• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    恩度抑制大鼠肝纖維化與肝癌的機制研究

    2023-07-01 07:36:52楊國威杜瑩瑩程序譚莉霞王航宇董勇仝甲釗武利萍
    海南醫(yī)學 2023年12期
    關鍵詞:恩度纖維化肝癌

    楊國威,杜瑩瑩,程序,譚莉霞,王航宇,董勇,仝甲釗,武利萍

    河南大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,河南 開封 475001

    肝癌為導致全球患者死亡第二大癌癥,我國肝癌發(fā)病率、中標率及世標率分別為24.09/10 萬、12.73/10 萬、13.89/10 萬,由其所致疾病與經(jīng)濟負擔逐漸成為重要公共衛(wèi)生問題[1]。研究顯示超過80%肝癌患者病情進展經(jīng)歷了慢性肝炎、肝纖維化、肝癌這一逐步進展過程[2]。研究者們近期嘗試從分子層面解釋肝纖維化-肝癌發(fā)生具體機制,以便通過靶向特定分子延緩甚至阻斷肝臟疾病進展[3]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)為促進肝纖維化獨有因子,其涉及TGF-β/Smad 信號通路介導了肝纖維化-肝癌過程[4]。恩度可以經(jīng)由抑制TGF-β表達而減輕TGF-β誘導纖維化作用,進而發(fā)揮明顯抗纖維化作用[5]。基于此,本研究探究恩度對大鼠“肝纖維化-肝癌”抑制作用及具體作用機制,為后期肝癌抗腫瘤治療提供新靶點。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠90 只,體質(zhì)量180~200 g,在醫(yī)院動物房以標準飼料分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度20℃~25℃,可以自由進食飲水,光照與黑暗時間均為12 h。

    1.2 儀器與試劑 JA1003 型號天平購自上海精科儀器有限公司,光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司,Multiskan MK3 型號酶標儀購自Thermo Labsystems 公司,LEICARM2035 型號生物組織石蠟切片機購自湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司,BM-Ⅱ型號包埋機購自安徽電子科學研究院,IQTM5 型號實時熒光逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(RT-PCR)購自美國Bio-Rad 公司,DYY-8B 型電泳儀購自北京六一儀器廠,Tanon 型號凝膠成像分析儀購自上海天能科技有限公司;DEN 購自美國Sigma 公司,恩度購自山東先聲麥得津生物制藥有限公司,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)素購自BASO 生物科技有限公司,谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、白 蛋 白(albumin,ALB)、總膽紅素(total bilirubin,TBI)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購自四川邁克生物科技股份有限公司,羥脯氨酸及堿性磷酸酶試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,Trizol 試劑盒、High-capacity cDNA reverse transcription kits均購自美國Gene Copoeia公司,蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid assay,BCA)試劑盒均購自金克隆(北京)生物技術有限公司,兔TGF-β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅰ(transforming growth factor-β recipient Ⅰ,TβRⅠ)、轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅱ(TβRⅡ)、Smad2/3 均購自美國Cell Signaling Technology 公司,小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司,辣根過氧化酶標記山羊抗兔、抗小鼠抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司,發(fā)光液購自北京伊塔生物科技有限公司。

    1.3 大鼠模型構建及分組 90 只小鼠在動物房適應性飼養(yǎng)1周,將所有小鼠隨機分為正常組、模型組、恩度組,每組30只。模型組以10 mg/kg濃度腹腔注射0.2%DEN,每周5次,連續(xù)注射16周,對照組以9 g/L濃度注射等量注射生理鹽水,于8 周、12 周、16周分別處死5只進行病理檢測,以明確預期病理分型。確定病理分型后恩度組于尾靜脈以20 mg/(kg·d)劑量注射恩度,此時對照組與模型組注射等量9 g/L濃度生理鹽水,繼續(xù)注射,飼養(yǎng)至20周處死小鼠。小鼠處死前收集心臟血測定肝功能指標及纖維化指標,處死后獲得肝臟組織行病理檢測與相關信號通路mRNA及蛋白測定。

