綠原酸調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-CHOP通路對安氟烷誘導(dǎo)大鼠肝毒性的保護(hù)作用

張思思 蔡英敏 王武濤 喬艷

鹵代吸入麻醉劑是目前被廣泛應(yīng)用于全身麻醉的一種藥物,但其對肝臟有不同程度的損傷[1]。安氟烷是鹵代吸入麻醉劑中的一種,產(chǎn)生作用緩慢,常與其他藥物一起誘導(dǎo)麻醉,盡管其肝毒性較低于氟烷,但依然能夠在術(shù)后引起急性肝損傷[2]。因此,深入研究術(shù)后麻醉劑誘導(dǎo)的肝損傷機制及其預(yù)防途徑是必要的。綠原酸(Chlorogenic acid,CGA)是一種多酚,多存在與咖啡、山楂、山藥、金銀花等物質(zhì)中,具有抗炎、抗菌、抗癌以及神經(jīng)保護(hù)等多種作用[3]。研究已經(jīng)證實,CGA能夠減輕他莫昔芬介導(dǎo)的肝腎損傷,同時也可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕腎損傷[4,5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激是由ER內(nèi)積累的未折疊或錯誤折疊蛋白激活的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。蛋白激酶RNA樣ER激酶(PERK)是介導(dǎo)UPR的信號通路的上游因子之一,其磷酸化能夠誘導(dǎo)下游真核翻譯起始因子2α(eIF2α)磷酸化,激活促凋亡轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn),通過抑制ER應(yīng)激可以降低肝細(xì)胞中的炎性體活化改善肝損傷,也可以降低細(xì)胞凋亡率減輕藥物誘導(dǎo)的肝損傷[7]。因此,基于上述了解,本研究利用安氟烷誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生肝損傷,探討CGA保護(hù)大鼠肝毒性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠60只,8周齡體重160～200 g,購于卡文斯百格(蘇州)模式動物研究有限公司,許可證號：SCXK(蘇)2018-0002。大鼠均在溫度24～26℃,濕度60%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 藥品及試劑 安氟烷(上海雅培制藥有限公司);PERK激活劑CCT020312(CCT,貨號：HY-119240,MedChemExpress);天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(貨號：EK-R38215、EK-R37339、EK-R37579,上海酶研生物科技有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：G1120,北京索萊寶科技有限公司);TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號：40307ES20,翌圣生物科技股份有限公司);BCA檢測試劑盒(貨號：JLC-G7687,江西江藍(lán)純生物試劑有限公司);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(貨號：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005,北京索萊寶科技有限公司);PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP一抗(貨號：ab79483、ab192591、ab169528、ab227593、ab11419,英國Abcam公司);山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP(貨號：GARG80-0500、AS16-3715,艾美捷科技有限公司);BCL2、BAX(貨號：ab32124、ab32503,英國Abcam公司);酶標(biāo)儀(型號：ELx808,美國Bio-Tek公司);倒置熒光顯微鏡(型號：IX83,儀景通光學(xué)科技有限公司);iBright凝膠成像儀(型號：CL750,賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分組、造模和給藥：將所有大鼠隨機分為對照組、模型組、CGA低劑量組、CGA高劑量組、CGA高劑量+PERK激活劑組(CGA-H+CCT組),每組12只。除對照組外,其他組均以2 L/min的流量吸入1.7%的安氟烷4 h[8];對照組相同條件吸入等量的氧氣;CGA低、高劑量組在吸入安氟烷1 h前分別以10 mg/kg、50 mg/kg的劑量開始灌胃給藥[9];CGA-H+CCT組先腹腔注射1 mg/kg的PERK激活劑CCT020312[10],再灌胃50 mg/kg的CGA;對照組和模型組均灌胃等體積的純凈水。2次/d,持續(xù)5 d。

1.3.2 檢測大鼠血清中肝功能指標(biāo)AST、ALT、ALP的活性：所有大鼠在實驗結(jié)束后進(jìn)行尾靜脈采血5 ml,3 000×g,4℃離心15 min,收集上清并保存于-20℃,備用。試劑盒檢測大鼠血清AST、ALT、ALP的活性。

1.3.3 檢測血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平：按照TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒的步驟制作標(biāo)椎曲線,然后將血清分別與不同的生物素化抗體反應(yīng)完全后,檢測450 nm處的OD值,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度。

1.3.4 HE染色觀察大鼠肝組織的病理變化：采血結(jié)束后,所有大鼠用1%的戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)麻醉并處死,解剖并分離肝臟組織,部分(n=6)固定于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行石蠟包埋并切片,剩余組織(n=6)保存于-80℃。將石蠟切片用二甲苯和乙醇浸泡脫蠟后,使用HE染色液進(jìn)一步染色,并用PBS沖洗切片。光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的病理變化。

