IL-33和炎癥細(xì)胞因子在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性

段芷穎，陳火英，雷可，陳小紅，史悅嬌，夏承明，孫燕

1.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 桂林 541004；3.武漢市第三醫(yī)院，湖北 武漢 430000

結(jié)腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第三位，其死亡率僅次于肺癌[1-3]。結(jié)腸癌主要分為腺癌、黏液腺癌和未分化癌，大體形態(tài)呈息肉狀、潰瘍型。結(jié)腸腺癌(colon adenocarcinoma，COAD)是結(jié)腸腺上皮來源的常見消化道惡性腫瘤，是結(jié)腸癌多種病理類型中最常見的一種[4]。慢性炎癥性腸炎患者、結(jié)腸息肉患者和肥胖者是COAD 易感人群，因生活方式如高脂飲食改變?nèi)祟惸c道的菌群結(jié)構(gòu)，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。因此，開發(fā)早期檢測(cè)和新的治療方法，對(duì)于有效的疾病管理和提高COAD患者生存質(zhì)量、生存率是非常必要的[5]。

白細(xì)胞介素33(interleukin 33，IL-33)是IL-1細(xì)胞因子家族的新成員，作為雙功能因子，不僅具有核轉(zhuǎn)錄因子活性，而且具有細(xì)胞因子活性，通常駐留在它所表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞核中[6]。當(dāng)它作為細(xì)胞因子時(shí)，發(fā)揮炎癥細(xì)胞因子的作用并參與免疫應(yīng)答過程，在炎癥性疾病中促進(jìn)Th2免疫反應(yīng)。已有研究報(bào)道，IL-33在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)炎癥和抑制炎癥的雙重作用[7-8]。胃癌、肝癌和非小細(xì)胞肺癌患者血清中IL-33的水平升高、腫瘤組織病灶區(qū)IL-33的表達(dá)異常，參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，與疾病預(yù)后不良相關(guān)[9-11]。因此，選擇性抑制IL-33 過度表達(dá)而保留正常的細(xì)胞核表達(dá)IL-33成為靶向腫瘤治療研究的新目標(biāo)。雖然IL-33在腫瘤免疫中的作用已被廣泛研究，但I(xiàn)L-33在COAD發(fā)生、發(fā)展中的作用有待進(jìn)一步探究。

本文以COAD為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Protein Atlas，HPA)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，分析COAD結(jié)腸組織IL-33和炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，以及分析IL-33 與炎癥細(xì)胞因子的相關(guān)性。預(yù)測(cè)IL-33 在COAD 中的作用，從而以IL-33 為靶點(diǎn)防治COAD的機(jī)制研究與臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 利用TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://timer.cistrome.org)對(duì)COAD炎癥細(xì)胞因子進(jìn)行初步篩選，利用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org)檢索并分析15 名健康人和47 例COAD 患者結(jié)腸組織IL-33和炎癥細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平以及相關(guān)性。

1.2 方法

1.2.1 篩選炎癥細(xì)胞因子 TIMER (Tumor Immune Estimation Resource)數(shù)據(jù)庫(kù)是類似于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的一個(gè)腫瘤免疫在線研究工具，主要研究免疫浸潤(rùn)與遺傳或臨床特征之間的關(guān)聯(lián)。進(jìn)入TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇檢索選項(xiàng)“Exploration”，畫面顯示4 個(gè)目標(biāo)檢索方式，選擇“Gene DE”檢索腫瘤患者與健康人之間的差異基因表達(dá)，輸入關(guān)鍵詞，例如“IL-33”，系統(tǒng)將自動(dòng)彈出該數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的差異基因類型，選擇目標(biāo)搜索基因，點(diǎn)擊“Submit”即加載出IL-33 在各類腫瘤患者和正常人體內(nèi)的表達(dá)，使用箱線圖顯示基因表達(dá)水平的分布。

