通過Forskolin將小鼠成纖維細胞重編程為神經(jīng)元試驗

湯文魁,王國棟,魏夢珍,張丹丹,呂丹薇,劉權輝,黃 奔,*

(1.廣西大學 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室,南寧 530004;2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院,南寧 530004)

神經(jīng)退行性疾病是一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元結構和功能被改變的疾病,例如阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和肌萎縮側索硬化(ALS)[1-5]。目前,神經(jīng)退行性疾病的治療方法主要采用藥物治療,但這些治療方法效果并不理想。自誘導多能干細胞的方法建立以來,干細胞重編程成為了治療神經(jīng)退行性疾病的一種有前途的方法,為再生醫(yī)學帶來了希望。因此,細胞替代療法成為近年來的研究熱點。

以往研究通過引入外源轉錄因子將終末分化的體細胞重編程為各種類型的細胞,這些研究結果表明細胞的命運是可逆的[6-8]。研究人員將成纖維細胞誘導為神經(jīng)干細胞,諸如此類的研究在治療神經(jīng)退行性疾病或損傷方面具有一定的前景。

外源性轉錄因子在成纖維細胞中過表達,并直接識別基因組中的特定位點、招募和協(xié)調其他轉錄調控因子來重塑宿主細胞的表觀基因組,最終成功誘導為神經(jīng)干細胞[9]。然而,異位基因的插入通常需要病毒載體,而將逆轉錄病毒載體整合到重編程的基因組中會帶來插入突變、殘余表達及轉基因活化的風險,這可能會導致宿主癌變[10-11]。此外,其使用復雜、需要大量時間、誘導效率低等缺點也削弱了其應用價值[12]。與遺傳學誘導方法相比,小分子化合物誘導具有多個重要優(yōu)勢[13],小分子化合物相對容易應用、優(yōu)化和制造,更容易開發(fā)成藥物,更安全[12,14]。這些優(yōu)勢使小分子化合物調節(jié)細胞命運在臨床應用上更為可行[15-17]。成纖維細胞是最早成功重編程為多能干細胞(iPSCs)的一類體細胞[18],iPSCs能在體內分化為包括神經(jīng)元在內的幾乎任何類型的細胞。與成纖維細胞重編程為iPSCs再分化為神經(jīng)元的方法相比,直接將體細胞重編程為神經(jīng)元可以使起始細胞不經(jīng)歷脫分化的步驟,避免起始沉默基因自發(fā)地重新激活并介導多能性的恢復[19-20],從而降低了細胞移植術后形成腫瘤的風險[21]。本試驗利用含有單一小分子化合物的誘導培養(yǎng)基(N2B27、150 μmol/L Forsklin)處理小鼠成纖維細胞12 h后,更換成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h,將其誘導為神經(jīng)元,此研究有望為治療神經(jīng)退行性疾病提供一種有前途的細胞替代方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

昆明小鼠(KM小鼠),購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器設備

DMEM、南美胎牛血清(FBS)、F12、N2添加劑、B27添加劑,購自Gibco公司;磷酸緩沖鹽溶液(PBS),購自碧云天生物技術有限公司;Forsklin,購自賽默飛公司。

DMEM/F12:神經(jīng)基礎培養(yǎng)基(Neurobasal)(1∶1),0.5% N2添加劑,1% B27添加劑、100 μmol/L 環(huán)磷酸腺苷(cAMP),20 ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子(bFGE),20 ng/mL 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF),20 ng/mL 膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF), 20 ng/mL 神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3) 、青鏈霉素溶液(penicillin/streptomycin)和小分子化合物[即1 mmol/L丙戊酸(VPA)]、3 μmol/L CHIR99021、10 μmol/L Forsklin、10 μmol/L Y-27632和1 μmol/L Repsox。TRIzol,購自武漢賽維爾生物科技有限公司;瓊脂糖,購自BIOWEST公司;cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒,購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。超凈工作臺,蘇州佳德凈化科技公司產(chǎn)品;離心機,Eppendorf公司產(chǎn)品;電泳儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品;PCR儀,Analytikjena公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀,羅氏(Roche)公司產(chǎn)品;安捷倫2100 RNA Nano 6 000 Assay Kit,美國Agilent公司產(chǎn)品;K5500分光光度計,北京凱奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。以上儀器、設備均由廣西大學亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胚胎成纖維細胞的原代分離

孕鼠麻醉斷頸處死后,用75%乙醇浸泡一下迅速拿出,取出帶有胚胎的子宮。用PBS緩沖液洗滌后,解剖完整的所有胚胎,用剪刀剪開胚胎,剪掉頭部、四肢和內臟,其他部分用剪刀剪碎,將細小組織碎片貼于100 mm的培養(yǎng)皿放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,等其貼壁后加入DMEM(含血清)放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 神經(jīng)元的生成

