垂體腺瘤環(huán)狀RNA Hsa_circ_0043459表達(dá)水平與術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性

胡長(zhǎng)偉 王希瑞 李亞斌 任寶文 韓曉勇 尹港峰

垂體腺瘤約占顱內(nèi)腫瘤的15%,是較常見的顱內(nèi)腫瘤之一,人口發(fā)病率為8.2%～14.7%[1]。雖然大多數(shù)的垂體腺瘤都是良性腫瘤,但其術(shù)后復(fù)發(fā)率卻高于其他顱內(nèi)良性腫瘤,有文獻(xiàn)報(bào)道,垂體腺瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)率可達(dá)4%～44%[1]。復(fù)發(fā)垂體腺瘤中以無功能性垂體腺瘤居多,但功能性垂體腺瘤的復(fù)發(fā)會(huì)帶來更多的臨床癥狀。無論是功能性還是無功能性垂體腺瘤的復(fù)發(fā)對(duì)于患者的預(yù)后生存期和生活質(zhì)量都有較大影響。目前普遍認(rèn)為垂體腺瘤的復(fù)發(fā)與腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)和術(shù)中切除程度等臨床特點(diǎn)有關(guān)。而目前對(duì)于垂體腺瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的具體機(jī)制及相關(guān)因素并不明確。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種共價(jià)連續(xù)的內(nèi)源性閉合環(huán)狀RNA,因其不含5,和3,端,不易被核酸外切酶降解,因此其結(jié)構(gòu)比線性RNA穩(wěn)定[2]。近期隨著RNA微陣列芯片和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)在真核生物細(xì)胞內(nèi)存在多達(dá)數(shù)千種以上的具有組織特異性的環(huán)狀RNA。特定的順式作用元件和反式作用因子影響著其生物發(fā)生的過程。研究發(fā)現(xiàn)在人類各種組織和體液中都有豐富的環(huán)狀RNA,而且部分環(huán)狀RNA可能與前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌和肝癌等的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[3]。環(huán)狀RNA的豐富表達(dá)譜和高穩(wěn)定性,使其有可能被開發(fā)為多種腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)的標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[4]。本研究探討hsa_circ_0043459在垂體腺瘤中的表達(dá)情況及其與垂體腺瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年6月至2019年6月我院手術(shù)切除的垂體腺瘤組織120例,其中男64例,女56例;年齡22～73歲,平均年齡(50.03±11.31)歲;功能性垂體腺瘤59例,侵襲性垂體腺瘤31例,腫瘤全切或次全切除78例。選擇同期顱腦損傷內(nèi)減壓術(shù)切除的正常腦組織20例作為對(duì)照,其中男11例,女9例;年齡33～71歲,平均年齡(51.30±11.27)歲。2組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性?；颊咝g(shù)后均經(jīng)病理檢查證實(shí)為垂體腺瘤,術(shù)后定期復(fù)查,隨訪依從性良好。復(fù)發(fā)診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次術(shù)后病理證實(shí)為垂體腺瘤;(2)首次術(shù)后再次出現(xiàn)腫瘤相關(guān)癥狀,影像學(xué)顯示腫瘤占位效應(yīng)明顯,術(shù)后病理證實(shí)為垂體腺瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前3個(gè)月內(nèi)有溴隱亭或其他生長(zhǎng)激素抑制劑或放射治療史;合并有其他惡性腫瘤或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病;合并心、肝、腎功能或其他嚴(yán)重系統(tǒng)功能不全患者。

1.2 手術(shù)方式 患者均采用神經(jīng)內(nèi)鏡下經(jīng)鼻蝶入路垂體腺瘤切除手術(shù)。手術(shù)方式：術(shù)前碘伏常規(guī)消毒雙側(cè)鼻腔周圍的面部區(qū)域,稀釋后的碘伏溶液消毒雙側(cè)鼻腔內(nèi)。德國(guó)齊柏林公司神經(jīng)內(nèi)鏡I020260系統(tǒng),鏡下用浸泡1∶5稀釋的腎上腺素的棉片收縮鼻甲及鼻腔黏膜約5 min。對(duì)于腫瘤較大的患者,采用部分切除中鼻甲的擴(kuò)大經(jīng)蝶入路。術(shù)中切除鼻中隔后半部分黏膜,采用單側(cè)鼻腔或雙側(cè)鼻腔通道。磨鉆磨除蝶竇前壁的骨質(zhì),清除蝶竇內(nèi)黏膜和骨性分隔,顯露鞍底。磨除鞍底骨質(zhì)后,切開鞍底硬腦膜,暴露腫瘤組織,標(biāo)本鉗留取部分腫瘤組織做病理用。對(duì)于質(zhì)地較軟的腫瘤組織常以刮圈和顯微吸引器配合切除,按由底到側(cè)再到頂?shù)捻樞蛑鸩角谐[瘤;對(duì)于質(zhì)地較韌的腫瘤,先由薩米刀或顯微剪刀分離,然后分塊切除。腫瘤切除完成后,瘤腔內(nèi)填塞明膠海綿壓迫止血。0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗術(shù)野無明顯活動(dòng)性出血后,人工硬腦膜進(jìn)行鞍底重建。術(shù)中發(fā)生明顯腦脊液漏患者,需取大腿外側(cè)脂肪、筋膜和肌肉,以“三明治”方法進(jìn)行鞍底多層修補(bǔ)。最后于鼻腔內(nèi)填塞膨脹海綿或碘仿紗條。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)hsa_circ_0043459的表達(dá) Trizol法提取組織標(biāo)本中的總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)260 nm及280 nm處的吸光度(OD)比值,測(cè)定RNA濃度。選用 OD 260/280 比值1.8～2.1間的標(biāo)本。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)垂體腺瘤組織和正常腦組織中的hsa_circ_0043459的表達(dá)水平,內(nèi)參為U6。引物序列為上游：5’-GCCCTGGTCACCTACAACAC-3’,下游：5’-TGGATATCAGGGACAGGCAGT-3’; U6引物上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’,下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以上實(shí)驗(yàn)操作均重復(fù)3次。

