基于形態(tài)學(xué)特征和線(xiàn)粒體Cyt b序列的橫帶髭鯛野生與養(yǎng)殖群體比較

劉灝宇 宋日雨 鄭昀亞 馮啉曉 劉璐 楊天燕 高天翔

摘要 ?對(duì)橫帶髭鯛形態(tài)特征以及野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳差異進(jìn)行了分析。共測(cè)定94尾橫帶髭鯛的19項(xiàng)生物學(xué)特征。結(jié)果表明，野生群體和養(yǎng)殖群體間形態(tài)差異不明顯。同時(shí)，擴(kuò)增了野生群體和養(yǎng)殖群體的線(xiàn)粒體Cyt b基因片段，22尾橫帶髭鯛個(gè)體共檢測(cè)到5種單倍型，其中養(yǎng)殖群體僅有1種單倍型，野生群體具有5種單倍型，且養(yǎng)殖群體的單倍型多樣度及核苷酸多樣度均低于野生群體。基于橫帶髭鯛線(xiàn)粒體Cyt b片段構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)未發(fā)現(xiàn)該物種存在明顯的譜系結(jié)構(gòu)。綜上所述，相較于野生群體，橫帶髭鯛養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平較低，因此有必要采取科學(xué)的人工繁育技術(shù)與方法，提高養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平，以保護(hù)橫帶髭鯛的種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞 ?橫帶髭鯛；形態(tài)學(xué)；Cyt b基因；野生群體；養(yǎng)殖群體

中圖分類(lèi)號(hào) ?S 917.4 ??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A ??文章編號(hào) ?0517-6611（2023）05-0070-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.018

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Comparison between Cultured and Wild Populations of Hapalogenys analis Based on Morphological Characteristics and Mitochondrial DNA Cyt b

LIU Hao-yu，SONG Ri-yu，ZHENG Yun-ya et al

（Fisheries College，Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316022）

Abstract ?The morphological characteristics of H.analis and genetic differences between wild and cultured populations were analyzed.19 biological characteristics of 94 tails of H.analis were determined.The results showed that there was no significant morphological difference between wild population and cultured population.At the same time，Cyt b fragments of mitochondrial DNA in wild and cultured populations were amplified.A total of 5 kinds of haplotypes were detected in 22 individuals，only 1 kind of haplotype was found in the cultured population，5 kinds of haplotypes were found in the wild population.The haplotype diversity and nucleotide diversity in the cultured population were lower than those in the wild population.The haplotype network diagram and phylogenetic tree based on mitochondrial Cyt b fragment of H.analis did not reveal significant pedigree structure of the species.In conclusion，compared with the wild population，the level of genetic diversity of H.analis was significantly lower.It was necessary to adopt scientific artificial breeding techniques and methods to improve the genetic diversity and protect the germplasm resources of H.analis.

Key words ?Hapalogenys analis;Morphology;Cyt b gene;Wild population;Cultured population

橫帶髭鯛（Hapalogenys analis），俗稱(chēng)十六枚、海猴，隸屬硬骨魚(yú)綱（Osteichthyes）鱸形目（Perciforms）石鱸科（Pomadasyidae）髭鯛屬（Hapalogenys）［1］，主要生活在溫帶、亞熱帶海域。 它以小型魚(yú)類(lèi)及甲殼類(lèi)為食，是常見(jiàn)于礁區(qū)海域的底棲魚(yú)種，其肉質(zhì)鮮美、體色鮮艷，不僅具有食用價(jià)值，而且也是名貴的海水觀(guān)賞魚(yú)類(lèi)，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一［2］。由于橫帶髭鯛的野生資源總量偏少，捕撈量不大，近年來(lái)我國(guó)東南沿海多地已開(kāi)展了橫帶髭鯛的人工育苗及海水養(yǎng)殖［3-4］，橫帶髭鯛已成為海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)中非常具有發(fā)展?jié)摿Φ钠贩N。