1.2.2 檢索癌變結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)免疫組化圖譜 蛋白質(zhì)在組織、細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的準(zhǔn)確定位與蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)，為了全面系統(tǒng)性解析蛋白質(zhì)在疾病中的作用，有必要對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行空間分辨率的研究。HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)致力于提供人體內(nèi)24 000 種蛋白質(zhì)的相關(guān)信息，包括人體組織、血液、細(xì)胞和大腦中的分布信息，以及病理狀態(tài)下免疫組織化學(xué)染色圖等信息，產(chǎn)生了超過1 000 萬張顯示單細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)表達(dá)模式的圖像，并共享于www.proteinatlas.org。HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)核心是收集獨(dú)特的抗體，通過免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)繪制整個(gè)人類蛋白質(zhì)組圖譜，目前呈現(xiàn)每種蛋白質(zhì)在48 種人體正常組織、20 種腫瘤組織、47 個(gè)細(xì)胞系和12 種血液細(xì)胞內(nèi)的分布和表達(dá)。目前HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)分為六個(gè)主要部分：(1)顯示蛋白質(zhì)在人體所有主要組織和器官中分布的組織圖譜；(2)顯示蛋白質(zhì)在單個(gè)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位的細(xì)胞圖譜；(3)顯示蛋白質(zhì)水平對(duì)癌癥患者生存影響的病理學(xué)圖譜；(4)顯示血細(xì)胞和主動(dòng)分泌蛋白質(zhì)表達(dá)譜的血液圖譜；(5)顯示蛋白質(zhì)在人、小鼠和豬腦部的分布圖譜；(6)顯示蛋白質(zhì)參與人體代謝的代謝圖譜。使用HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)共納入62 例結(jié)腸組織免疫組化染色病理圖(表1)。首先，進(jìn)入HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)，在“SEARCH”檢索框中輸入關(guān)鍵詞“IL-33”，將顯示IL-33 在Tissue(人體組織)、Pathology(病理組織)和Cell(細(xì)胞)中的表達(dá)圖譜，而在Cell type(細(xì)胞系)、Brain(大腦)和Blood(血液)中則未收錄明確數(shù)據(jù)。然后，點(diǎn)擊“Tissue”，選擇畫面左側(cè)“TISSUES”并選擇“COLON”，即進(jìn)一步檢索IL-33 在人體結(jié)腸組織中的表達(dá)。例如在“COLON-Antibody staining”中 包 括“HPA024426”和“CAB007057”兩種抗體對(duì)正常結(jié)腸組織進(jìn)行免疫組化染色圖，并說明IL-33 在結(jié)腸內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcells)、腺細(xì)胞(glandular cells)、外周神經(jīng)/神經(jīng)節(jié)(peripheral nerve/ganglion)中的表達(dá)程度。最后，任意點(diǎn)擊一張免疫組化染色病理圖即獲取圖源信息，記錄樣本ID編號(hào)和免疫組化染色抗體名稱。

表1 樣本數(shù)據(jù)信息Table 1 Information on sample data

1.3 觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)方法 采用雙盲法對(duì)結(jié)腸組織免疫組化染色病理圖進(jìn)行量化分析，在雙盲試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者和參與者只有在所有數(shù)據(jù)被記錄完畢后才能對(duì)樣本的所屬組別知情。將提取出的62 個(gè)免疫組化圖隨機(jī)排列，隱藏所有圖源信息，交由實(shí)驗(yàn)者和參與者進(jìn)行識(shí)別和記錄。在控制抗體類型一致的情況下，判斷陰性細(xì)胞和陽性細(xì)胞，其陽性細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)深棕著色，記錄其陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，取兩組數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 GraphPad Prism 8.0 軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示，兩組資料間比較采用Two-tailed Student's-t 檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)COAD 炎癥細(xì)胞因子 通過TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)COAD炎癥細(xì)胞因子進(jìn)行初步篩選，結(jié)果提示IL-33、TNF、IL-4、IL-6 和TGF-β1等細(xì)胞因子可能通過多靶點(diǎn)協(xié)同作用于COAD，見圖1。

圖1 TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)篩選炎癥細(xì)胞因子Figure 1 TIMER 2.0 database screens for inflammatory cytokines

