山豆根多糖對(duì)豬圓環(huán)病毒Ⅱ型感染3D4/2細(xì)胞增殖活性及炎癥信號(hào)通路基因調(diào)控作用的研究

韋秋旭，趙 怡，楊 劍，陳虹伶，李禧夢(mèng)，馮國(guó)越，胡焜翔，胡庭俊

（ 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005 ）

豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（porcine circovirus type 2，PCV2）是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒CVAD）的主要病原體，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。PCV2 亦與其他病毒產(chǎn)生共感染，如與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的混合感染在國(guó)內(nèi)外均造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。且由于病毒基因組不斷進(jìn)化，疫苗在豬生產(chǎn)中難以起到很好的保護(hù)作用[3]，因此尋找控制疾病發(fā)展的新方法迫在眉睫。

有研究表明，天然化合物具有良好的抗病毒作用[4-5]，中草藥中的抗病毒天然化合物的篩選備受關(guān)注。山豆根（Sophorae tonkinesisRadix.）是豆科植物越南槐（Sophora tonkinensisGapnep.）的干燥根與根莖，又稱廣豆根、苦豆根，具有清熱解毒、消腫止痛的功效[6]。山豆根多糖（SSP）是從山豆根中提取出的有效多糖成分，具有抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫等[7-8]活性。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SSP能夠降低PCV2感染誘發(fā)的RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[7]。本試驗(yàn)旨在研究SSP對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞系3D4/2細(xì)胞體外增殖活性的影響及SSP對(duì)PCV2感染誘發(fā)的炎癥相關(guān)信號(hào)通路基因的調(diào)控，旨在為SSP的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PCV2（SH 株）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室經(jīng)PK-15 細(xì)胞增殖保存，通過Reed-Muench法測(cè)定病毒滴度為104TCID50/0.1 mL。

試驗(yàn)所用SSP由廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取并保存，內(nèi)毒素含量＜0.005 μg/g。

3D4/2 細(xì)胞為豬肺泡巨噬細(xì)胞系傳代細(xì)胞，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室凍存?zhèn)鞔?/p>

1.2 主要試劑與儀器

CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)）；RNAiso plus（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；5× All-in-One Master Mix 及BlastaqTMGreen 2× qPCR Master Mix（愛必夢(mèng)生物科技有限公司）。

Multimode Plate Reader 多功能酶標(biāo)儀（瑞士PerkinElmer）；超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)GE 公司）；梯度PCR 儀、CFX96TMReal-Time System（美國(guó)BIO-RAD 公司）；3K-15 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）。

1.3 CCK-8 法測(cè)定SSP 對(duì)PCV2 感染3D4/2 細(xì)胞活性的影響

將3D4/2 細(xì)胞以1×105cell/mL，以每孔100 μL 鋪于96孔板中，共設(shè)7組，每組12個(gè)重復(fù)，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。經(jīng)DMEM 完全培養(yǎng)液或PCV2 處理2 h 后，分別加入含藥物或不含藥物培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)0、12、24、48 h，終止培養(yǎng)后按照CCK8 試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞增殖活性。具體試驗(yàn)分組及處理見表1。

表1 SSP對(duì)PCV2感染3D4/2細(xì)胞活性的影響試驗(yàn)分組與處理Tab.1 Grouping and treatment of the effect of SSP on the activity of 3D4/2 cells infected with PCV2

1.4 qRT-PCR 檢測(cè)SSP 對(duì)PCV2 感染3D4/2 細(xì)胞通路相關(guān)基因的影響

將3D4/2 細(xì)胞以2×105cell/mL，以每孔1 mL 鋪于12 孔板中，共設(shè)5 組，每組3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)分組及處理見表2。

表2 SSP對(duì)PCV2感染3D4/2細(xì)胞通路相關(guān)基因的影響試驗(yàn)分組與處理Tab.2 Grouping and treatment of genes related to the pathway of 3D4/2 cells infected with PCV2 by SSP

作用24 h 后，棄去培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次后加入RNAiso Plus 裂解5 min，按照說(shuō)明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后按照表3引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequence

反應(yīng)體系（20 μL）：酶10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8 μL。

擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線按照儀器自身設(shè)置進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD法進(jìn)行多重比較。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSP 對(duì)PCV2 感染3D4/2 細(xì)胞增殖活性的影響（見圖1）

圖1 SSP對(duì)PCV2感染的3D4/2細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Effect of SSP on proliferation activity in PCV2 infected-3D4/2 cells

為評(píng)估SSP 對(duì)PCV2 感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞系3D4/2細(xì)胞體外增殖活性調(diào)節(jié)作用，使用CCK-8 法測(cè)定了不同濃度SSP對(duì)PCV2感染的3D4/2細(xì)胞活性的影響。

由圖1（a）可知，各組細(xì)胞未經(jīng)病毒感染和藥物作用時(shí)，細(xì)胞活性水平均在0.95 以上，且各組間差異均不顯著（P＞0.05）。

由圖1（b）可知，PCV2感染3D4/2細(xì)胞12 h后，與細(xì)胞對(duì)照組相比，PCV2模型組細(xì)胞活性極顯著降低（P＜0.01）；與PCV2 模型組相比，SSP200 組及SSP400 組細(xì)胞活性均顯著升高（P＜0.05）。

由圖1（c）可知，PCV2感染3D4/2細(xì)胞24 h后，與細(xì)胞對(duì)照組相比，PCV2模型組細(xì)胞活性極顯著降低（P＜0.01）；與PCV2 模型組相比，SSP100 組及SSP200 組細(xì)胞活性顯著 升 高（P＜0.05），SSP400 組 細(xì) 胞 活 性 極 顯 著 升 高（P＜0.01）。