盡管橫帶髭鯛具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但關(guān)于該物種的研究鮮有報(bào)道。目前，關(guān)于橫帶髭鯛的研究多集中在育苗及養(yǎng)殖方面［1，3-5］，而有關(guān)基礎(chǔ)研究相對(duì)較少［6-8］，其群體遺傳多樣性研究近乎空白。王世峰等［9］采用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)評(píng)估了廈門(mén)近海該物種野生群體的遺傳多樣性，但尚未有關(guān)于該物種養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性研究。養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性狀況會(huì)影響?zhàn)B殖品種的種質(zhì)質(zhì)量，倘若開(kāi)展相關(guān) 的增殖放流工作會(huì)對(duì)該物種野生群體產(chǎn)生一定影響。因此，有必要對(duì)橫帶髭鯛養(yǎng)殖及野生群體的遺傳多樣性開(kāi)展研究。筆者通過(guò)對(duì)橫帶髭鯛養(yǎng)殖群體和野生群體的形態(tài)學(xué)特征及DNA條形碼進(jìn)行比較分析，研究2個(gè)群體的形態(tài)和遺傳差異，旨在為橫帶髭鯛漁業(yè)資源的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

橫帶髭鯛來(lái)自舟山近海海域，共94尾。其中，野生群體64尾，養(yǎng)殖群體30尾。形態(tài)學(xué)測(cè)定后，取鰓蓋后緣側(cè)線(xiàn)上方肌肉進(jìn)行DNA提取。

1.2 形態(tài)學(xué)測(cè)量

對(duì)橫帶髭鯛進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)量，包括該物種的可量性狀和可數(shù)性狀，其中體長(zhǎng)測(cè)量工具為精確度1 mm的量魚(yú)板；體重測(cè)量工具為精確度0.01 g的電子秤；其余長(zhǎng)度測(cè)量使用精確度0.02 mm的游標(biāo)卡尺。對(duì)所有個(gè)體均測(cè)量以下可數(shù)、可量性狀：第一背鰭鰭條數(shù)、第二背鰭鰭條數(shù)、胸鰭鰭條數(shù)、腹鰭鰭條數(shù)、臀鰭鰭條數(shù)、尾鰭鰭條數(shù)、體重、全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體高、頭長(zhǎng)、體寬、尾柄長(zhǎng)、尾柄高、吻長(zhǎng)、眼徑、眼間距、眼后頭長(zhǎng)，在此基礎(chǔ)上計(jì)算19項(xiàng)可量性狀比。

1.3 DNA提取

采用常用酚試劑DNA提取法，每個(gè)樣本剪取約4 mm×4 mm的肌肉，剪碎放入離心管中，加入600 ?μL DNA裂解液、10 μL蛋白酶K在50 ℃下烘干至肌肉完全溶解。向離心管中加入500 μL Tris飽和酚，10 min搖勻后，12 000 r/min、4 ℃下離心7 min；離心結(jié)束后液體分層，吸取上層DNA溶液置于新離心管中，加入混合試劑［Tris飽和酚混合液 ∶氯仿 ∶異戊醇=25 ∶24 ∶1（體積比）］，10 min搖勻后以相同離心模式離心；繼續(xù)吸取上層清液，并加入400 μL混合試劑［氯仿 ∶異戊醇=24 ∶1（體積比）］，繼續(xù)以相同離心模式離心；吸取上層清液，進(jìn)行無(wú)水乙醇沉淀和75%乙醇洗滌，最后經(jīng)24 h風(fēng)干后加入超純水100 μL，通過(guò)離心獲得DNA提取產(chǎn)物，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序

擴(kuò)增橫帶髭鯛Cyt b基因全長(zhǎng)序列，所用引物為Cyt b-1F（CCCAGCATCA ACCCTAAG）、Cyt b-1R（GGTGGCGTTATCTACTGAA），Cyt b-2F（GGTCAT-CCTACTTCTTCTTGT）、Cyt b-2R（GGATGGCGTAAGCGAATA）。PCR預(yù)混體系參考楊天燕等［10］的方法，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件參照俞正森等［11］的方法，PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad T100，美國(guó)伯樂(lè)）進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束以后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（溫度為常溫，電壓為5 V，電泳緩沖液為5%TAE）和凝膠成像觀(guān)察，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物有限公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