1.4 隨訪 患者術(shù)后均隨訪2年以上,隨訪截止時(shí)間為2021年6月。按患者術(shù)后次日計(jì)算至術(shù)后復(fù)發(fā)確診或截止時(shí)間,術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間以月為統(tǒng)計(jì)單位。

2 結(jié)果

2.1 正常腦組織和垂體腺瘤中hsa_circ_0043459的表達(dá)比較 垂體腺瘤組織中hsa_circ_0043459的表達(dá)水平高于正常腦組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 正常腦組織和垂體腺瘤中hsa_circ_0043459的表達(dá)比較

2.2 復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)垂體瘤組織中hsa_circ_0043459表達(dá)比較 120例垂體腺瘤患者中,術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn),術(shù)后復(fù)發(fā)23例,復(fù)發(fā)率為19.17%。按是否術(shù)后復(fù)發(fā)將120例患者分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組,復(fù)發(fā)組的垂體腺瘤中hsa_circ_0043459的表達(dá)高于未復(fù)發(fā)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)垂體瘤組織中hsa_circ_0043459的表達(dá)

2.3 垂體腺瘤中hsa_cric_0043459高表達(dá)組與低表達(dá)組復(fù)發(fā)情況比較 120例垂體腺瘤組織按hsa_circ_0043459的相對(duì)表達(dá)水平的平均值(3.26),分為高表達(dá)組(≥3.26)49例和低表達(dá)組(<3.26)71例。hsa_circ_0043459高表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)率為36.73%明顯高于低表達(dá)組的7.04%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 垂體腺瘤中hsa_cric_0043459高表達(dá)組與低表達(dá)組復(fù)發(fā)率比較 例(%)

2.4 不同hsa_circ_0043459表達(dá)水平對(duì)垂體腺瘤復(fù)發(fā)時(shí)間的影響 統(tǒng)計(jì)垂體腺瘤患者中hsa_circ_0043459高表達(dá)組和低表達(dá)組術(shù)后復(fù)發(fā)的時(shí)間。Kaplan-Meier生存曲線分析方法顯示,高表達(dá)組術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間(18.55±1.06)月明顯較低表達(dá)組(23.21±0.35)月縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線分析hsa_circ_0043459高表達(dá)和低表達(dá)組垂體腺瘤術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間

2.5 垂體腺瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素回歸分析 hsa_circ_0043459的表達(dá)高低與垂體腺瘤術(shù)后復(fù)發(fā)存在正相關(guān)的關(guān)系(P<0.05),且腫瘤侵襲和腫瘤切除程度與垂體腺瘤復(fù)發(fā)也存在著顯著相關(guān)性(P<0.05)。見表4。

表4 垂體腺瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)Logistic相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素回歸分析