    1.4 肝組織大體形態(tài)觀察 觀察8 周、12 周、16周及20周處死大鼠完整肝臟組織,統(tǒng)計肝表面結節(jié)數(shù)量,將大鼠肝組織腫瘤剝離,稱重肝組織腫瘤,統(tǒng)計瘤重、肝臟指數(shù)、抑瘤率,肝臟指數(shù)=肝臟組織重量/總重量×100%,抑瘤率=(模型組瘤重-恩度組瘤重)/模型組瘤重×100%。

    1.5 肝組織病理檢測 恩度注射4 周后將大鼠處死后收集肝組織應用4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、HE染色、脫水、封片等處理,隨后置于光學顯微鏡下觀察拍片,并行肝纖維化分級[6]評估,0 級為組織中無纖維化,1 級為肝小葉中有纖維瘢痕或者肝竇附近及匯管區(qū)出現(xiàn)纖維化,2 級為大部分肝小葉結構完整,但是可以觀察到纖維存在間隔,3級為肝小葉可以觀察到紊亂,纖維間間隔較多,但是未達到硬化標準,4級為肝實質(zhì)損傷,出現(xiàn)纖維彌漫性增生,可見假小葉,且肝組織顯示為肝硬化前期,0 級、1 級、2級、3級與4級分別計分0分、1分、2分、3分、4分。

    1.6 肝功能指標及纖維化指標測定 最后一次給藥結束后第2天,以50 mg/kg劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉處理大鼠收集心臟血500 μL,離心后獲得血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定ALT、AST、ALB、TBI等肝功能指標。采用比色法測定羥脯氨酸及堿性磷酸酶等纖維化指標水平。

    1.7 肝 組 織 中TGF-β/T β R/Smad2/3 信 號 通 路mRNA水平測定 肝臟組織TGF-β1、TβRⅠ)、TβRⅡ、Smad2/3 mRNA 水平采用RT-PCR 測定。肝臟組織100 mg 勻漿處理后采用Trizol 試劑盒進行總RNA 抽提,抽提后采用DEPC 水溶解后在紫外分光光度計上進行總RNA 濃度測定。依據(jù)High-capacity cDNA reverse transcription kits進行mRNA反轉(zhuǎn)錄。在RT-PCR儀上進行RT-PCR 擴增,反應條件設置為:在95℃、95℃、60℃分別處理30 s、5 s、34 s,一共需要循環(huán)40次,引物序列見表1。內(nèi)參選擇GAPDH,最終結果采用2-ΔΔCt計算。

    表1 各引物序列Table 1 Primer sequences

    1.8 肝組織中相關信號通路蛋白表達測定 肝臟組織TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3 蛋白水平采用蛋白印跡法進行測定。小鼠肝臟組織剪碎后置于蛋白裂解液中獲得總蛋白,采用BCA試劑盒確定提取蛋白濃度,置于沸水浴中加熱10 min,電泳后進行轉(zhuǎn)膜處理,蛋白應用5%脫脂牛奶置于室溫下封閉處理1 h,加入一抗后置于4℃過夜處理,第2天應用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次,隨后添加對應二抗,室溫環(huán)境孵育1 h,磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次添加發(fā)光液予以顯色,GAPDH 為內(nèi)參。凝膠成像系統(tǒng)拍照后采用Image J軟件進行分析。

    1.9 統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布,以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用t 檢驗,多組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 三組大鼠肝臟組織病理學染色情況比較 HE染色可見正常組織內(nèi)部肝細胞規(guī)律整齊排列,肝葉結構完整(圖1A);模型組可以肝組織結構異常,存在大量無序假小葉結構,小葉內(nèi)部可以明顯觀察到纖維化和局灶性細胞壞死,其中存在大量炎癥細胞浸潤,可見異型細胞,細胞的細胞核呈不規(guī)則狀(非典型性癌灶),肝小葉結構出現(xiàn)不同情況損傷(圖1B);恩度組雖然依然可見肝細胞損傷及炎癥細胞浸潤,但是損傷較模型組輕,肝纖維化程度低,假小葉形成不明顯(圖1C)。

