馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)技術(shù)改良研究

許 杰，生兆平，夏印文

（1.山東省棗莊市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東棗莊 277800；2.山東省棗莊市山亭區(qū)北莊鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，山東棗莊 277218；3.山東省棗莊高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)興仁街道辦事處，山東棗莊 277800）

馬鈴薯種植范圍廣，魯南地區(qū)是典型的馬鈴薯二季作區(qū)。棗莊市目前已發(fā)展成為全國最大、單產(chǎn)最高的二季作馬鈴薯代表性產(chǎn)區(qū)，截止到2021 年底，全市馬鈴薯栽培面積已發(fā)展到5 萬hm2，總產(chǎn)值超過160 億元[1]。

馬鈴薯連作障害導(dǎo)致病害發(fā)生嚴(yán)重，馬鈴薯本身容易產(chǎn)生各類病害問題，做好病害防治工作，確保產(chǎn)業(yè)推進是后續(xù)工作的重點和難點[2]。目前，解決馬鈴薯病害的主要方法是普及馬鈴薯脫毒種薯全覆蓋，防止種薯帶菌，隨著馬鈴薯脫毒技術(shù)的引進和脫毒種薯的大量使用，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，從而帶動了馬鈴薯脫毒種薯技術(shù)的快速發(fā)展[3]。利用馬鈴薯脫毒試管薯播種在基質(zhì)中繁育馬鈴薯脫毒原原種的方法優(yōu)勢明顯，馬鈴薯苗成活率高，植株生長旺盛，而且，脫毒試管薯擁有種性好、體積小、質(zhì)量輕、品質(zhì)優(yōu)、休眠期長、繁殖快的優(yōu)點，同時，又為馬鈴薯種質(zhì)資源的保存、交換、運輸提供便利[4]。有關(guān)馬鈴薯脫毒試管薯誘導(dǎo)的研究報道中，張艷萍等[5]認(rèn)為適合馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS 液體培養(yǎng)基或固液雙層培養(yǎng)基。張?zhí)煊畹萚6]指出在8%蔗糖濃度下，液態(tài)+濾紙培養(yǎng)基與固態(tài)培養(yǎng)基對結(jié)薯率、薯塊直徑的影響差異不大。歐建龍等[7]報道適合試管薯誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中蔗糖濃度為8%。楊莎等[8]試驗表明含8%蔗糖的培養(yǎng)基試管薯誘導(dǎo)率遠遠高于含3%蔗糖的。本實驗在前人研究成果的基礎(chǔ)上以‘魯引一號’為材料，改良了組培苗壯苗培養(yǎng)基配方和組培苗誘導(dǎo)試管薯的暗培養(yǎng)技術(shù)，以期找到提高試管薯產(chǎn)量和質(zhì)量的最佳培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 供試材料

馬鈴薯品種為‘魯引一號’脫毒種薯，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

活性炭，上海樂康活性炭有限公司。

蔗糖，食品級，蘇州市邦卓精細(xì)化工有限公司。

椰子汁，海南椰樹牌椰汁。

1.2 試驗方法

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，添加各種成分激素、蔗糖、活性炭、椰子汁等，加6 g/L 瓊脂粉，分裝組培瓶中，每瓶50 mL，高壓滅菌鍋中120 ℃濕熱滅菌20 min，備用。

暗培養(yǎng)方式：組培苗經(jīng)過壯苗培養(yǎng)，將組培瓶放入紙箱中，用覆蓋透光率80%遮陽網(wǎng)進行暗培養(yǎng)。

1.2.1 馬鈴薯莖尖的剝離

用3 mg/L 赤霉素浸種8 min，將浸種后的馬鈴薯種薯沙培催芽，待芽長3 cm 左右，取出，沖洗干凈備用。取芽尖1 cm 左右，自來水沖洗30 min，紗布擦干水，于超凈工作臺上，培養(yǎng)皿中75%酒精滅菌30s，0.1%升汞滅菌5min，無菌水沖洗5 次，無菌濾紙濾干水，解剖鏡下進行莖尖剝離，取莖尖分生組織0.3 mm，放于滅菌過的培養(yǎng)基中進行馬鈴薯組培苗誘導(dǎo)[9]。

1.2.2 馬鈴薯脫毒苗的誘導(dǎo)