在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)小鼠成纖維細胞(MEFs),第3代后的細胞用于后續(xù)試驗。當細胞密度達到90%時,將MEFs接種到96孔板中,加入DMEM(含血清)培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后,用PBS緩沖液清洗3遍,對照組加入N2B27培養(yǎng)液,試驗組加入含有單一小分子的誘導培養(yǎng)基(N2B27、150 μmol/L Forsklin),處理12 h后,兩組細胞均更換成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h,拍照對比。

1.2.3 誘導神經(jīng)元的RT-qPCR驗證

以N2B27培養(yǎng)液處理的小鼠成纖維細胞為對照組,誘導培養(yǎng)基(N2B27、150 μmol/L Forsklin)處理的小鼠成纖維細胞為試驗組。使用TRIzol法從樣品中提取總RNA,使用Vazyme HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(貨號R323-01)逆轉錄酶將RNA反轉錄為cDNA。選取神經(jīng)元相關基因以及成纖維相關基因進行RT-qPCR驗證,以小鼠GAPDH為內參,用 Vazyme Q711-02/03 試劑盒的方法對獲得的cDNA進行熒光定量PCR,引物序列見表1,反應體系見表2。反應程序:95 ℃預變性3 min;95 ℃ 變性10 s,60 ℃退火30 s,共40個循環(huán);95 ℃反應15 s。繪制熔解曲線。每個樣本設計4個技術重復孔,在Roche定量PCR儀中進行反應,數(shù)據(jù)結果采用2-△△CT法進行計算,用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 RT-qPCR反應體系Tab.2 qRT-PCR reaction system

1.2.4 誘導神經(jīng)元的免疫熒光驗證

將小鼠成纖維細胞接種于96孔板中培養(yǎng)過夜。對照組換N2B27培養(yǎng)液,試驗組換誘導培養(yǎng)基(N2B27、150 μmol/L Forsklin),培養(yǎng)12 h更換成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。誘導后進行熒光染色操作,棄去誘導液,用PBS洗3遍,孔板中加入4%的PFA中固定20～30 min;用阻斷液清洗3遍,每次3 min;孔板中加入1%的TritonX-100,室溫孵育15 min;用阻斷液清洗3遍,每次5 min;加入1%的BSA,封閉1.5～2.0 h;TBP清洗3遍,每次5 min;用1%的BSA按照說明書稀釋TUJ1、MAP2然后加入孔板中,4 ℃孵育過夜;室溫復溫20 min后,用TBP清洗3遍,每次5 min;將二抗和Hoechst用1%BSA稀釋,常溫孵育二抗1.5 h;TBP清洗3遍,每次5 min;加入PBS后即可拍照。

2 結果與分析

2.1 重編程過程中細胞形態(tài)變化

為了記錄重編程前后細胞形態(tài)的變化,對誘導前后細胞進行拍照觀察,對比發(fā)現(xiàn)誘導后的細胞變圓,并且有突觸出現(xiàn),證實誘導后的細胞在形態(tài)上與神經(jīng)元細胞相似(見圖1)。

圖1 小鼠成纖維細胞誘導前后形態(tài)Fig.1 Morphology of mouse fibroblasts before and after induction

2.2 誘導神經(jīng)元定量PCR驗證

收集誘導前后細胞樣品,對神經(jīng)元相關基因TUJ1、MAP2、NSE及成纖維相關基因Fn、CTGF進行RT-qPCR驗證。結果顯示,神經(jīng)元相關基因表達水平極顯著上調(P<0.01),成纖維相關基因極顯著下調(P<0.01),見圖2。

圖2 誘導神經(jīng)元定量PCR基因表達水平Fig.2 Quantitative PCR gene expression in induced neurons

2.3 誘導神經(jīng)元相關蛋白表達驗證

對誘導前后的小鼠成纖維細胞進行免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元相關蛋白TUJ1、MAP2的表達呈陽性(見圖3)。

圖3 細胞免疫熒光染色檢測神經(jīng)元標志物TUJ1、MAP2表達量Fig.3 The expression levels of TUJ1 and MAP2 detected by immunofluorescence staining

3 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的神經(jīng)元是終末分化的細胞,由于轉錄組和染色質景觀的變化,它們在成熟過程中逐漸失去支持再生的能力[22]。為解決神經(jīng)元在受傷后無法再生這一問題,以往的研究人員通過將成纖維細胞重編程為iPSCs,iPSCs在體內分化為神經(jīng)元[18]。近年來研究發(fā)現(xiàn)成纖維細胞可以通過重新編程為胚胎外內胚層樣狀態(tài),繞過iPSC階段,直接轉化為功能性神經(jīng)元[23]。這一方法減少了自發(fā)突變發(fā)生的機會; 也避免了iPSC的生成, 減少了畸胎瘤出現(xiàn)的風險[24]。

