Xpert MTB/RIF Ultra 在快速檢測結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥中的應(yīng)用

王垚 林珍麗 陳新朝 黃明翔

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種慢性傳染病，目前仍然是導(dǎo)致單一傳染病死亡的主要原因之一［1］。我國是TB 高負(fù)擔(dān)國家，耐藥結(jié)核?。―rug Resistant Tuberculosis，DR?TB）的控制形勢尤其嚴(yán)峻。涂片抗酸染色簡便易行，但其敏感度低，漏診率高；MGIT 960 液體培養(yǎng)法（液體培養(yǎng)）是MTB 病原學(xué)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，然而獲得培養(yǎng)和藥敏結(jié)果耗時過長［2］，無法滿足臨床快速診斷TB 并得到可靠藥敏結(jié)果的需求。

近年，分子生物學(xué)檢測技術(shù)興起，Xpert 及其二代產(chǎn)品Xpert Ultra 均可快速檢測MTB 及其利福平耐藥性。已有國外研究表明Xpert Ultra 檢出MTB 靈敏度更高，可提高涂陰肺結(jié)核的診斷。在TB 低負(fù)擔(dān)國家中，Xpert Ultra 檢出MTB 的特異性與Xpert 相當(dāng)，高達(dá)95%［3?4］。目前國內(nèi)尚未有Xpert Ultra 應(yīng)用于大規(guī)模肺結(jié)核痰樣本量的研究。本文通過對Xpert Ultra、Xpert 與液體培養(yǎng)在痰標(biāo)本中檢測MTB 的結(jié)果進(jìn)行比較，并分析Xpert Ultra、液體藥敏和Sanger 測序檢測利福平耐藥的一致性，初步探討Xpert Ultra 在臨床結(jié)核病診療中的應(yīng)用價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2019 年12 月至2020 年5 月福州肺科醫(yī)院疑似肺結(jié)核患者447 例為研究對象，所有研究對象均已簽署知情同意書（福州肺科醫(yī)院倫理委員會批件號：2018?008（科研）?01）。納入標(biāo)準(zhǔn)：具有肺結(jié)核可疑癥狀、體征且近6 個月內(nèi)未使用過抗結(jié)核藥。臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《WS288?2017 肺結(jié)核診斷》［5］。對Xpert Ultra 結(jié)果與臨床診斷不符的患者，對其進(jìn)行6 個月隨訪，以確認(rèn)最終臨床診斷。臨床最終確診為活動性肺結(jié)核234 例，其中男性185 例、女性49 例，平均年齡（49.82±16.49）；非結(jié)核分枝桿菌（non?tuberculosis mycobacteria，NTM）肺部感染12 例；其他肺部疾病201 例。172 例Xpert Ultra 檢出MTB 的患者依據(jù)入組前抗結(jié)核治療情況，分為初治患者117 例，復(fù)治患者55 例。

1.2 主要儀器和試劑

BACTEC MGIT960 液體培養(yǎng)系統(tǒng)及配套培養(yǎng)、藥敏試劑購自美國BD 公司；GeneXpert Dx 檢測系統(tǒng)及配套Xpert、Xpert Ultra 檢測試劑盒購自美國Cepheid 公司；抗酸染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；結(jié)核分枝桿菌抗原MPT64 檢測試劑盒購自Standard Diagnostic 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 痰涂片及抗酸染色鏡檢

留取合格的痰樣本：性狀一般為干酪痰、血痰或黏液痰，標(biāo)本量一般在3～5 mL。

痰抗酸染色并鏡檢：按照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃·痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》［6］中的標(biāo)準(zhǔn)操作程序執(zhí)行并報告結(jié)果。依據(jù)鏡下抗酸桿菌量進(jìn)行判讀，結(jié)果分為陰性（-）和陽性（1+～4+），本研究以1+及以上為涂片陽性。

1.3.2 MGIT960 液體培養(yǎng)

發(fā)展文化戲曲事業(yè)，是實現(xiàn)中華民族偉大復(fù)興的中國夢的需要。呂劇作為山東文化大觀園中的一朵奇葩，是呂劇故鄉(xiāng)人的驕傲和自豪。站在新起點，應(yīng)對新挑戰(zhàn)，東營區(qū)要象抓經(jīng)濟(jì)建設(shè)一樣重視呂劇文化建設(shè)，積極采取對策，跟上時代潮流，加快呂劇文化的傳承、宣傳、創(chuàng)新和發(fā)展，切實做大做強呂劇文化產(chǎn)業(yè)，讓現(xiàn)代呂劇“唱響山東、走向世界”，全力打響“中國呂劇文化品牌”。在黃藍(lán)經(jīng)濟(jì)區(qū)建設(shè)中，充分發(fā)揮黃河口國際馬拉松賽、中國（東營）國際石油石化裝備與技術(shù)展覽會、黃河口文化藝術(shù)節(jié)等節(jié)慶平臺作用，實現(xiàn)呂劇唱戲搭臺，以戲為媒，增強交流，促進(jìn)呂劇故鄉(xiāng)經(jīng)濟(jì)繁榮。