2.2 COAD結(jié)腸組織IL-33、TNF、IL-4和IL-6陽性細(xì)胞表達(dá)分布 通過免疫組織化學(xué)染色和蘇本素復(fù)染法，分別對(duì)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)來源的健康人和COAD結(jié)腸組織切片炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行觀察，染色病理圖呈現(xiàn)棕黃色顆粒即陽性細(xì)胞。結(jié)果顯示：在結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子IL-33、TNF、IL-4、IL-6 和TGF-β1均有表達(dá)，主要表達(dá)于黏膜上皮細(xì)胞(圖2A1~J1；圖2A2~J2是圖2A1~J1局部放大圖片)。如圖2A1~D1所示，杯狀細(xì)胞呈上大小下之形狀，形似高腳杯，呈空泡狀，Normal 組杯狀細(xì)胞幾乎不表達(dá)IL-33 和TNF，而COAD 組黏膜上皮細(xì)胞顯著性的表達(dá)IL-33 和TNF。如圖2E1~F1 所示，IL-4 陽性細(xì)胞主要分布于黏膜上皮細(xì)胞，與Normal 組相比較，COAD 組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)IL-4陽性細(xì)胞數(shù)量較少，未見結(jié)腸“隱窩”結(jié)構(gòu)和杯狀細(xì)胞，且邊緣較為模糊。如圖2 G1~H1 所示，結(jié)腸黏膜上有很多“隱窩”結(jié)構(gòu)，形似“小花”淺色花瓣是分泌堿性黏液的杯狀細(xì)胞，Normal組結(jié)腸IL-6陽性細(xì)胞幾乎表達(dá)在“小花”周圍的黏膜上皮細(xì)胞中(圖2G1)，與Normal 組相比較，COAD 組IL-6 陽性細(xì)胞的表達(dá)減少(圖2H1)。此外，如圖2 I1~J1 所示，TGF-β1陽性細(xì)胞主要表達(dá)在結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞，且TGF-β1陽性細(xì)胞表達(dá)量較少。

圖2 COAD結(jié)腸組織IL-33、TNF、IL-4、IL-6和TGF-β1的表達(dá)分布圖Figure 2 Distribution of IL-33,TNF,IL-4,IL-6,and TGF-β1 expression in colon tissues of COAD

2.3 COAD 結(jié)腸組織IL-33、IL-4 和TNF 的表達(dá)及其相關(guān)性 IL-33 作為一種炎癥細(xì)胞因子，其在消化道炎癥中表達(dá)升高，參與調(diào)節(jié)腸道免疫、腸道菌群、腸上皮細(xì)胞損傷等。通過HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)中提取出相應(yīng)條件下的所有樣本，導(dǎo)出HPA024426抗體檢測(cè)COAD結(jié)腸組織中IL-33陽性細(xì)胞表達(dá)情況，并對(duì)IL-33陽性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，IL-33 在COAD 中的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3A)。TNF 是主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。如圖3B所示，COAD結(jié)腸組織TNF 的表達(dá)升高，結(jié)腸組織IL-4 和IL-6 的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3C 和圖3D)，此結(jié)果與TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)COAD 血清IL-4 和IL-6的水平升高相反。TGF-β1是一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，在炎癥、組織修復(fù)、胚胎發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用，如圖3E所示，與對(duì)照組相比，COAD結(jié)腸組織TGF-β1的表達(dá)整體趨勢(shì)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，推測(cè)這可能是因在不同狀態(tài)人體結(jié)腸組織中TGF-β1的表達(dá)差異性不明顯，有待進(jìn)一步數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘和實(shí)驗(yàn)研究。此外，對(duì)COAD 結(jié)腸組織中IL-33與炎癥細(xì)胞因子TNF、IL-4、IL-6 和TGF-β1進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-33 與TNF 的表達(dá)呈正相關(guān)性(圖3F)，而IL-33 與IL-4、IL-6 和TGF-β1的表達(dá)無相關(guān)性(圖3G~圖3I)，表明IL-33參與調(diào)控COAD炎癥反應(yīng)病變區(qū)分泌促炎癥細(xì)胞因子TNF。

圖3 COAD結(jié)腸組織中IL-33和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)及相關(guān)性分析Figure 3 Expression and correlation of IL-33 and inflammatory cytokines in COAD colon tissues