3 討論

垂體腺瘤又稱垂體瘤,是一種較為常見的顱內(nèi)腫瘤,臨床癥狀主要表現(xiàn)在兩方面：(1)內(nèi)分泌功能障礙,主要表現(xiàn)為泌乳、閉經(jīng)、月經(jīng)紊亂、肢端肥大、向心性肥胖、多飲多尿等激素紊亂相關(guān)性癥狀;(2)占位引發(fā)的顱內(nèi)神經(jīng)功能障礙,主要表現(xiàn)為視力下降、視野缺損、頭痛、精神癥狀、嗅覺下降等神經(jīng)功能障礙。垂體腺瘤的診斷主要根據(jù)臨床表現(xiàn)、內(nèi)分泌學(xué)檢查及影像學(xué)定位診斷。臨床治療手段主要包括藥物治療、放射治療及手術(shù)治療,其中手術(shù)治療是垂體腺瘤的重要治療手段。由于垂體腺瘤的解剖位置的特點(diǎn),大部分垂體腺瘤首選經(jīng)鼻蝶手術(shù)切除。目前因神經(jīng)內(nèi)鏡具有較好視野以及良好照明,由于其具有成角視野,術(shù)中視野盲區(qū)較小,可有效提升腫瘤切除率,還可降低因視野不佳導(dǎo)致術(shù)區(qū)周圍組織受損的概率; 其次神經(jīng)內(nèi)鏡手術(shù)僅需要較小操作空間,且術(shù)中無需將骨性鼻中隔切除,可降低對(duì)于鼻黏膜的創(chuàng)傷,術(shù)后恢復(fù)快,縮短住院時(shí)間。神經(jīng)內(nèi)鏡已逐漸取代傳統(tǒng)顯微鏡在經(jīng)蝶手術(shù)中的應(yīng)用[5,6]。目前神經(jīng)外科采取最多的是神經(jīng)內(nèi)鏡下經(jīng)鼻蝶入路垂體腺瘤切除術(shù)。神經(jīng)內(nèi)鏡下經(jīng)鼻蝶入路垂體腺瘤切除術(shù),因其具有治愈率高、創(chuàng)傷性小及并發(fā)癥少等明顯優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為垂體腺瘤患者的首選微創(chuàng)術(shù)式。

垂體腺瘤雖然絕大多數(shù)是良性腫瘤,但由于部分垂體腺瘤可能侵襲海綿竇和頸內(nèi)動(dòng)脈或進(jìn)入第三腦室以及與周圍重要解剖結(jié)構(gòu)關(guān)系密切等原因,因此術(shù)后復(fù)發(fā)率高于其他顱內(nèi)良性腫瘤。其較高的復(fù)發(fā)率仍是目前臨床上在對(duì)垂體腺瘤治療中的一大困擾。對(duì)于垂體腺瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的主要臨床相關(guān)因素,有報(bào)道認(rèn)為,對(duì)年齡在18～45歲,腫瘤大部分及部分切除,腫瘤最長(zhǎng)徑更長(zhǎng),具有侵襲性的無功能性垂體腺瘤病人,術(shù)后更容易復(fù)發(fā)[7,8]。侵襲性生長(zhǎng)可認(rèn)為是垂體腺瘤的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9,10]。但對(duì)于垂體腺瘤復(fù)發(fā)的具體機(jī)制目前尚不明確。有研究認(rèn)為Ki-67高表達(dá)的垂體腺瘤,術(shù)后更易復(fù)發(fā)[11,12]。另有研究報(bào)道,垂體瘤轉(zhuǎn)化基因、增殖細(xì)胞核抗原、長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸MEG3、長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸(lncRNA)POU3F3等基因表達(dá)產(chǎn)物很可能參與了垂體腺瘤的復(fù)發(fā)[13-15]。但多數(shù)分子標(biāo)記物在預(yù)測(cè)垂體腺瘤復(fù)發(fā)方面均沒有特異性或穩(wěn)定性。目前尚沒有一種分子產(chǎn)物可以均具有特異性和穩(wěn)定性的作為垂體腺瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的標(biāo)記物,用來提示垂體腺瘤的預(yù)后和復(fù)發(fā)。

環(huán)狀RNA是近年來逐漸被關(guān)注的一種新興分子。環(huán)狀RNA是一類內(nèi)生的、數(shù)量眾多的、穩(wěn)定存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的分子,具有一定的組織、時(shí)序和疾病特性[16]。環(huán)狀RNA與傳統(tǒng)的線性RNA不同,其分子結(jié)構(gòu)呈封閉環(huán)狀。因此,環(huán)狀RNA不會(huì)受RNA外切酶的影響,不易被降解。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA分子內(nèi)部含有多個(gè) miRNA的結(jié)合位點(diǎn),環(huán)狀RNA可以通過與疾病相關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用,可解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用,而發(fā)揮重要的調(diào)控作用。環(huán)狀RNA可以通過內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)抑制miRNA結(jié)合,調(diào)控母基因表達(dá),調(diào)控RNA 結(jié)合蛋白等的作用完成相關(guān)靶向分子的調(diào)控[17,18]。環(huán)狀RNA因其在體內(nèi)廣泛分布和不易被核酸酶降解的穩(wěn)定性,越來越多的研究注重于環(huán)狀RNA與各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及預(yù)后預(yù)測(cè)的關(guān)系,期望環(huán)狀RNA可以作為腫瘤生物學(xué)行為的分子預(yù)測(cè)靶點(diǎn)[19-21]。同樣,在垂體腺瘤中也有部分研究顯示,一些環(huán)狀RNA可能與垂體腺瘤的侵襲生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)相關(guān)[22]。

