PRiME HLB固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中的雙酚A*

王玉梅，劉 真，姜 星

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 211198）

化妝品包裝除了可以美化外觀外，還可以阻止化妝品內(nèi)部與外界接觸，起到抗氧化和防腐的作用［1］。目前，化妝品的包裝材料的主要有玻璃、塑料、金屬箔等，其中，塑料包裝具有方便運輸、耐沖擊強(qiáng)度大等優(yōu)點，已經(jīng)成為化妝品常用的包裝材料。雙酚A（Bisphenol A，BPA）是用來合成聚碳酸酯、酚醛樹脂和不飽和聚酯樹脂等材料的重要物質(zhì)［2］，主要用于塑料瓶，食品、化妝品包裝的生產(chǎn)。但雙酚A屬于一種內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，對人的內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等有不良影響，嚴(yán)重時會誘發(fā)癌癥［3］。我國《化妝品技術(shù)規(guī)范》（2015版）明確規(guī)定雙酚A是化妝品中的禁用物質(zhì)［4］，但相應(yīng)的檢測方法不完善。目前，化妝品中雙酚A的檢測標(biāo)準(zhǔn)僅有SN／T 3822-2014和GB／T 30939-2014，兩者均使用氨基固相萃取小柱凈化，前處理過程復(fù)雜，且采用外標(biāo)法定量，存在基質(zhì)干擾、定量不準(zhǔn)確等現(xiàn)象，不能滿足日常的監(jiān)管檢驗需求。本研究針對水狀、膏霜狀和精油狀三種性狀化妝品基質(zhì)中雙酚A的殘留量，采用氨化乙腈提取，通過PRiME HLB固相萃取小柱凈化后，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中雙酚A，內(nèi)標(biāo)法定量，提取凈化方法靈敏快捷，以期為化妝品的監(jiān)管提供技術(shù)保障。

1 試驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

雙酚A（100.2μg／mL）、雙酚A-d4（100.0 μg／mL），天津阿爾塔科技有限公司；Oasis PRIME HLB固相萃取小柱，200mg／6mL，美國Waters公司；甲醇、乙腈、氨水，色譜級，德國Merck公司；甲酸、氟化銨，色譜級，上海阿拉丁生化科技股份公司；實驗用水為市購蒸餾水；其余試劑均為分析純。

Agilent 6470三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀 （配ESI源），美國安捷倫科技有限公司；Waters ACQUITY UPLC BEH C18，Waters公司；VISIPREP 24TM DL固相萃取裝置，Supelco公司；Sorvall LYNX 4000高速離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司；MV5濃縮氮吹儀，萊伯泰科有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

①提?。悍Q取0.5 g試樣（精確至0.001 g）于10mL具塞比色管中，加入50μL雙酚A-d4標(biāo)準(zhǔn)中間液，加入少量5%氨水-乙腈溶液充分混勻后定容至刻度，超聲提取15min后轉(zhuǎn)移至離心管中，10000 r／min離心5 min，取上清液備用。

②凈化：取全部上清液，過PRiME HLB固相萃取小柱，收集凈化液，40℃水浴中氮氣吹至近干，用甲醇溶解并定容至1.0mL，過0.22μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100mm×?2.0mm，1.7μm）；流速：0.4mL／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5μL；流動相：A（甲醇）、B（0.1%氟化銨水溶液）；梯度洗脫程序為0～2.5min，40%～90%A；2.5～4.6min，90%A；4.6～7.0min，90%～95%A；7.0～7.5min，95%A；7.5～7.6min，95%～40%A；7.6～10.0min，40%A。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧（ESI）離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：MRM多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流速：12 L／min；霧化氣壓力：275.8 kPa；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11 L／min；毛細(xì)管電壓：3500 V；雙酚A及其內(nèi)標(biāo)雙酚A-d4的保留時間、離子對、碰撞電壓和裂解電壓見表1。

表1 雙酚A及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

參照相關(guān)文獻(xiàn)［5］，色譜柱選用常規(guī)的適合小分子類物質(zhì)分離的Waters ACQUITY UPLC BEH C18（?2.1mm×50mm，1.7μm）。實驗首先考察了0.1%甲酸溶液-甲醇、水-甲醇和0.1%氨水溶液-甲醇三種流動相體系，結(jié)果表明，當(dāng)使用0.1%甲酸溶液-甲醇流動相體系時，雙酚A的相應(yīng)較弱；使用0.1%氨水溶液-甲醇流動相體系時；雙酚A的出峰時間較早，響應(yīng)也相對較弱，而使用水-甲醇流動相體系時雙酚A的響應(yīng)強(qiáng)度較高，色譜峰形較好。為了使雙酚A的響應(yīng)強(qiáng)度更高，故于流動相中添加0.1%氟化銨，結(jié)合前處理步驟中采用甲醇作為定容溶劑，因此本實驗確定流動相為0.1%氟化銨水溶液-甲醇。

實驗進(jìn)利用Agilent三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀自帶的Masshunter Optimizer軟件分析雙酚A及其內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得目標(biāo)物質(zhì)的母離子、子離子及對應(yīng)的碰撞能和裂解電壓。

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

本研究首先對比了乙腈和甲醇的作為提取溶劑的效果，結(jié)果表明，在水狀、膏霜狀、精油狀三種性狀化妝品基質(zhì)中，乙腈的提取效率均優(yōu)于甲醇，回收率均在80%上，故選擇乙腈作為提取溶劑。在此基礎(chǔ)上，實驗考察了1%甲酸乙腈溶液、乙腈和1%氨水乙腈溶液的提取效率，具體結(jié)果見圖1。實驗表明在乙腈中加入氨水后可以增強(qiáng)提取效果。