1.3.5 TUNEL染色檢測大鼠肝細(xì)胞凋亡：取1.3.4中的石蠟切片進(jìn)行脫蠟、再水化,然后用蛋白酶K稀釋液孵育30 min。接著將切片置于50 μl準(zhǔn)備好的TUNEL工作液中,37℃避光孵育1 h,再用DAPI在避光條件下復(fù)染10 min,最后用PBS洗滌并封片。熒光顯微鏡下觀察488 nm處細(xì)胞的凋亡情況。

1.3.6 Western blot檢測大鼠肝組織中ER應(yīng)激蛋白PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP的表達(dá)：將1.3.4中凍存的組織(n=6)勻漿,制備蛋白樣品并測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用脫脂奶粉封閉液4℃過夜孵育,然后分別加入PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP一抗(PERK、eIF2α稀釋比例,為1∶500,p-PERK、p-eIF2α稀釋比例為1∶1 000,CHOP稀釋比列為1∶200)室溫孵育1 h。洗膜后分別加入羊抗兔或羊抗小鼠稀釋液(稀釋比例均為1∶5 000)室溫孵育1 h。洗膜后用ECL顯影劑顯影,用凝膠成像儀成像。以GAPDH為內(nèi)參蛋白,利用Image J對目的蛋白進(jìn)行定量分析。

1.3.7 免疫組化法檢測大鼠肝組織中BCL2、BAX蛋白水平 將1.3.4中石蠟切片脫蠟再水化,然后將切片放在封閉液中封閉2 h,再與BCL2、BAX一抗稀釋液(稀釋比例為1∶1 000)在4°C孵育過夜,PBS清洗后與羊抗兔二抗(稀釋比例均為1∶5 000)一起孵育1 h,PBS清洗后用DAB染色,蘇木素復(fù)染。使用Image J軟件分析并計算BCL2、BAX陽性表達(dá)區(qū)域光密度值。

2 結(jié)果

2.1 CGA對安氟烷誘導(dǎo)的大鼠血清中AST、ALT的影響 與對照組比較,模型組大鼠的血清中AST、ALT、ALP活性升高(P<0.05);與模型組比較s,CGA低、高劑量組血清中AST、ALT、ALP活性降低(P<0.05),且CGA高劑量組AST、ALT、ALP活性低于低劑量組(P<0.05);與CGA高劑量組比較,CGA-H+CCT組血清中AST、ALT、ALP活性升高(P<0.05)。見表1。

表1 CGA對大鼠血清中AST、ALT、ALP活性的影響 n=12,U/L,

2.2 CGA對安氟烷誘導(dǎo)的大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);與模型組比較,CGA低、高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05),且CGA高劑量組炎性因子水平低于低劑量組(P<0.05);與CGA高劑量組比較,CGA-H+CCT組組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 CGA對大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 n=12,pg/ml,

2.3 CGA對安氟烷誘導(dǎo)的大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 與對照組相比,模型組大鼠肝細(xì)胞數(shù)量減少,排列不規(guī)則,且出現(xiàn)腫脹和空泡;與模型組相比,CGA低、高劑量組大鼠肝細(xì)胞數(shù)量增多且排列有序,有輕微腫脹,空泡減少;與CGA高劑量組相比,CGA-H+CCT組肝組織的病理損傷加重。見圖1。

對照組 模型組 CGA低劑量組 CGA高劑量組 CGA-H+CCT組

2.4 CGA對安氟烷誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較,模型組大鼠中肝細(xì)胞的凋亡率升高(P<0.05);與模型組比較,CGA低、高劑量組大鼠肝細(xì)胞的凋亡率降低(P<0.05),且CGA高劑量組凋亡率低于低劑量組(P<0.05);與CGA高劑量組比較,CGA-H+CCT組大鼠肝細(xì)胞的凋亡率升高(P<0.05)。見圖2,表3。

對照組 模型組 CGA低劑量組 CGA高劑量組 CGA-H+CCT組

表3 CGA對大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響 n=6,%,

2.5 CGA對安氟烷誘導(dǎo)的大鼠肝組織中PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP蛋白的影響 與對照組比較,模型組大鼠肝組織中p-PERK、p-PERK/PERK、p-eIF2α、p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與模型組比較,CGA低、高劑量組肝組織p-PERK、p-PERK/PERK、p-eIF2α、p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表達(dá)升高(P<0.05),且CGA高劑量組蛋白表達(dá)高于低劑量組(P<0.05);與CGA高劑量組比較s,CGA-H+CCT組肝組織中p-PERK、p-PERK/PERK、p-eIF2α、p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。各組PERK、eIF2α蛋白無顯著變化(P>0.05)。見圖3、表4。