為兼顧馬鈴薯分生組織誘導(dǎo)組培苗的效果和成本，選擇MS＋6-BA 2.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L 為馬鈴薯分生組織誘導(dǎo)組培苗的培養(yǎng)基配方。將莖尖分生組織放于滅過菌的培養(yǎng)基中于無菌培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，溫度25 ℃，光照12h，光照強度2000 lx。誘導(dǎo)出馬鈴薯組培苗，待苗高5 cm以上時，可以進行馬鈴薯組培苗的病毒檢測，經(jīng)過病毒檢測獲得馬鈴薯脫毒苗[10]。

1.2.3 馬鈴薯脫毒苗的病毒檢測

對組培苗進行病毒檢測是培育脫毒苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，常用試劑條檢測法。具體步驟為將要檢測病毒的組培苗碾磨成汁液，將試劑條放入汁液中，檢測是否有病毒，將帶病毒的組培苗去除，經(jīng)過篩選，獲得脫毒組培苗備用[11]。

1.2.4 脫毒苗的快速繁育技術(shù)

無病毒的馬鈴薯組培苗可以用于大量繁育馬鈴薯脫毒苗。在無菌條件下，將待繁的脫毒苗一葉一節(jié)切段，扦插于1/2 MS 培養(yǎng)基中，3 d 以后，50%的切段萌根，5 d 以后全部生根，3～5 d 腋芽萌發(fā)，30 d 左右長成5～7 片葉的組培苗，可再進行循環(huán)繁殖[12]。

1.2.5 馬鈴薯脫毒組培苗壯苗培養(yǎng)

暗培養(yǎng)的植株，在遮光的條件下生長，不能進行光合作用，全靠試管苗本身儲存的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化成小塊莖。因此，壯苗培養(yǎng)是試管薯誘導(dǎo)的必要前提。將脫毒苗切去頂部和基部，把長到3～4 節(jié)的莖段放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶放入10 個莖段。常規(guī)液體壯苗培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+活性炭5 g/L，改良壯苗培養(yǎng)基為MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入各蔗糖、椰子汁、活性炭配比，具體見表1。在組培瓶中作淺層液體靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)室的溫度為25 ℃，每日光照16 h，光照強度在2 000 lx 以上，莖段培養(yǎng)5 d 即有腋芽萌出，30 d 瓶內(nèi)長滿小苗，即可轉(zhuǎn)入暗培養(yǎng)誘導(dǎo)試管薯[13]。

表1 不同濃度原料對馬鈴薯組培苗壯苗培養(yǎng)的影響Table 1 Effects of different concentrations of raw materials on the strong seedling culture of potato tissue culture seedlings

1.2.6 壯苗暗培養(yǎng)誘導(dǎo)試管薯

將不同培養(yǎng)基培養(yǎng)出的馬鈴薯脫毒壯苗，進行暗培養(yǎng)，常規(guī)方法是一直暗培養(yǎng)60 d，然后收獲馬鈴薯試管薯。改良后暗培養(yǎng)方法是將馬鈴薯脫毒壯苗暗培養(yǎng)10 d，散射光培養(yǎng)10 d，然后繼續(xù)暗培養(yǎng)，直到60 d 收獲[14]。

1.3 主要觀察記載項目

不同壯苗培養(yǎng)基，培養(yǎng)馬鈴薯30 d 后，利用游標(biāo)卡尺測量馬鈴薯組培苗的莖粗，以毫米為計量單位；利用拍照式葉面積儀測量葉面積，以平方毫米為單位，取平均值比較。

暗培養(yǎng)30 d 后，記錄每瓶誘導(dǎo)出的試管薯數(shù)量，以個為計量單位；暗培養(yǎng)60 d 后收獲，記錄試管薯單薯平均質(zhì)量，以毫克為計量單位。單薯質(zhì)量增減變化計算公式見式（1）。

1.4 儀器

YMJ-P1 拍照式葉面積儀，山東恒美電子科技有限公司；標(biāo)康SL01-1 高精度電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺。

1.5 統(tǒng)計方法

用Excel 2010 版本進行數(shù)據(jù)分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯脫毒組培苗壯苗培養(yǎng)結(jié)果