    圖1 HE染色(40×)Figure 1 HE staining(40×)

    2.2 三組大鼠肝組織肝臟纖維化分級、肝臟指數(shù)及腫瘤情況比較 恩度組大鼠肝臟纖維化分級、肝臟指數(shù)、結節(jié)數(shù)、瘤重明顯低于模型組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而恩度組與模型組大鼠肝臟指數(shù)均高于正常組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

    表2 本組大鼠肝組織肝臟纖維化分級、肝臟指數(shù)及腫瘤情況比較(±s)Table 2 Comparison of the grade of liver fibrosis,liver index,and tumors among the three groups(±s)

    表2 本組大鼠肝組織肝臟纖維化分級、肝臟指數(shù)及腫瘤情況比較(±s)Table 2 Comparison of the grade of liver fibrosis,liver index,and tumors among the three groups(±s)

    注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。Note:Compared with the normal group,aP<0.05;Compared with the model group,bP<0.05.

    組別正常組模型組恩度組t/F值P值只數(shù)抑瘤率(%)5 5 5肝臟纖維化分級-4.00±0.71 2.60±0.55b 3.486 0.008肝臟指數(shù)(%)1.56±0.29 5.19±0.72a 3.97±0.51ab 59.336 0.001結節(jié)數(shù)(個)-10.82±2.67 7.43±1.82b 2.346 0.047瘤重(g)-2.95±0.33 1.52±0.39b 6.259 0.001--18.26±3.86--

    2.3 三組大鼠的肝功能比較 模型組大鼠的ALT、AST、TBI 水平明顯高于正常組,ALB 水平明顯低于正常組,而恩度組大鼠的ALT、AST、TBI 水平明顯低于模型組,ALB 水平明顯高于模型組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

    表3 三組大鼠的肝功能比較(±s)Table 3 Comparison of liver function among the three groups(±s)

    表3 三組大鼠的肝功能比較(±s)Table 3 Comparison of liver function among the three groups(±s)

    注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。Note:Compared with the normal group,aP<0.05;Compared with the model group,bP<0.05.

    組別正常組模型組恩度組F值P值只數(shù)5 5 5 ALT(U/L)36.52±4.01 88.56±9.87a 64.85±7.12b 62.015 0.001 AST(U/L)58.63±6.25 176.21±18.60a 109.58±11.36b 101.447 0.001 TBI(μmmol/g)4.36±0.58 11.14±1.26a 7.59±1.39b 44.737 0.001 ALB(g/L)44.85±4.85 22.74±2.39a 38.52±4.06b 42.539 0.001

    2.4 三組大鼠的肝組織纖維化情況比較 模型組大鼠羥脯氨酸、堿性磷酸酶水平明顯高于正常組,恩度組大鼠羥脯氨酸、堿性磷酸酶水平明顯低于模型組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表4。

    表4 三組大鼠的肝組織纖維化情況比較(±s)Table 4 Comparison of liver fibrosis among the three groups(±s)

    表4 三組大鼠的肝組織纖維化情況比較(±s)Table 4 Comparison of liver fibrosis among the three groups(±s)

    注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。Note: Compared with the normal group,aP<0.05; Compared with the model group,bP<0.05.

    組別正常組模型組恩度組F值P值堿性磷酸酶(kU/L)2.65±0.39 6.76±0.68a 5.32±0.61b 66.123 0.001只數(shù)5 5 5羥脯氨酸(μg/g)2.41±0.32 6.85±0.74a 4.26±0.51b 81.981 0.001

    2.5 三組大鼠肝組織中TGF-β/TβR/Smad2/3信號通路mRNA 水平比較 模型組大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3 等mRNA 水平明顯高于正常組,而恩度組大鼠的TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3等mRNA水平均明顯低于模型組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表5。

    表5 三組大鼠肝組織中TGF-β/TβR/Smad2/3 信號通路mRNA水平比較(±s)Table 5 Comparison of TGF-β/T β R/Smad2/3 signaling pathway mRNA levels in liver tissues of the three groups(±s)

    表5 三組大鼠肝組織中TGF-β/TβR/Smad2/3 信號通路mRNA水平比較(±s)Table 5 Comparison of TGF-β/T β R/Smad2/3 signaling pathway mRNA levels in liver tissues of the three groups(±s)

    注:與正常組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。Note: Compared with the normal group,aP<0.05; Compared with the model group,bP<0.05.

