán)丙氟蟲胺的耐藥平板

這12 株耐藥菌對20 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺原藥的降解如圖6 所示。不接菌對照組(CK)中環(huán)丙氟蟲胺的檢測濃度為6.00 mg/L；菌株1-21、2-6、2-16 對20 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺原藥有明顯降解效果，處理2 d后環(huán)丙氟蟲胺的檢測濃度為分別為1.34、2.93、2.45 mg/L，降解率分別達77.67%、51.17%、59.17%。對這3 株有明顯降解效果的菌進行DNA 提取并測序，將測序結果與NCBI 和EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫進行比較，發(fā)現(xiàn)菌株1-21 與高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)、菌株2-6 與東洋芽孢桿菌(Bacillus toyonensis)、菌株2-16 與蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)有較高的相似性。此外，已有研究報道高地芽孢桿菌可降解聚氨酯、丁草胺、木質素、有機磷農藥等污染物[17-20]；東洋芽孢桿菌可降解黑臭水有機污染物[21]；蠟樣芽孢桿菌可降解原油、短鏈烷烴、多環(huán)芳烴、苯酚、聚乙烯醇、有機磷農藥等污染物[22-25]。以上研究證明存在土壤微生物對環(huán)丙氟蟲胺具有一定的降解能力。

以上研究表明，環(huán)境微生物對環(huán)丙氟蟲胺有一定的降解效果。但是，土壤微生物對環(huán)丙氟蟲胺的降解機制、降解產物及其毒性分析在本研究中并未得到揭示，將是后續(xù)有價值的研究方向。

圖6 土壤微生物對20 mg/L 環(huán)丙氟蟲胺原藥的降解

3 結論

環(huán)丙氟蟲胺作為一種間二酰胺類殺蟲劑，其作用機制新穎、殺蟲譜廣，尤其對水稻二化螟具有優(yōu)異的防效。為應對不當使用該殺蟲劑對生態(tài)系統(tǒng)存在的潛在風險，本研究首次探究了部分在環(huán)境中廣泛分布的微生物對于環(huán)丙氟蟲胺的降解能力；同時，從環(huán)境樣品中篩選出了環(huán)丙氟蟲胺的耐受菌，并研究了其對于環(huán)丙氟蟲胺的降解能力。

研究結果表明，實驗室已有的2 株放線菌、2 株細菌、1 株真菌和農田環(huán)境中分離得到的3 株環(huán)境微生物均具備對環(huán)丙氟蟲胺的降解能力且降解周期短。環(huán)境微生物對環(huán)丙氟蟲胺的降解將有助于環(huán)丙氟蟲胺在自然條件下的分解礦化，相關環(huán)境微生物降解環(huán)丙氟蟲胺能力的揭示能夠為環(huán)丙氟蟲胺的微生物降解、環(huán)境修復提供有價值的參考信息。但是，也必須要看到，環(huán)丙氟蟲胺在施用過程中的殘留行為以及其在膳食、環(huán)境生態(tài)和職業(yè)暴露風險方面的安全性評價，本研究并未能揭示。同時，微生物對環(huán)丙氟蟲胺的降解機制、降解產物分析和降解毒理分析，這些都將是有價值的研究方向，有待通過后續(xù)進一步的研究加以闡明。