嚴(yán)格按照BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)操作說明書進(jìn)行培養(yǎng)。用4%N?乙酰?L?半胱氨酸?NaOH 進(jìn)行處理，將處理后的標(biāo)本接種于含營養(yǎng)添加劑及抑制劑的MGIT 液體培養(yǎng)管進(jìn)行液體培養(yǎng)。儀器自動報陽后對培養(yǎng)物進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.3 菌種鑒定

采用免疫法，遵循試劑盒生產(chǎn)商提供的實驗步驟，通過檢測陽性培養(yǎng)物中MTB 特異抗原MPT64 鑒定菌種。

1.3.4 MGIT960 液體藥敏試驗

對菌種鑒定為MTB 的菌株采用比例法對四種一線藥物鏈霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇進(jìn)行藥物敏感性試驗，其中利福平的濃度為1.0 μg/mL，由儀器自動判讀結(jié)果。

1.3.5 Xpert 和Xpert Ultra 檢測

根據(jù)試劑配套操作說明書，取痰液置于無菌痰杯中，1∶2 加入樣本處理液，旋緊杯蓋，用力振搖10～20 次，室溫下靜置15 min，在靜置5～10 min 時再次用力振搖10～20 次，使痰充分液化。取2 mL液化后的痰液加入反應(yīng)盒，將反應(yīng)盒置于檢測模塊，儀器開始自動檢測，Xpert 檢測耗時2 h、Xpert Ultra 檢測耗時80 min，檢測程序運行結(jié)束系統(tǒng)可自動讀出MTB 檢測結(jié)果與利福平耐藥結(jié)果。

1.3.6rpoB基因序列檢測

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 涂片抗酸染色結(jié)果

447 例疑似肺結(jié)核患者中，陽性79 例，確診肺結(jié)核患者74 例，余下5 例患者最終診斷為NTM 所致肺部感染。

2.2 三種檢測方法的陽性率比較

對447 例疑似肺結(jié)核患者痰樣本分別行液體培養(yǎng)、Xpert Ultra 和Xpert 檢測，三種檢測方法陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 三種檢測方法陽性率比較［n（%）］Table 1 Comparison of positive rate of three methods［n（%）］

2.3 三種方法檢測MTB 患者的效能

在447 例疑似肺結(jié)核患者中，以最終確診結(jié)果為參照，用Xpert Ultra、Xpert 和液體培養(yǎng)檢測MTB，三種方法敏感度分別為73.50%、68.80%和46.15%，特異度分別為97.2%，98.59%和100%。見表2。

表2 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)三種檢測方法的結(jié)果比較Table 2 Comparison of three detection methods based on the clinical diagnosis

2.4 Xpert Ultra 菌量分級與Xpert、液體培養(yǎng)和涂片結(jié)果的比較

Xpert 在“微量”和“極低”這兩個級別檢出率為72.09%（31/43），在“低”、“中”和“高”三個級別的檢出率99.22%（128/129），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在“微量”和“極低”的樣本中，液體培養(yǎng)的檢出率僅為27.90%（12/43）；而在“低”及以上三個級別的樣本中，陽性率達(dá)66.67%（86/129），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 Xpert Ultra 各含菌量級別樣本同時行Xpert、液體培養(yǎng)法和涂片法的結(jié)果分布情況［n（%）］Table 3 The distribution of Xpert Ultra samples with different levels of bacteria detected by Xpert，liquid culture and smear method［n（%）］

2.5 Xpert Ultra 檢測利福平耐藥性的結(jié)果

經(jīng)液體培養(yǎng)陽性的108 例樣本中，Xpert Ultra未檢出MTB 的10 例被排除，另有“RIF Resis?tance 不明確”5 例也被排除，共93 例樣本納入統(tǒng)計分析。以液體藥敏為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra 檢出利福平耐藥的敏感度為88.89%，陽性預(yù)測值為100%，結(jié)果與液體藥敏高度一致（kappa=0.928）。見表4。

表4 Xpert Ultra 檢測利福平耐藥性的結(jié)果［n（%）］Table 4 The results of Xpert Ultra in detecting rifampicin resistance［n（%）］

2.6 Xpert Ultra 利福平rpoB 基因檢測結(jié)果

159 例Xpert Ultra 和Xpert 同時檢出MTB 的樣本中，排除17 例Xpert Ultra 和Xpert 檢測結(jié)果為“RIF Resistance 不明確”的樣本（主要為MTB 檢測結(jié)果為“極低”和“微量”兩個級別），共142 例樣本納入統(tǒng)計。以rpoB基因Sanger 測序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra 檢出利福平耐藥30 例，僅2 例未檢出，敏感度為93.75%，其與基因測序、Xpert的結(jié)果具有高度的一致性，kappa值均達(dá)到0.959。見表5。

表5 三種分子檢測方法檢測利福平rpoB 基因的結(jié)果比較［n（%）］Table 5 Comparison of the results of three molecular assays for the detection of the rifampicin rpoB gene［n（%）］