    組別正常組模型組恩度組F值P值0.94±0.13 2.24±0.34a 1.76±0.18b 41.025 0.001 5 5 5 1.72±0.22 3.36±0.42a 2.32±0.31b 32.184 0.001 0.95±0.12 2.86±0.47a 1.74±0.19b 50.908 0.001 0.91±0.10 2.92±0.36a 1.71±0.20b 85.526 0.001 Smad2/3只數(shù)TGF-β(ng/mL)TβRⅠTβRⅡ

    3 討論

    DEN 所致肝癌模型與人體肝癌發(fā)生進展過程相似,為探究肝癌發(fā)生進展機制及篩選肝癌治療潛在藥物[7],本研究選擇DEN 誘導肝癌大鼠模型作為研究對象。在應用DEN處理后,模型組大鼠可見肝臟組織表面逐漸粗糙,可見結節(jié)存在,結節(jié)數(shù)量隨著飼養(yǎng)時間延長而變多,結節(jié)大小不一,顯示大鼠肝組織出現(xiàn)癌變變化。HE 染色可見,模型組大鼠肝臟組織結構中存在大量無序假小葉結構,其內(nèi)浸潤有大量炎癥細胞,伴有大量異型癌灶細胞,這些細胞細胞核形狀不規(guī)則,顯示DEN誘導肝癌模型成功。

    恩度作為血管內(nèi)皮抑制劑,已被應用于多種腫瘤治療中,目前研究證實其可以經(jīng)由阻斷血管內(nèi)皮生長因子受體磷酸化過程,將新生血管形成信號傳導過程阻斷,進而發(fā)揮明顯抗腫瘤作用[8-9]。本研究中恩度組大鼠肝臟纖維化分級、肝臟指數(shù)、結節(jié)數(shù)、瘤重均低于模型組,恩度組大鼠抑瘤率為(18.26±3.86)%,顯示重組人血管內(nèi)皮抑制素恩度確實可以發(fā)揮抑制腫瘤生長作用。吳占慶等[10]研究顯示中晚期原發(fā)性肝癌采用重組人血管內(nèi)皮抑制素治療可以經(jīng)由抑制新生血管形成,阻斷病灶營養(yǎng),發(fā)揮顯著抗腫瘤作用。研究顯示肝細胞癌進展過程包括慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化等諸多過程,其中羥脯氨酸作為形成膠原重要氨基酸,堿性磷酸酶在肝細胞損傷或者癌變情況下釋放異常增多[11]。本研究中肝癌大鼠應用恩度處理后,羥脯氨酸、堿性磷酸酶等纖維化指標水平下降,顯示恩度有效抑制肝癌大鼠肝纖維化進程,既往研究中恩度經(jīng)由抑制新生血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用[12],本研究中恩度可能通過減輕肝癌大鼠肝臟損傷及纖維化程度發(fā)揮顯著抗腫瘤作用。