由圖1（d）可知，PCV2感染3D4/2細(xì)胞48 h后，與細(xì)胞對(duì)照組相比，PCV2模型組細(xì)胞活性極顯著降低（P＜0.01）；與PCV2 模型組相比，SSP100 組及SSP200 組細(xì)胞活性顯著 升 高（P＜0.05），SSP400 組 細(xì) 胞 活 性 極 顯 著 升 高（P＜0.01）。

綜上所述，SSP 濃度小于50 mg/L 時(shí)在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)3D4/2 細(xì)胞活性無(wú)顯著影響，與PCV2 模型組相比差異均不顯著（P＞0.05）；經(jīng)100～400 mg/L SSP 處理后，細(xì)胞活性在12 h 開始升高，且隨著時(shí)間增加細(xì)胞活性逐漸升高，但均低于正?；钚?，表明100～400 mg/L SSP 能夠顯著提高PCV2感染的3D4/2細(xì)胞體外增殖活性。

2.2 SSP對(duì)PCV2感染3D4/2細(xì)胞炎癥相關(guān)信號(hào)通路的影響（見圖2、圖3）

圖2 β-actin、p38和p65基因熔解曲線Fig.2 Melt curves of β-actin, p38 and p65 gene

圖3 SSP對(duì)PCV2感染的3D4/2細(xì)胞炎癥信號(hào)通路基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of SSP on inflammatory pathway gene expressions in PCV2-infected 3D4/2 cells

病毒感染能夠誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路激活，本試驗(yàn)使用qRT-PCR 檢測(cè)通路基因表達(dá)的變化以得到通路激活情況，結(jié)果見圖2。由圖2可知，熒光定量PCR熔解曲線峰單一無(wú)雜峰，引物設(shè)計(jì)合理，無(wú)非特異性產(chǎn)物。

由圖3 可知，與細(xì)胞對(duì)照組相比，PCV2 感染24 h 后3D4/2 細(xì)胞MAPK p38 mRNA 表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）；與PCV2模型組相比，不同濃度SSP作用后，p38表達(dá)水平極顯著下降（P＜0.01）。與細(xì)胞對(duì)照組相比，PCV2感染24 h后的3D4/2細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平極顯著上升（P＜0.01）；與PCV2 模型組相比，各濃度SSP 作用后能夠極顯著降低3D4/2 細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平（P＜0.01）。

3 討論

細(xì)胞增殖是細(xì)胞生長(zhǎng)的重要生理功能之一，是了解基因、蛋白質(zhì)和通路作用機(jī)制的重要手段[9]。中草藥多糖具有提高細(xì)胞活性、提升抗氧化能力、抗病毒能力等多種生物活性[10]。Deng 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能夠通過促進(jìn)miR-136-5p 和miR-149-5p 等miRNA 的表達(dá)，進(jìn)而改善高糖和棕櫚酸誘導(dǎo)的小鼠胰腺β 細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。靈芝多糖-金納米復(fù)合材料能夠促進(jìn)脾細(xì)胞中CD4+和CD8+T 細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制癌癥的進(jìn)程[12]。委陵菜多糖能夠增加RAW264.7 細(xì)胞NO 的分泌，并增進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，激活NF-κB 信號(hào)通路[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SSP在25～400 mg/L濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用[14]。本研究探討了SSP 對(duì)PCV2感染3D4/2細(xì)胞后細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示，100～400 mg/L SSP能夠顯著調(diào)節(jié)PCV2感染誘發(fā)的細(xì)胞活性降低現(xiàn)象，并且呈劑量依賴性。

有研究表明，病毒感染與炎癥密切相關(guān)。細(xì)胞因子通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）、p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 途徑誘導(dǎo)核因子-kB（NF-κB）活性，NF-κB通過釋放各種可誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用[15-16]。NF-κB 信號(hào)通路和MAPK 信號(hào)通路是重要的炎癥信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 通過激活NF-κB 與MAPKs 途徑導(dǎo)致促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生[17]。而病毒刺激能夠誘發(fā)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，激活NF-κB信號(hào)通路途徑，藥物可通過抑制NFκB活化從而抑制病毒等引發(fā)的炎癥反應(yīng)。山柰酚能夠通過p38 MAPK 信號(hào)通路降低炎性因子的表達(dá)發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[18]。江勇等[19]研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖能夠抑制白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等細(xì)胞因子的合成，通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的活化，進(jìn)而保護(hù)大鼠腸黏膜的免疫功能。

本研究結(jié)果顯示，PCV2 感染后3D4/2 細(xì)胞中p65 和p38 基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增多，而SSP 作用24 h 能夠顯著降低其表達(dá)，表明SSP 可抑制PCV2 感染誘導(dǎo)的3D4/2 細(xì)胞炎癥信號(hào)通路激活，其抗炎作用與抑制NF-κB 和MAPK通路的激活相關(guān)，這可能是山豆根多糖抗炎活性與抗病毒的重要機(jī)制，可為SSP的臨床應(yīng)用提供參考。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，100～400 mg/L SSP 作用12～48 h 能夠顯著提升PCV2 感染誘發(fā)的3D4/2 細(xì)胞活性，并在作用24 h時(shí)顯著降低PCV2感染誘發(fā)的3D4/2細(xì)胞中p65和p38基因的表達(dá)，但SSP 是否是通過NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)PCV2誘發(fā)的炎癥反應(yīng)仍需進(jìn)一步試驗(yàn)加以研究。