將測(cè)序獲得的全部DNA序列利用DNAStar軟件包（DNA Star，Inc.Madison，USA）中的SeqMan軟件進(jìn)行校正與拼接，并剪去序列上的載體序列。利用Arlequin軟件［12］計(jì)算序列堿基含量百分比、單倍型及多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量、轉(zhuǎn)換/顛換比、單倍型多樣度、核苷酸多樣度，并進(jìn)行Tajima’D和Fu’s Fs中性檢驗(yàn)。根據(jù)單倍型頻率分布，構(gòu)建橫帶髭鯛單倍型網(wǎng)絡(luò)圖；使用MEGA 5.0軟件根據(jù)Cyt b片段構(gòu)建橫帶髭鯛群體間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并計(jì)算群體間和群體內(nèi)的遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

養(yǎng)殖和野生群體橫帶髭鯛的可量性狀比見(jiàn)表1。養(yǎng)殖及野生群體體型無(wú)明顯差異，均呈扁平方形，背呈拱形隆起，第一背鰭具多條鰭棘，腹部略呈淺弧形，身體側(cè)面5條淺白色帶與6條深棕色帶相間，腹部淺褐色，無(wú)頦須。此外，其背鰭第三棘與臀鰭第二棘較為發(fā)達(dá)，背鰭、臀鰭軟條部及尾鰭為鮮黃色并具黑緣，尾鰭圓形；耳石為透明度極低的盾形；根據(jù)可數(shù)性狀得到鰭式如下：D.XI，14～18；A.Ⅲ.8～10；V.I-5；P.14～20；C.17～21。

2.2 基于Cyt b序列片段的群體遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性分析

對(duì)9尾野生橫帶髭鯛和13尾養(yǎng)殖橫帶髭鯛的Cyt b基因序列進(jìn)行雙向測(cè)序，共獲得22條長(zhǎng)度503 bp的Cyt b基因片段，其中養(yǎng)殖群體編號(hào)AH1～AH13，野生群體編號(hào)A1～A9。該研究采集的橫帶髭鯛野生群體與養(yǎng)殖群體線(xiàn)粒體Cyt b序列堿基含量差異較小，其中A+T含量均略高于C+G含量。

基于橫帶髭鯛Cyt b序列片段構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖如圖1所示，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的譜系結(jié)構(gòu)。22尾橫帶髭鯛個(gè)體共檢測(cè)到4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，檢測(cè)到5種單倍型（表2）。其中，養(yǎng)殖群體只檢測(cè)到1種單倍型，遺傳差異較小且不存在變異序列；野生群體檢測(cè)到5種單倍型，且野生群體與養(yǎng)殖群體間有1種共同的單倍型，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)2個(gè)，顛換位點(diǎn)2個(gè)，轉(zhuǎn)換/顛換比為1 ∶1。養(yǎng)殖群體單倍型多樣度和核苷酸多樣度均為0；野生群體的單倍型多樣度為（0.805 6±0.119 6），核苷酸多樣度為（0.002 3±0.001 9），均高于養(yǎng)殖群體（表3）。對(duì)橫帶髭鯛野生群體的中性檢驗(yàn)顯示：Tajima’D值（Tajima’D=-0.842 57，P＞0.05）與Fu’s Fs值（Fu’s=-2.109 15，P＜0.05）均為負(fù)值，根據(jù)中性檢驗(yàn)原理，證實(shí)該野生群體的擴(kuò)張。

采用鄰接法利用22尾橫帶髭鯛Cyt b片段序列構(gòu)建系?統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明在該系統(tǒng)樹(shù)上明顯分為2個(gè)組群（圖2）。其中，野生群體的A4、A6、A9與養(yǎng)殖群體的所有個(gè)體先聚為一支，野生群體其余個(gè)體聚為另一支，2個(gè)組群間的平均遺傳距離為0.000 2，養(yǎng)殖群體內(nèi)各個(gè)體間沒(méi)有遺傳差異，野生群體內(nèi)各個(gè)體的平均遺傳距離為0.002 0（0.000 0～0.006 0）。