    為明確恩度對肝癌大鼠抗纖維化-抗腫瘤具體作用機制,本研究測定了大鼠TGF-β/TβR/Smad2/3 信號通路mRNA 及相關蛋白水平。本研究中模型組大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ等mRNA水平均顯著高于正常組,分析認為TGF-β可以促進肝星狀細胞活化,促進膠原蛋白分泌,抑制膠原蛋白水解酶活性,使細胞外基質(zhì)降解及合成平衡被打破,并在組織間隙沉積,導致肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,進而使肝臟出現(xiàn)纖維化病變[13]。恩度處理則會抑制肝組織TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ基因水平,TβRⅠ、TβRⅡ為TGF-β受體,為激活下游Smad 信號重要條件[14],推測恩度抗纖維化-抗腫瘤作用可能與抑制TGF-β及其受體表達有關。TGF-β/Smad 信號通路發(fā)揮作用過程主要為:TGF-β與TβRⅡ結合,隨后募集并活化TβRⅠ,TβRⅠ使Smad2/3激活,形成磷酸化Smad2/3,其后與Smad4構成異源三聚體復合物,復合物入核后可以發(fā)揮調(diào)節(jié)目的基因表達情況,胞漿內(nèi)部Samd7 入核后則會促進復合物解離而中止上述反應[15-17],因此,推斷恩度下調(diào)肝組織TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ表達,進而抑制下游Smad2/3信號通路信號傳導。另有研究顯示α-亞麻酸植物甾醇酯有助于改善小鼠肝纖維化,這一作用與α-亞麻酸植物甾醇酯下調(diào)TGF-β1表達并抑制下游靶分子Smad蛋白表達關系密切[18],與本研究中相關結論類似。Yang等[19]研究也顯示在肝臟疾病的發(fā)生過程中,TGF-β信號轉(zhuǎn)導介質(zhì)Smads受到結構域特異性位點磷酸化的嚴格控制,Smad3 磷酸亞型pSmad3L 和pSmad3C 是可逆的和拮抗的;pSmad2L/C 可通過刺激細胞外基質(zhì)合成,與pSmad3L 共同作用,介導肝組織纖維化過程,與本研究中相關結論一致。

    綜上所述,恩度可以明顯抑制DEN誘導大鼠肝纖維化-肝癌過程,其作用機制可能與抑制TGF-β及相應受體表達、調(diào)控下游Samd2/3 信號激活有關。本研究雖然證實恩度可以發(fā)揮明顯抗纖維化-肝癌作用,但是并未明確采用何種濃度恩度處理才可發(fā)揮最佳抗纖維化-肝癌效果,這將是下一步研究關注重點。