2.7 Sanger 測序檢測rpoB 基因突變特征

對液體藥敏結(jié)果為利福平耐藥的菌株和Xpert Ultra 或Xpert 檢出利福平耐藥的痰液共35例樣本進(jìn)行rpoB基因序列Sanger 測序。rpoB基因突變情況：3 例樣本發(fā)生了多位點（≧3 個）堿基突變，均為復(fù)治患者；有2 名復(fù)治患者和1 名初治患者樣本發(fā)生rpoB基因雙位點堿基突變；單位點堿基突變最為常見，共29 例，其中初治患者10 名，復(fù)治患者19 名。見表6。

表6 35 株進(jìn)行基因序列的MTB 菌株rpoB 基因突變位點分布情況［n（%）］Table 6 Distribution of mutation sites of rpoB gene in 35 MTB strains with gene sequences［n（%）］

3 討論

耐多藥結(jié)核?。∕ultidrug Resistant Tuberculo?sis，MDR?TB）是我國重要的公共衛(wèi)生問題之一，及早診治是控制結(jié)核病傳播的重要措施。MTB分子生物學(xué)檢測技術(shù)已作為肺結(jié)核診斷依據(jù)之一［5］。Xpert是整合了樣本制備、核酸提取、PCR 擴(kuò)增于一體的實時分子診斷系統(tǒng)，操作便捷，可2 h 內(nèi)同時完成MTB及其利福平耐藥性的檢測，被WHO 推薦用于活動性TB/DR?TB 的診斷［7］。Xpert Ultra 是基于Xpert的二代檢測卡盒，其操作步驟不變，在提高M(jìn)TB檢出敏感度同時縮短檢測時間，僅耗時80 min。

本研究結(jié)果顯示，以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra 檢出MTB 敏感度較Xpert 提高約5%，這與Xpert Ultra 和Xpert 比對實驗報告一致［8］；在 檢出MTB 特異度方面，Xpert Ultra 與Xpert 無差別，與Andama 等［9］的研究觀察一致。

Xpert Ultra 利用全封閉巢式多重實時熒光PCR 檢測利福平耐藥相關(guān)rpoB基因的“核心”區(qū)域（RRDR）和兩個額外的靶基因（IS1081和IS6110）。Xpert Ultra 還將卡盒的DNA 檢測體系提高一倍，故其可檢出極低濃度或“微量”MTB，檢測限低至15.6 CFU/mL［10］。Xpert Ultra 的結(jié)果為“極低及微量”級別時，培養(yǎng)法和涂片法陽性率僅分別為27.90%和9.30%，說明在菌量極低時Xpert Ultra 檢測遠(yuǎn)較培養(yǎng)與涂片法檢出率高，顯示其在檢測涂陰肺結(jié)核樣本的優(yōu)越性，國外Dorman 等［4］的研究中也得到相似結(jié)論。本試驗結(jié)果顯示隨Xpert Ultra 檢測含菌量級別的升高涂片的陽性率也相應(yīng)提高。據(jù)文獻(xiàn)報道當(dāng)患者檢出MTB“中和高”級別應(yīng)被認(rèn)為具有高傳染性［11?12］。因此Xpert Ultra 檢測可對患者的傳染性起到早期預(yù)警作用，避免人際傳播。

利福平和異煙肼都是重要的一線抗結(jié)核藥物，由于大部分對利福平耐藥的菌株也對異煙肼耐藥［13］，因此，監(jiān)測利福平耐藥性有助于早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療MDR?TB 患者。

Xpert Ultra 檢測利福平耐藥性與金標(biāo)準(zhǔn)液體藥敏法相比具有較高的靈敏度和較好的一致性。然而，有2 例樣本液體藥敏檢出利福平耐藥但Xpert Ultra 未檢出。這可能是因為這2 例樣本菌株的rpoB突變發(fā)生在RRDR 外［14］，據(jù)報道只有95%的rpoB突變與RRDR 相關(guān)［15］。Xpert Ultra、Xpert 和Sanger 的利福平耐藥性檢測結(jié)果高度一致，三種方法檢測能力相當(dāng)，這與之前相關(guān)研究報道相符［4，14，16］。

為了解福州地區(qū)rpoB突變情況，本試驗對35例菌株或痰樣本進(jìn)行rpoB基因序列Sanger 測序，發(fā)現(xiàn)堿基點突變最為常見，共34 例，主要分布在507?533 位點間的19 個位置，余1 例為堿基插入突變，發(fā)生在513 位點（insCAA?CGCCAA）。

總之，Xpert Ultra 不僅具備Xpert 準(zhǔn)確快速、操作簡便的優(yōu)點，而且大幅提高了荷菌量較低患者的MTB 檢出率，在利福平耐藥檢測方面與液體藥敏結(jié)果高度一致，可以為結(jié)核病早期診斷及治療提供實驗室依據(jù)。Xpert Ultra 檢測具有對人員操作要求不高、生物安全風(fēng)險小等優(yōu)勢，適合在各級醫(yī)療機構(gòu)推廣。