在生物信息學(xué)方面,有學(xué)者已經(jīng)開始了垂體腺瘤相關(guān)環(huán)狀RNA方面的研究。有研究報(bào)道利用RNA芯片技術(shù)對(duì)73例無功能性垂體腺瘤患者的環(huán)狀RNA表達(dá)譜進(jìn)行了初步檢測(cè);在7 481個(gè)環(huán)狀RNA中,采用cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型和隨機(jī)生存森林算法分析比對(duì)后,挑選了與垂體腺瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)密切相關(guān)的9個(gè)環(huán)狀RNA,然后用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分生存預(yù)測(cè)方法分析,結(jié)果表明將hsa-circ-0000066和hsa-circ-0069707兩種環(huán)狀RNA組合的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的ROC曲線下面積最大,預(yù)測(cè)能力也最高[23]。表明hsa-circ-0000066和hsa-circ-0069707的聯(lián)合作用,在無功能性垂體腺瘤組織中可能與腫瘤生長(zhǎng)機(jī)制相關(guān)。另一項(xiàng)研究通過將無功能性垂體腺瘤分為侵襲性和非侵襲性2組,并檢測(cè)其腫瘤組織中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜,在侵襲性無功能性垂體腺瘤中發(fā)現(xiàn)有152個(gè)環(huán)狀RNA呈顯著異常表達(dá),其中91種環(huán)狀RNA呈上調(diào)趨勢(shì),而61種環(huán)狀RNA呈下調(diào)趨勢(shì)。在61種下調(diào)趨勢(shì)的環(huán)狀RNA中,hsa-circRNA-102597表達(dá)水平的降低與腫瘤的直徑和腫瘤的Knosp分級(jí)密切相關(guān)(P<0.05);其認(rèn)為Ki-67指數(shù)和hsa-circRNA-102597低表達(dá)水平的組合可能是垂體腺瘤侵襲生長(zhǎng)和預(yù)后的有效預(yù)測(cè)標(biāo)志物;該研究還通過生物信息學(xué)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),CDKNlA、WNT4和EGFR等基因可能會(huì)是hsa-circRNA-102597 和miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的下游靶基因,參與調(diào)節(jié)垂體腺瘤的發(fā)生與發(fā)展[24]。研究認(rèn)為hsa_circ_0043459(circ-ERBB2)在同樣是腺體腫瘤的乳腺癌組織中高表達(dá),并且可能通過調(diào)控下游的miRNA與乳腺癌的進(jìn)展相關(guān)[25]。作為與垂體腺瘤的增殖密切相關(guān)的EGFR相關(guān)信號(hào)通路[26],也是hsa_circ_0043459的調(diào)控靶點(diǎn)之一。綜合以上,可以推測(cè)hsa_circ_0043459很有可能與垂體腺瘤的復(fù)發(fā)存在相關(guān)性。

本研究通過檢測(cè)垂體腺瘤組織與正常腦組織中的hsa_circ_0043459的表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示hsa_circ_0043459在垂體腺瘤組織中的表達(dá)水平較正常腦組織中的表達(dá)升高,表明hsa_circ_0043459可能與垂體腺瘤的生長(zhǎng)增殖相關(guān)。在復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)垂體腺瘤進(jìn)一步的比對(duì)分析中顯示,復(fù)發(fā)垂體腺瘤中hsa_circ_0043459的表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)組。這提示hsa_circ_0043459的高表達(dá)可能與垂體腺瘤的復(fù)發(fā)有關(guān)。為此,該研究進(jìn)一步將垂體腺瘤組織按照hsa_circ_0043459的平均表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,通過比較兩組的復(fù)發(fā)率,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0043459高表達(dá)的垂體腺瘤更容易復(fù)發(fā)。為明確hsa_circ_0043459是否影響垂體腺瘤復(fù)發(fā)時(shí)間,該研究采用Kaplan-Meier生存曲線方法分析認(rèn)為,hsa_circ_0043459高表達(dá)的垂體腺瘤患者平均復(fù)發(fā)時(shí)間更短。為了進(jìn)一步分析在多種因素相互作用下,hsa_circ_0043459表達(dá)與垂體腺瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系,該研究采用多因素logistic回歸分析檢驗(yàn)方法顯示hsa_circ_0043459的表達(dá)、腫瘤侵襲和腫瘤切除程度是垂體腺瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素。但對(duì)于在垂體腺瘤中hsa_circ_0043459如何通過調(diào)控相關(guān)靶點(diǎn)分子的具體機(jī)制,還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,hsa_circ_0043459的高表達(dá)是垂體腺瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。通過進(jìn)一步的研究,hsa_circ_0043459或許可以作為垂體腺瘤復(fù)發(fā)的一個(gè)重要預(yù)測(cè)或干預(yù)靶點(diǎn)。