圖1 使用不同提取溶劑對提取效率的影響

實驗進(jìn)一步研究了1%、2%、5%、8%、10%、15%氨水乙腈溶液的提取效果，結(jié)果見圖2。發(fā)現(xiàn)使用5%和8%的氨水乙腈溶液時，三種不同性狀基質(zhì)中雙酚A的提取率都比較高?？紤]到前處理過程中有氮吹的步驟，實驗確定采用5%氨水乙腈溶液作為提取溶液，三種不同形狀基質(zhì)中提取效率均達(dá)到95%以上。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)的氨水乙腈對提取效率的影響

實驗進(jìn)一步研究了化妝品基質(zhì)的超聲時間的最優(yōu)條件，于三種性狀的化妝品基質(zhì)中加入20 ng雙酚A標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別超聲5、10、15、20、25min。結(jié)果表明，超聲時間15min后三種不同性狀基質(zhì)中雙酚A的提取率均大于90%以上，且提取效率保持恒定水平。

2.3 定量方式的選擇及基質(zhì)效應(yīng)的考察

采用質(zhì)譜分析時需考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響，一般采用基質(zhì)效應(yīng)（ME）＝（1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率／溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）×100%的計算方法來評價的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)在±20%內(nèi)不顯著，結(jié)果為正時表示基質(zhì)抑制，為負(fù)表明基質(zhì)增強(qiáng)［6］。

測定化妝品中的雙酚A的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)中大部分采用外標(biāo)法定量，但是實際實驗中發(fā)現(xiàn)采用外標(biāo)法定量時受化妝品基質(zhì)干擾較大，尤其是精油狀化妝品，基質(zhì)效應(yīng)明顯，測定的回收率＜50%，結(jié)果定量產(chǎn)生的誤差較大。本研究改用雙酚A-d4內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)峰形較好，基線噪音小，無干擾峰，保留時間與雙酚A接近。

本實驗進(jìn)一步考察了水狀、膏霜狀和精油狀三種性狀化妝品基質(zhì)于線性范圍2～50 ng／mL的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2。雙酚A在三種基質(zhì)中基質(zhì)效應(yīng)均不明顯，進(jìn)一步說明引入同位素內(nèi)標(biāo)后，雙酚A的基質(zhì)效應(yīng)得到了很好的改善。

表2 雙酚A的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

2.4 凈化方式的優(yōu)化

化妝品基質(zhì)復(fù)雜，一般由油脂、乳化劑等成分組成，膏霜狀和精油狀化妝品基質(zhì)提取后會出現(xiàn)渾濁難離心的狀況［7］，需要凈化后才能上機(jī)分析，否則會污染離子源，影響目標(biāo)物的響應(yīng)。

根據(jù)雙酚A的相關(guān)報道［8］，本實驗分別考察C18、PRIME HLB、MAX、氨基固相萃取小柱的吸附效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用C18柱凈化時，三種基質(zhì)中的雙酚A的回收率都比較低，使用MAX、氨基固相萃取小柱和PRIME HLB固相萃取柱時，雙酚A的回收率均能大于80%，但由于使用MAX和氨基固相萃取小柱時需要活化、洗脫等繁雜的實驗步驟，考慮到實驗的快速和便捷性，PRIME HLB不需要活化等前處理步驟，操作相對簡單，因此本實驗最終選擇PRIME HLB固相萃取小柱作為凈化柱。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍和檢出限

在本研究方法確定的前處理及分析條件下，對水狀、膏霜狀和精油狀三種性狀化妝品基質(zhì)中的雙酚A的線性范圍進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，雙酚A的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相關(guān)系數(shù)。雙酚A在2 ng／mL～50 ng／mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.99。具體結(jié)果見表2。

2.5.2 精密度與回收率實驗

于水狀、膏霜狀、精油狀三種性狀化妝品空白基質(zhì)中，按照定量限的1倍、2倍和10倍定量限的質(zhì)量濃度水平添加雙酚A，進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗。各質(zhì)量濃度水平均做6個平行，計算雙酚A的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3。由表3可知，水狀化妝品基質(zhì)中的雙酚A 的平均回收率為95.6% ～101.2%，相對偏差小于3.2%；膏霜狀化妝品基質(zhì)中的雙酚A的平均回收率為93.2%～98.8%，相對偏差小于4.2%；精油狀化妝品基質(zhì)中的雙酚A的平均回收率為92.5%～99.0%，相對偏差小于3.9%。

表3 雙酚A的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （n＝6）

2.6 實際樣品測定

實驗采用建立的方法進(jìn)行實際樣品的檢測，分別測定了90批次的樣品，包括水狀、膏霜狀和精油狀化妝品各30批。通過保留時間、離子豐度比等信息進(jìn)行判定，以上樣品中均未檢出雙酚A；樣品圖譜中無雜質(zhì)干擾峰，內(nèi)標(biāo)出峰正常。可能是因為所檢的化妝品均是品牌廠家生產(chǎn)的，具有良好的質(zhì)量保證。

3 結(jié)論

本實驗建立了PRiME HLB固相萃取-高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水狀、膏霜狀和精油狀三種化妝品基質(zhì)中的雙酚A殘留量。本方法前處理快捷簡便，定量準(zhǔn)確可靠，檢測靈敏度和精密度較好，為化妝品的監(jiān)管和風(fēng)險監(jiān)測提供了有力的技術(shù)支撐。