研究人員將成纖維細胞重編程為神經(jīng)元主要通過兩類方法,分別是以外源性轉錄因子傳遞方法和非整合基因傳遞方法,細胞膜可滲透蛋白質和小分子化合物。研究人員找出了一些與神經(jīng)發(fā)育過程有關的基因,轉入小鼠成纖維細胞,成功得到誘導性神經(jīng)元。但該試驗得到的神經(jīng)元不具備特異性。而后研究人員聯(lián)合應用11種因子并在此基礎上添加NEUROD1,就可將人成纖維細胞轉化成運動性神經(jīng)元[25]。在動物方面,豬成纖維細胞能夠被microRNA(miR-9 / 9*和miR124)和Ascl1直接重編程為神經(jīng)元[26]。但是外源性轉錄因子、異位基因等方法效率較低并存在一些安全問題。為解決上述問題,研究人員開始選擇加入小分子的方法來提高誘導效率。研究人員篩選出與神經(jīng)元生物發(fā)生過程相關的小分子,并聯(lián)合轉錄因子NGN2將人胚肺成纖維細胞重編程成神經(jīng)元[27-28]。隨后該團隊在此基礎上將慢病毒載體感染皮膚成纖維細胞,并添加小分子誘導得到神經(jīng)元,但是該神經(jīng)元生物活性較差。在低氧條件下[29],通過小分子化合物組合誘導大鼠成纖維細胞重編程神經(jīng)前體細胞,該細胞具有體內與體外誘導分化為神經(jīng)膠質細胞和神經(jīng)元的潛能。在大鼠上,可以通過小分子化合物組合(SMs)將大鼠胚胎成纖維細胞在體內和體外有效重編程為誘導神經(jīng)元[30]。鄧宏魁團隊利用小分子組合將小鼠成纖維細胞直接重編程成為功能性神經(jīng)元[31]。

Forskolin具備影響神經(jīng)元產(chǎn)生和活動等作用,據(jù)報道通過一種轉錄因子Ascl1和化合物Forsklin聯(lián)合作用將小鼠成纖維細胞轉化為細小白蛋白神經(jīng)元[32],同時Forskolin可以通過提高cAMP水平作用軸突CB1受體來影響神經(jīng)元的活動[33]。本課題組的研究通過改變多種小分子組合的誘導方式,利用單一小分子化合物Forskolin誘導小鼠成纖維細胞直接重編程為神經(jīng)元,并在基因和蛋白層面表達神經(jīng)元相關的標志物。

本研究無需低氧條件,利用單一小分子化合物組合將小鼠成纖維細胞重編程成神經(jīng)元,誘導條件十分簡便。與成纖維細胞重編程為iPSCs、iPSCs再分化為神經(jīng)元方法相比,不經(jīng)過iPSC階段直接轉化為神經(jīng)元安全性更高,這主要由于iPSCs細胞除具有全能性之外,同時還擁有其起始細胞的分子痕跡[24]。在再生醫(yī)學研究領域, 無法排除腫瘤或其他畸變細胞的風險, 并最終無法安全應用于細胞類型的臨床醫(yī)療當中。與小分子化合物介導重編程相比,傳統(tǒng)重編程方法主要是依賴于病毒介導的轉導引入外源性遺傳物質,被用于促進細胞命運的變化,它們具有將外來DNA片段整合到基因組中的潛在風險,這會導致不可預測的副作用,例如腫瘤形成。此外將目的基因瞬時引入細胞這一傳統(tǒng)重編程方法相對更安全,也被用于誘導細胞命運的變化,但其具有效率低、試驗設置復雜和成本高等缺點[34]。小分子化合物安全性和效率更高,成本更低,使用條件易于優(yōu)化,不需要改變細胞的遺傳物質,使用小分子可以提供獨特的控制[35],因此小分子化合物對細胞重編程是安全的,對于后續(xù)臨床應用是更為理想的選擇。

綜上所述,利用單一小分子化合物將小鼠胚胎成纖維細胞直接重編程為神經(jīng)元這一方法為治療神經(jīng)退行性疾病或損傷提供了重要的理論基礎,并為化學重編程和細胞治療提供了臨床應用的可能性。

4 結 論

本試驗通過分離小鼠胚胎成纖維細胞原代并傳代培養(yǎng),利用單一小分子化合物Forskolin處理該細胞直接重編程獲得神經(jīng)元。這將為神經(jīng)元無法再生造成的神經(jīng)退行性疾病提供更為簡便、快捷、高效的治療方法,對將Forskolin等用于控制細胞命運、狀態(tài)和功能的小分子推向再生醫(yī)學、轉化為臨床應用提供新的研究方向。