蠑螈AGR2 基因的生物信息學(xué)分析

馮亞龍，蔡惠敏，張鑫鈺，王露晴，王文蕾，山有玲，蔡璐璐

（ 咸陽師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000 ）

前梯度蛋白（anterior gradient，AGR）屬于蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶家族，包括AGR1、AGR2、AGR3[1-4]。AGR2 首次在非洲爪蟾中被發(fā)現(xiàn)，與胚胎外胚層的形成密切相關(guān)[5-7]。越來越多的研究表明，AGR2 與癌癥進(jìn)展關(guān)系密切，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、食管癌和前列腺癌等[8-13]。蠑螈是兩棲類脊椎動物，具有較高的觀賞價值，但在飼養(yǎng)過程中當(dāng)其皮膚出現(xiàn)傷口時，常因為患水霉病而死亡，可見促進(jìn)其傷口愈合對預(yù)防水霉病非常重要。最新研究表明，AGR2能夠加速小鼠皮膚傷口愈合，提示AGR2可能對蠑螈皮膚傷口愈合至關(guān)重要[14]。此外，蠑螈在肢體受損后能夠再生出完整肢體，這種超強(qiáng)的再生能力令科研工作者著迷，揭示蠑螈肢體再生的分子機(jī)制對指導(dǎo)傷殘肢體再生至關(guān)重要[15-18]。已有研究表明，蠑螈肢體成功再生在傷口表皮與肢體神經(jīng)的交互作用下完成，兩者缺一不可[19-20]。AGR2 在蠑螈再生肢體神經(jīng)鞘的雪旺氏細(xì)胞中高表達(dá)，并且AGR2 能夠恢復(fù)蠑螈去神經(jīng)肢體的再生能力。由此可見，AGR2在蠑螈肢體再生中起到關(guān)鍵作用[21-23]。然而，目前對蠑螈AGR2基因的基本生物學(xué)信息知之甚少，阻礙了對其進(jìn)一步研究。因此，本研究擬通過多種生物信息學(xué)分析軟件對5 種蠑螈AGR2 基因的基本生物學(xué)信息進(jìn)行分析，為其進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取斑點(diǎn)鈍口螈（HQ676606.1）、美西鈍口螈（KC253228.1）、東方蠑螈（KF146225.1）、綠紅東美螈（EF667357.1）、黑斑肥螈（KC295222.1）、非洲爪 蟾（CAJ82848.1）、牛（DAA30743.1）、鱷龜（KAG6939899.1）、野 鴿（PKK32056.1） 、人（EAL24283.1） 、小鼠（AAH13334.1） 、大 鼠（EDM03310.1） 、斑 馬 魚（AAI52145.1）、原雞（XP_418698.1）、大西洋鮭魚（XP_014033406.1）的AGR2核苷酸序列及編碼氨基酸序列。

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利 用ProtParam 工 具（http://www. expasy. org/tools/protparam.html）預(yù)測AGR2 基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，包括分子量、等電點(diǎn)、分子式、原子總數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶指數(shù)和平均親水性指數(shù)等。

利 用SignalP 4.1（https://services. healthtech. dtu. dk/service.php?SignalP-4.1）預(yù)測AGR2 信號肽；采用NCBI Conserved Domain Search 預(yù)測其結(jié)構(gòu)域；AGR2 的二級結(jié)構(gòu)信息分析采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）。

利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）網(wǎng)站對蠑螈AGR2 蛋白進(jìn)行同源建模，采用Pymol軟件分析其三級結(jié)構(gòu)。

利用DNAMAN 7.0 軟件進(jìn)行多個物種AGR2 氨基酸序列比對分析；最后利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建AGR2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠑螈AGR2蛋白的基本理化性質(zhì)分析（見表1）

由表1 可知，5 種蠑螈AGR2 基因的開放閱讀框均為501 bp，編碼166個氨基酸。5種蠑螈AGR2蛋白質(zhì)的分子量大致相等，均為18 kD左右；等電點(diǎn)值接近，分別為9.01、8.87、9.16、9.20、9.16。蠑螈AGR2 蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，表明其為穩(wěn)定蛋白質(zhì)；蠑螈AGR2 蛋白的脂溶指數(shù)為93.37～102.77，平均親水性指數(shù)為-0.368～-0.286，表明其屬于親水性蛋白質(zhì)。