3 討論

炎癥在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，近20年的流行病學(xué)、遺傳學(xué)和藥理學(xué)方法的研究數(shù)據(jù)表明，炎癥促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。在腫瘤的臨床治療中，使用抗炎藥可以改善腫瘤患者的預(yù)后狀態(tài)，減少手術(shù)后傷口炎癥和感染，促進(jìn)傷口愈合和降低癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。炎癥反應(yīng)在COAD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子指標(biāo)與COAD患者的生存預(yù)后密切相關(guān)，但炎癥影響COAD患者病程的內(nèi)在因素分子機(jī)制仍未闡明。腸道細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)不僅是炎癥和組織平衡的關(guān)鍵媒介，而且影響COAD各階段的致癌性，而炎癥細(xì)胞因子失衡是炎癥性腸病發(fā)病的主要原因。

在尋找可能與腫瘤炎癥發(fā)病機(jī)制有關(guān)的生物標(biāo)志物時(shí)，新的證據(jù)指向IL-1家族新成員IL-33，它既是一種雙重功能的細(xì)胞因子，又是一種具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄功能的細(xì)胞核因子，組成性表達(dá)在胃腸道、皮膚和肺等屏障組織細(xì)胞中，IL-33在炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后方面發(fā)揮著重要作用[12-13]。IL-33是多種炎癥性疾病的潛在介質(zhì)，近年來成為研究腫瘤炎癥機(jī)制和治療靶點(diǎn)的新熱點(diǎn)。炎癥是IL-33釋放的主要因素之一，在不同類型的腫瘤中IL-33的表達(dá)水平對(duì)腫瘤病程的影響呈現(xiàn)明顯的差異性，多數(shù)腫瘤患者IL-33的表達(dá)水平顯著升高，并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)性[14]，IL-33可進(jìn)一步誘發(fā)腫瘤的發(fā)展浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。相關(guān)的研究表明，結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中IL-33的表達(dá)水平顯著高于正常組織，結(jié)腸癌患者外周血中IL-33的水平明顯升高，且與結(jié)腸癌病情程度顯著相關(guān)[15]。炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-4和IL-6等在結(jié)腸癌病程中發(fā)揮作用，表明IL-33和炎癥細(xì)胞因子對(duì)結(jié)腸癌患者的預(yù)后具有密切聯(lián)系。此外，IL-33 還可以抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[16]。

腫瘤微環(huán)境與機(jī)體免疫系統(tǒng)Th1/Th2極化有關(guān)，腫瘤細(xì)胞的分化可抑制Th1型細(xì)胞因子的分泌、促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子的生成，導(dǎo)致Th1/Th2 失衡和免疫逃逸。Th1 型細(xì)胞因子主要有TNF-α、IFN-γ、IL-2 和IL-12等，Th2 型細(xì)胞因子主要有IL-4、IL-5、IL-6 和IL-10等。蛋白質(zhì)的正確空間分布對(duì)其功能至關(guān)重要，而異位表達(dá)、過量表達(dá)、點(diǎn)突變和片段缺失往往會(huì)導(dǎo)致人類疾病的發(fā)生。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)成為研究人員研究人類組織和細(xì)胞中蛋白質(zhì)定位和表達(dá)的寶貴工具。為了進(jìn)一步探究IL-33和炎癥細(xì)胞因子引發(fā)COAD的免疫學(xué)機(jī)制，本研究利用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)和HPA數(shù)據(jù)庫(kù)，聚焦于COAD 中結(jié)腸部位的IL-33 和炎癥細(xì)胞因子(TNF、IL-4、IL-6和TGF-β1)的表達(dá)和相關(guān)性分析。通過數(shù)據(jù)篩選和比對(duì)，對(duì)COAD結(jié)腸組織免疫組化病理圖進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)，分析得出COAD 結(jié)腸組織IL-33 和TNF的表達(dá)升高，IL-4和IL-6的表達(dá)降低，同時(shí)COAD結(jié)腸組織IL-33與TNF的表達(dá)呈正相關(guān)性。

IL-33和炎癥細(xì)胞因子在COAD結(jié)腸組織中表達(dá)的差異性可為進(jìn)一步研究結(jié)腸炎癥和結(jié)腸癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。炎癥反應(yīng)會(huì)增加罹患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，是否在食用者能承受住應(yīng)激的情況下，通過調(diào)節(jié)膳食中IL-33等炎癥細(xì)胞因子的水平降低結(jié)腸癌的發(fā)病率，還有待后期進(jìn)一步探究。