3 討論

在魚(yú)類(lèi)學(xué)研究中，形態(tài)學(xué)研究是最基本且最主要的方法之一，是生物分類(lèi)學(xué)的主要依據(jù)［13-14］。該研究采用魚(yú)類(lèi)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法，測(cè)量了橫帶髭鯛養(yǎng)殖群體和野生群體的可數(shù)、可量性狀，并對(duì)2個(gè)群體進(jìn)行比較分析，探討2個(gè)群體存在的差異。結(jié)果顯示，橫帶髭鯛野生與養(yǎng)殖群體在形態(tài)特征方面差異不明顯，尚未出現(xiàn)遺傳性狀分化的現(xiàn)象。

迄今為止，還沒(méi)有針對(duì)橫帶髭鯛野生和養(yǎng)殖群體遺傳學(xué)方面的比較研究。王世峰等［9］關(guān)于評(píng)估廈門(mén)近海橫帶髭鯛野生群體的遺傳多樣性研究表明，該群體具有較高的遺傳多樣性，但未與養(yǎng)殖群體進(jìn)行比較。近年來(lái)，線(xiàn)粒體Cyt b基因因其進(jìn)化速度適中、變異率相對(duì)較高等特點(diǎn)，已被用于多種魚(yú)類(lèi)的種內(nèi)群體間的比較研究［15-16］。該研究橫帶髭鯛線(xiàn)粒體Cyt b片段測(cè)序結(jié)果顯示，野生橫帶髭鯛的單倍型多樣度為（0.805 6±0.119 6），核苷酸多樣度為（0.002 3±0.001 9），均高于養(yǎng)殖群體。據(jù)推測(cè)，在人工繁育過(guò)程中發(fā)生的近親繁殖、親本數(shù)量減少以及遺傳漂變等現(xiàn)象可能是導(dǎo)致該物種養(yǎng)殖群體遺傳多樣性較低的原因［17-18］。此外，較高水平的物種多樣性有助于提高該物種的環(huán)境適應(yīng)及生存能力［19］。該研究結(jié)果也表明，更能適應(yīng)外界環(huán)境變化的野生群體比養(yǎng)殖群體有更高的遺傳多樣性。養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性低于野生群體的現(xiàn)象在其他魚(yú)類(lèi)研究中也有所報(bào)道。宋娜等［20］通過(guò)對(duì)香魚(yú)野生與養(yǎng)殖群體進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，該物種養(yǎng)殖群體單倍型多樣度與核苷酸多樣度均低于野生群體；趙祥等［21］通過(guò)對(duì)黃姑魚(yú)2個(gè)養(yǎng)殖群體及5個(gè)野生群體的線(xiàn)粒體控制區(qū)序列進(jìn)行比較， 發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖群體單倍型多樣度與核苷酸多樣度均低于野生群體。從橫帶髭鯛的群體單倍型分布來(lái)看，養(yǎng)殖群體單倍型單一，結(jié)合線(xiàn)粒體 DNA遵循母系遺傳的特點(diǎn)，推測(cè)可能是因該物種人工繁育過(guò)程中所用親魚(yú)數(shù)目較少所致。

4 結(jié)論

橫帶髭鯛野生群體與養(yǎng)殖群體在形態(tài)學(xué)上差異不明顯。在遺傳學(xué)方面，與橫帶髭鯛野生群體相比，養(yǎng)殖群體遺傳多樣性較低。在今后的橫帶髭鯛人工繁育工作中，應(yīng)保證足夠多的野生橫帶髭鯛親本數(shù)量，以確保養(yǎng)殖群體的遺傳多樣水平維持在一個(gè)較高的水平。同時(shí)，應(yīng)保證今后用于增殖放流的苗種群體遺傳學(xué)監(jiān)測(cè)，以減輕增殖放流對(duì)野生橫帶髭鯛資源的遺傳學(xué)影響，實(shí)現(xiàn)橫帶髭鯛野外資源的可持續(xù)利用。

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