2.2 蠑螈AGR2的信號肽分析（見圖1）

由圖1 可知，5 種蠑螈的AGR2 均為分泌蛋白，預(yù)測的信號肽剪切位點(diǎn)位于20～21氨基酸殘基處。

2.3 蠑螈AGR2的二級結(jié)構(gòu)分析（見圖2）

由圖2可知，斑點(diǎn)鈍口螈的AGR2包含45.18%的α-螺旋、7.23%的β-折疊、16.27%的延伸鏈、31.33%的無規(guī)則卷曲；美西鈍口螈的AGR2 包含43.37%的α-螺旋、6.02%的β-折疊、17.47%的延伸鏈、33.13%的無規(guī)則卷曲；東方蠑螈的AGR2 包含48.19%的α-螺旋、6.02%的β-折疊、13.86%的延伸鏈、31.93%的無規(guī)則卷曲；綠紅東美螈的AGR2包含48.19%的α-螺旋、5.42%的β-折疊、15.06%的延伸鏈、31.33%的無規(guī)則卷曲；黑斑肥螈的AGR2 包含51.81%的α-螺旋、7.23%的β-折疊、12.05%的延伸鏈、28.92%的無規(guī)則卷曲。

2.4 蠑螈AGR2的三級結(jié)構(gòu)分析

通過Swiss-Model 同源建模網(wǎng)站搜索發(fā)現(xiàn)蠑螈的AGR2序列與人AGR2（PDB code: 2lns）最接近。由建模結(jié)果可知，蠑螈AGR2 蛋白包含4 個α-螺旋和3 個β-折疊，這種結(jié)構(gòu)與硫氧還原蛋白折疊相似（見圖3）。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，蠑螈AGR2在第38～166氨基酸殘基處存在硫氧還原蛋白類超家族結(jié)構(gòu)域。此外，催化結(jié)構(gòu)域位于第2個α-螺旋的N末端。

圖3 蠑螈AGR2蛋白三級結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Tertiary structures analysis of newt AGR2 proteins

2.5 AGR2氨基酸序列比對分析（見表2、圖4）

圖4 AGR2蛋白多序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of AGR2 proteins

表2 AGR2氨基酸序列同源性分析Tab.2 Amino acid sequence homology analysis of AGR2 單位：%

由表2、圖4 可知，5 種蠑螈AGR2 氨基酸序列彼此高度相似，斑點(diǎn)鈍口螈與美西鈍口螈、東方蠑螈、綠紅東美螈、黑斑肥螈的同源性分別為94.85%、86.99%、82.53%、87.67%；美西鈍口螈與東方蠑螈、綠紅東美螈、黑斑肥螈的同源性分別為86.99%、83.56%、87.67%；東方蠑螈與綠紅東美螈、黑斑肥螈的同源性分別為89.16%、96.99%；綠紅東美螈與黑斑肥螈的同源性為90.36%。5 種蠑螈與非洲爪蟾具有較高的同源性，斑點(diǎn)鈍口螈、美西鈍口螈、東方蠑螈、綠紅東美螈、黑斑肥螈與非洲爪蟾的同源性分別為73.05%、72.46%、75.62%、73.42%、75.00%。

此外，所有物種AGR2硫氧還原蛋白類超家族結(jié)構(gòu)域氨基酸序列十分保守。

2.6 AGR2系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（見圖5）

圖5 AGR2系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of AGR2

由圖5可知，該進(jìn)化樹共分為2個大類，其中5種蠑螈聚成一個亞類并與非洲爪蟾聚成一個大類，哺乳動物、爬行動物、鳥類、魚類聚成一個大類。由此可知，蠑螈AGR2在進(jìn)化上與同為兩棲類的非洲爪蟾AGR2親緣關(guān)系較近，與哺乳動物、爬行動物、鳥、魚AGR2的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

AGR2在蠑螈傷口愈合及肢體再生過程中扮演重要角色，因此，解析其生物學(xué)信息對預(yù)防水霉病及指導(dǎo)人類肢體再生至關(guān)重要。本研究對5種蠑螈AGR2基因的生物信息進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，這5種蠑螈AGR2基因的核苷酸序列及編碼氨基酸序列彼此高度相似，AGR2 蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)也十分相似。已有研究顯示，蠑螈AGR2能夠與芽基細(xì)胞表面的Prod1受體結(jié)合，表明蠑螈AGR2是一種分泌蛋白，與本研究預(yù)測的結(jié)果一致[24]。與其他物種相同，蠑螈AGR2 蛋白包含一個硫氧還原蛋白類超家族結(jié)構(gòu)域，其中含有一個催化結(jié)構(gòu)域和一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列，該結(jié)構(gòu)域十分保守，因此可推測蠑螈AGR2 可能與保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，并且可以以其他物種AGR2 的功能為指導(dǎo)研究蠑螈AGR2 的功能[2,25-26]。同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，蠑螈AGR2與非洲爪蟾AGR2親緣關(guān)系最近，與其在進(jìn)化上的關(guān)系一致。本研究將為蠑螈AGR2蛋白功能的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，5 種蠑螈AGR2 基因編碼蛋白質(zhì)均是由166個氨基酸組成的穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，分子量均為18 kD左右，理論等電點(diǎn)為8.87～9.20，存在一個信號肽，其二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，三級結(jié)構(gòu)包含一個保守的硫氧還原蛋白類超家族結(jié)構(gòu)域。蠑螈AGR2 與非洲爪蟾AGR2親緣關(guān)系最近。