    猜你喜歡
    恩度纖維化肝癌
    肝纖維化無創(chuàng)診斷研究進展
    傳染病信息(2022年3期)2022-07-15 08:24:28
    恩度聯(lián)合化療對晚期非小細胞肺癌的有效性和安全性分析
    健康之家(2021年19期)2021-05-23 09:10:44
    肝纖維化的中醫(yī)藥治療
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:16
    LCMT1在肝癌中的表達和預后的意義
    重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合化療對晚期結直腸癌的療效
    化療聯(lián)合恩度胸腔灌注治療非小細胞肺癌惡性胸腔積液的療效觀察
    microRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展及診治中的作用
    腎纖維化的研究進展
    Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細胞株中的表達
    microRNA在肝癌診斷、治療和預后中的作用研究進展
    精品久久蜜臀av无| 性色av乱码一区二区三区2| 日本五十路高清| 中文字幕高清在线视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 性色av乱码一区二区三区2| 黄色女人牲交| 激情在线观看视频在线高清 | 热99国产精品久久久久久7| 欧美一级毛片孕妇| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲国产精品合色在线| 不卡av一区二区三区| 性少妇av在线| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲国产看品久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产av又大| 成在线人永久免费视频| 欧美在线黄色| 一级a爱视频在线免费观看| 真人做人爱边吃奶动态| av片东京热男人的天堂| 久久九九热精品免费| 天堂√8在线中文| 国产不卡av网站在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产精品1区2区在线观看. | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 美女福利国产在线| 夫妻午夜视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 大香蕉久久网| 精品视频人人做人人爽| 欧美激情久久久久久爽电影 | 免费在线观看影片大全网站| 在线观看免费高清a一片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 男女免费视频国产| 亚洲,欧美精品.| 手机成人av网站| 国产成人免费无遮挡视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 超色免费av| 国产三级黄色录像| 两个人免费观看高清视频| 飞空精品影院首页| 老司机亚洲免费影院| 9色porny在线观看| 国产成人免费观看mmmm| av网站免费在线观看视频| 五月开心婷婷网| 免费黄频网站在线观看国产| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产精品电影一区二区三区 | 男男h啪啪无遮挡| 777米奇影视久久| tocl精华| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品久久久av美女十八| 黄色成人免费大全| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲人成伊人成综合网2020| 高清黄色对白视频在线免费看| 午夜免费观看网址| 国产精品综合久久久久久久免费 | 一级片'在线观看视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 9191精品国产免费久久| 国产精品免费大片| 99香蕉大伊视频| 黄色视频,在线免费观看| 精品国产美女av久久久久小说| 国产精品久久久久久精品古装| 在线国产一区二区在线| 99久久综合精品五月天人人| 99riav亚洲国产免费| 叶爱在线成人免费视频播放| 一a级毛片在线观看| 亚洲精品国产区一区二| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产激情欧美一区二区| 日本vs欧美在线观看视频| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| avwww免费| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 大片电影免费在线观看免费| 久久这里只有精品19| 91国产中文字幕| cao死你这个sao货| 成人免费观看视频高清| 99热只有精品国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 999久久久国产精品视频| 精品国产亚洲在线| 激情在线观看视频在线高清 | 在线观看免费视频网站a站| 老熟女久久久| 午夜激情av网站| av电影中文网址| 国产激情欧美一区二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产亚洲欧美98| 一区在线观看完整版| 久久精品91无色码中文字幕| 91av网站免费观看| 露出奶头的视频| 99在线人妻在线中文字幕 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美精品一区二区免费开放| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲精品一二三| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 免费看a级黄色片| 亚洲 国产 在线| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 黑人操中国人逼视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲熟女毛片儿| 欧美日韩av久久| 高清欧美精品videossex| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲色图综合在线观看| 国产成人av激情在线播放| 欧美中文综合在线视频| av网站在线播放免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费不卡黄色视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 69精品国产乱码久久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 一区二区三区精品91| 免费看十八禁软件| 日韩视频一区二区在线观看| 黄色视频不卡| 大香蕉久久网| 大香蕉久久网| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品久久久人人做人人爽| 男女午夜视频在线观看| 免费在线观看影片大全网站| av免费在线观看网站| 国产在视频线精品| 看免费av毛片| 黄色丝袜av网址大全| 最新在线观看一区二区三区| 青草久久国产| 电影成人av| 国产av精品麻豆| 久久香蕉国产精品| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 悠悠久久av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美性长视频在线观看| 看黄色毛片网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 伦理电影免费视频| √禁漫天堂资源中文www| 中出人妻视频一区二区| 亚洲欧美激情综合另类| bbb黄色大片| 久久香蕉激情| 两性夫妻黄色片| 亚洲av片天天在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| av天堂久久9| 精品欧美一区二区三区在线| 