由表1 可知，增加活性炭、蔗糖、椰子汁的量，可以較明顯增加馬鈴薯組培苗的莖粗及葉面積，培養(yǎng)基配方MS+活性炭15 g/L+蔗糖100 g/L+椰子汁100 mL/L 培養(yǎng)的馬鈴薯組培苗平均莖粗最粗、平均葉面積最大，莖粗達到2.1 mm，平均葉面積達到46 mm2，較常規(guī)培養(yǎng)基配方MS+蔗糖30 g/L+活性炭5 g/L 培養(yǎng)的馬鈴薯組培苗莖粗增加75%，葉面積增加84%。其它培養(yǎng)基配方培養(yǎng)的馬鈴薯組培苗較常規(guī)培養(yǎng)基配方培養(yǎng)的組培苗在組培苗莖粗和葉面積上均有明顯增加，培養(yǎng)基配方MS+活性炭10 g/L+蔗糖50 g/L+椰子汁100 mL/L 培養(yǎng)的馬鈴薯組培苗，莖粗為1.7 mm，葉面積為40 mm2，較常規(guī)培養(yǎng)基配方培養(yǎng)的馬鈴薯組培苗莖粗增加了42%，葉面積增加了60%。

綜合成本及實際應(yīng)用效果，最終選擇MS+活性炭10 g/L+蔗糖50 g/L+椰子汁100 mL/L 培養(yǎng)基配方進行壯苗培養(yǎng)。

2.2 馬鈴薯脫毒組培苗壯苗暗培養(yǎng)誘導(dǎo)試管薯結(jié)果

由表2 可知，改良暗培養(yǎng)方式及改良配方，可明顯增加馬鈴薯試管薯平均單株結(jié)薯個數(shù)和平均單薯質(zhì)量，平均單薯質(zhì)量與常規(guī)方式差異極顯著，改良暗培養(yǎng)方式比常規(guī)培養(yǎng)方式誘導(dǎo)的試管薯平均單株結(jié)薯個數(shù)增加35.8%，改良培養(yǎng)基配方較常規(guī)培養(yǎng)基配方誘導(dǎo)的試管薯平均單株結(jié)薯個數(shù)增加27.3%；改良暗培養(yǎng)方式比常規(guī)培養(yǎng)方式誘導(dǎo)的試管薯平均單薯質(zhì)量增加9.3%，改良培養(yǎng)基配方較常規(guī)培養(yǎng)基配方誘導(dǎo)的試管薯平均單薯質(zhì)量增加10.9%。因此，暗培養(yǎng)方式改良后大幅度增加了馬鈴薯試管薯單株結(jié)薯個數(shù)，而培養(yǎng)基配方的改良可以有效增加馬鈴薯試管薯單薯質(zhì)量。

表2 不同的暗培養(yǎng)方式對馬鈴薯試管薯的影響Table 2 Effects of different dark culture methods on potatoes in vitro

3 小結(jié)

試驗將常規(guī)培養(yǎng)基配方MS+蔗糖30g/L+活性炭5g/L改良為MS+活性炭10 g/L+蔗糖50 g/L+椰子汁100 mL/L，將常規(guī)的一直暗培養(yǎng)方式改良為暗培養(yǎng)10 d，散射光培養(yǎng)10 d，然后再暗培養(yǎng)。試驗結(jié)果表明，改良后馬鈴薯試管薯平均單株結(jié)薯4.2 個，比常規(guī)培養(yǎng)增加35.8%，改良后馬鈴薯試管薯平均單薯質(zhì)量319 mg，比常規(guī)培養(yǎng)增加10.9%。

馬鈴薯種薯繁育時，由于地塊、環(huán)境、蚜蟲的影響，致使脫毒種薯退化嚴(yán)重，由于脫毒品種檢測手段、檢測標(biāo)準(zhǔn)普及率低，致使部分馬鈴薯種子質(zhì)量較差，給農(nóng)民帶來巨大的經(jīng)濟損失。因而，選用高質(zhì)量的脫毒種薯用于大田生產(chǎn)以及保持脫毒微型薯種性不退化是提高馬鈴薯產(chǎn)量水平的最簡捷、快速的有效途徑。而試管薯體積小，無病原，儲藏、運輸方便，并克服了試管苗移栽成活率差，以及剪尖扦插易污染等一系列的問題，對于加速脫毒種薯在生產(chǎn)上的應(yīng)用非常有利，但是，利用組培苗進行試管薯誘導(dǎo)難度較大，產(chǎn)量也不高，試管薯個頭小，播種后成活率有一定的影響[15]。

下一步，本課題組將會繼續(xù)改進馬鈴薯試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法，并試驗利用500 mL 組培瓶進行馬鈴薯小微型薯組培瓶內(nèi)生產(chǎn)，即在500 mL 組培瓶內(nèi)放入栽培基質(zhì)，如蛭石等，然后將馬鈴薯組培苗切段栽插在組培瓶內(nèi)，在基質(zhì)中生產(chǎn)小微型薯，用以提供成活率和質(zhì)量。