圖3 大鼠肝組織中ER應(yīng)激通路相關(guān)蛋白的表達(dá);A 對照組;B 模型組;C CGA低劑量組;D CGA高劑量組;E CGA-H+CCT組

表4 CGA對大鼠肝組織中ER應(yīng)激通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響 n=6,

2.6 CGA對安氟烷誘導(dǎo)的大鼠肝組織中BCL2、BAX蛋白的影響 與對照組比較,模型組大鼠肝組織中BCL2蛋白表達(dá)減少,BAX蛋白表達(dá)增加(P<0.05);與模型組比較,CGA低、高劑量組大鼠肝組織中BCL2蛋白表達(dá)增加,BAX蛋白表達(dá)減少(P<0.05);與CGA組比較,CGA-H+CCT組大鼠肝組織中BCL2蛋白表達(dá)減少,BAX蛋白表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4,表5。

對照組 模型組 CGA低劑量組 CGA高劑量組 CGA-H+CCT組

表5 CGA對安氟烷誘導(dǎo)的大鼠肝組織中BCL2、BAX蛋白表達(dá)的影響 n=6,光密度,

3 討論

肝臟是許多藥物代謝的重要場所,而藥物導(dǎo)致的肝毒性也是常見的死亡因素之一。因此,深入了解肝毒性的機制對預(yù)防藥物性肝損傷至關(guān)重要[11]。在常用的鹵代麻醉劑中,安氟烷被證明與氟烷一樣,能夠引起肝毒性,但發(fā)生率低于氟烷。安氟烷誘導(dǎo)的肝損傷特點與氟烷一致,即血清中肝酶的急性升高[2]。據(jù)了解,肝損傷機制的核心是氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),而目前大多數(shù)藥用植物及其化學(xué)物質(zhì)能夠產(chǎn)生抗炎、抗氧化的作用[12]。CGA便是其中一種多酚類物質(zhì),能夠通過間接抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6來發(fā)揮抗炎作用[13]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠血清中肝功能指標(biāo)AST、ALT、ALP以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高,且HE染色觀察到肝細(xì)胞數(shù)量減少,排列不規(guī)則,且出現(xiàn)腫脹和空泡等。揭示了安氟烷成功誘導(dǎo)大鼠肝毒性損傷。當(dāng)CGA給藥后,肝功能指標(biāo)AST、ALT、ALP以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低,肝細(xì)胞數(shù)量增多且排列有序,有輕微腫脹,空泡減少。表明了CGA能夠減輕安氟烷誘導(dǎo)的肝毒性損傷,但其作用機制還未深入研究。

ER應(yīng)激的主要反應(yīng)是葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)通過與其跨膜受體解離而激活PERK、肌醇需要蛋白1(IRE-1)和激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)三個通路上游因子[14]。在ER應(yīng)激發(fā)生后,PERK作為一種胞質(zhì)激酶,能夠通過反式自磷酸化,促使eIF2α的磷酸化,從而減少蛋白質(zhì)的翻譯[15]。CHOP可以調(diào)節(jié)多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá),包括BCL2蛋白家族的抗凋亡蛋白BCL2,以及促凋亡蛋白BAX[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠的肝細(xì)胞凋亡率升高,PERK和eIF2α的磷酸化水平、CHOP和BAX蛋白表達(dá)均升高,BCL2蛋白表達(dá)降低,推測ER應(yīng)激條件下的細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡是安氟烷誘導(dǎo)的肝毒性損傷的病理因素,PERK信號通路的激活能夠觸發(fā)促凋亡信號,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。本研究中,CGA組大鼠肝細(xì)胞凋亡率降低,PERK和eIF2α的磷酸化水平、CHOP和BAX蛋白表達(dá)均降低,BCL2蛋白表達(dá)升高。揭示了CGA能夠抑制安氟烷誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡,從而減輕肝毒性,其作用可能是通過抑制ER應(yīng)激通路中PERK的磷酸化以及促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)。進(jìn)一步加入PERK的激活劑CCT發(fā)現(xiàn),CCT消除了CGA對上述肝功能指標(biāo)、炎性因子以及凋亡相關(guān)因子的作用。

綜上所述,CGA可能通過抑制ER應(yīng)激PERK-CHOP通路來減輕安氟烷誘導(dǎo)的大鼠肝毒性。本研究為預(yù)防藥物肝毒性提供了新的研究思路和方法。但PERK通路還存在許多下游調(diào)節(jié)因子,因此,PERK-CHOP通路之間的具體作用機制以及相互作用還有待進(jìn)一步的深入探索。