国产97色在线日韩免费| x7x7x7水蜜桃| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 美女视频免费永久观看网站| 一区二区三区激情视频| 在线观看免费视频日本深夜| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲国产精品合色在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| videos熟女内射| 丝瓜视频免费看黄片| 精品电影一区二区在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久热爱精品视频在线9| av免费在线观看网站| 老司机在亚洲福利影院| 老司机在亚洲福利影院| 手机成人av网站| 欧美日韩av久久| 老司机在亚洲福利影院| 老司机在亚洲福利影院| 老司机在亚洲福利影院| 欧美日韩av久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| www日本在线高清视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 美女国产高潮福利片在线看| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 超碰成人久久| 国产精品国产高清国产av | 捣出白浆h1v1| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产午夜精品久久久久久| 啦啦啦 在线观看视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 女人久久www免费人成看片| 亚洲第一青青草原| 高清视频免费观看一区二区| 99热只有精品国产| 精品乱码久久久久久99久播| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 天堂动漫精品| 国产三级黄色录像| 日韩视频一区二区在线观看| 91av网站免费观看| 久久99一区二区三区| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产成人免费观看mmmm| 成熟少妇高潮喷水视频| 99国产精品99久久久久| 999久久久精品免费观看国产| 久久久国产欧美日韩av| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产av又大| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品欧美一区二区三区在线| 国产精品久久电影中文字幕 | 99国产精品99久久久久| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产亚洲精品一区二区www | 俄罗斯特黄特色一大片| 交换朋友夫妻互换小说| 成年人黄色毛片网站| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 黄频高清免费视频| 午夜福利在线观看吧| 欧美国产精品一级二级三级| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 成人黄色视频免费在线看| 国产成人免费观看mmmm| 黄色丝袜av网址大全| 看免费av毛片| 欧美性长视频在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品免费一区二区三区在线 | 69精品国产乱码久久久| 亚洲免费av在线视频| 国产精品永久免费网站| 在线国产一区二区在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲 国产 在线| 精品视频人人做人人爽| 日本黄色日本黄色录像| 国产午夜精品久久久久久| 女人久久www免费人成看片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 1024视频免费在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 国产午夜精品久久久久久| 免费观看a级毛片全部| av电影中文网址| 国产不卡一卡二| 母亲3免费完整高清在线观看| 伦理电影免费视频| 不卡一级毛片| 国产精品九九99| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 91精品国产国语对白视频| 好男人电影高清在线观看| av有码第一页| 在线观看免费午夜福利视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 看黄色毛片网站| 亚洲av成人一区二区三| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 国产精品av久久久久免费| 午夜老司机福利片| 超碰成人久久| 久久天堂一区二区三区四区| av福利片在线| 国产精品电影一区二区三区 | 国产精品一区二区在线观看99| 精品国产乱码久久久久久男人| 又大又爽又粗| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品永久免费网站| 成人精品一区二区免费| 午夜激情av网站| av线在线观看网站| 精品国产美女av久久久久小说| 久久久久久久午夜电影 | 国产亚洲精品久久久久5区| 18在线观看网站| 十分钟在线观看高清视频www| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产亚洲精品一区二区www | 免费人成视频x8x8入口观看| 一区在线观看完整版| 99久久综合精品五月天人人| 看免费av毛片| 欧美日韩精品网址| 12—13女人毛片做爰片一| 久久狼人影院| 十八禁网站免费在线| 人成视频在线观看免费观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 男女高潮啪啪啪动态图| 在线观看舔阴道视频| 国产99白浆流出| 国产精品香港三级国产av潘金莲| av有码第一页| 国产精品久久视频播放| 免费不卡黄色视频| 黄色a级毛片大全视频| 色老头精品视频在线观看| 精品电影一区二区在线| 丰满的人妻完整版| 性色av乱码一区二区三区2| 在线观看日韩欧美| 日韩欧美在线二视频 | 国产不卡av网站在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 男女免费视频国产| 精品无人区乱码1区二区| 制服人妻中文乱码| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜精品国产一区二区电影| 在线永久观看黄色视频| 午夜亚洲福利在线播放| 操出白浆在线播放| 久久久久国产一级毛片高清牌| 精品一区二区三区av网在线观看| 咕卡用的链子| 国产高清视频在线播放一区| 免费少妇av软件| 国产精品一区二区在线观看99| 99riav亚洲国产免费| 91麻豆av在线| 咕卡用的链子| 欧美乱色亚洲激情| 妹子高潮喷水视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲熟妇熟女久久| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久久国产一区二区| 91精品国产国语对白视频| 一本大道久久a久久精品| 国产精品久久久久成人av| 中文亚洲av片在线观看爽 | 久久九九热精品免费| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品综合久久久久久久免费 | 午夜福利欧美成人| 国产在线观看jvid| 久久天堂一区二区三区四区| 天堂动漫精品| 欧美日韩乱码在线| 热99re8久久精品国产| 久久人妻av系列| 精品福利观看| 精品一区二区三卡| av有码第一页| 成人黄色视频免费在线看| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| 一个人免费在线观看的高清视频| 成人黄色视频免费在线看| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美激情 高清一区二区三区| av超薄肉色丝袜交足视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 一本大道久久a久久精品| 亚洲精品在线观看二区| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲成a人片在线一区二区| a级毛片黄视频| 国产精品二区激情视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲片人在线观看| 欧美日韩乱码在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 久久九九热精品免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| av视频免费观看在线观看| 国产黄色免费在线视频| 搡老乐熟女国产| 激情视频va一区二区三区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久性视频一级片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 婷婷成人精品国产| 国产欧美亚洲国产| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 69av精品久久久久久| 国产片内射在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 99精品久久久久人妻精品| 99国产精品99久久久久| 日本五十路高清| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品 欧美亚洲| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品二区激情视频| 无人区码免费观看不卡| 欧美乱码精品一区二区三区| 搡老岳熟女国产| 亚洲五月天丁香| 黄片播放在线免费| 午夜精品国产一区二区电影| 香蕉丝袜av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品成人av观看孕妇| 99精品欧美一区二区三区四区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 香蕉久久夜色| 亚洲国产看品久久| 国产黄色免费在线视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 自线自在国产av| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美精品亚洲一区二区| 99热只有精品国产| 女人精品久久久久毛片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 18禁国产床啪视频网站| 九色亚洲精品在线播放| 国产不卡一卡二| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日韩欧美在线二视频 | 久久人妻熟女aⅴ| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 妹子高潮喷水视频| 免费观看人在逋| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 在线观看午夜福利视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 丁香欧美五月| 国产精品偷伦视频观看了| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品久久久人人做人人爽| av福利片在线| 成年人午夜在线观看视频| 十八禁网站免费在线| av片东京热男人的天堂| 岛国在线观看网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产麻豆69| 欧美日韩精品网址| 高清视频免费观看一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一本综合久久免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩一级在线毛片| 在线国产一区二区在线| 久久久精品免费免费高清| 后天国语完整版免费观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 丰满的人妻完整版| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产精品一区二区免费欧美| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 午夜影院日韩av| 日韩人妻精品一区2区三区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精品人妻1区二区| 一级,二级,三级黄色视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 啪啪无遮挡十八禁网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品国产一区二区久久| 岛国在线观看网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 美女 人体艺术 gogo| 成年人午夜在线观看视频| 久久久久精品人妻al黑| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品免费视频内射| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一级片'在线观看视频| 婷婷成人精品国产| 香蕉丝袜av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久中文字幕一级| 两个人看的免费小视频| 十八禁高潮呻吟视频| 久久精品成人免费网站| 国产1区2区3区精品| 精品一品国产午夜福利视频| 久99久视频精品免费| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲国产看品久久| 女警被强在线播放| 不卡一级毛片| 电影成人av| 热99国产精品久久久久久7| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日日夜夜操网爽| www.999成人在线观看| 制服人妻中文乱码| av视频免费观看在线观看| 777米奇影视久久| 啦啦啦免费观看视频1| 国产成人免费观看mmmm| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲五月婷婷丁香| 少妇 在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 99精国产麻豆久久婷婷| 91在线观看av| 色94色欧美一区二区| 中文字幕av电影在线播放| 啦啦啦 在线观看视频| 久久热在线av| av视频免费观看在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 最新在线观看一区二区三区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲久久久国产精品| 国产成人av激情在线播放| 人妻 亚洲 视频| 欧美一级毛片孕妇| 在线视频色国产色| 成人国语在线视频| av中文乱码字幕在线| 人人妻人人澡人人看| 美女视频免费永久观看网站| 青草久久国产| 亚洲成人免费电影在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 老司机亚洲免费影院| 51午夜福利影视在线观看| 国产视频一区二区在线看| 制服诱惑二区| 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲五月色婷婷综合| 男人的好看免费观看在线视频 | 18禁美女被吸乳视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 99国产综合亚洲精品| 精品久久久久久久久久免费视频 | 欧美精品亚洲一区二区| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 在线观看午夜福利视频| 九色亚洲精品在线播放| 国产成人影院久久av| 又紧又爽又黄一区二区| 一级,二级,三级黄色视频| 97人妻天天添夜夜摸| 国产精品 国内视频| 女性被躁到高潮视频| 亚洲七黄色美女视频| 曰老女人黄片| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线观看免费高清a一片| 捣出白浆h1v1| 国产精品电影一区二区三区 |