產(chǎn)前超聲結合NGS 在一例MCPH5 型胎兒產(chǎn)前診斷中的應用

曾玉坤 劉淵 余麗華 劉玲 丁紅珂★

原發(fā)性小頭畸形（Congenital Microcephaly）是指在妊娠期間發(fā)生的腦組織發(fā)育明顯偏小的一種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，依據(jù)遺傳方式部分被命名為常染色體隱性原發(fā)性小頭畸形（Autosomal Reces?sive Primary Microcephaly，MCPH），主要表現(xiàn)包括頭圍減小、非進行性智力低下，部分患者存在癲癇發(fā)作、輕度至重度的智力障礙、聽力障礙等［1］。目前按照2019 年加拿大婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會（Society of Obstetricians and Gynaecologists of Canada，SOGC）發(fā)布的“產(chǎn)前確認小頭畸形的調查和管理”指南解讀［2］中關于小頭畸形的定義：胎兒頭圍（枕額徑）小于或等于特定年齡段、性別及種族頭圍中位數(shù)的3個標準差（3SD），或者定義為小于特定中位數(shù)的3 個標準差被稱之小頭畸形。與MCPH 相關的致病基因隨著下一代測序技術（Next?Generation Sequencing，NGS）的迅速發(fā)展被越來越多地發(fā)現(xiàn)，相關基因的研究也不斷深入。查詢OMIM 數(shù)據(jù)庫可知，目前已命名的MCPH 相關基因有28 個。本研究中，產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)一胎兒頭圍偏小（?2SD），雖未達到上述小頭畸形的臨床診斷標準，但孕婦曾有過小頭畸形不良孕產(chǎn)史，本次妊娠胎兒再次出現(xiàn)類似臨床表現(xiàn)，為進一步明確可能的致病基因及變異位點，在孕婦本人強烈要求及知情同意的前提下，采用下一代測序技術的方法進行產(chǎn)前診斷，進而發(fā)現(xiàn)與臨床表型相關的有絲分裂相關基因（abnomal spindle homo?log microcephaly associated，ASPM）上存在復合雜合變異位點，現(xiàn)就相關研究過程詳述如下：

1 對象與方法

1.1 對象

2020 年1 月至廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診孕婦，32 歲，停經(jīng)28+周，超聲發(fā)現(xiàn)胎兒雙頂徑及頭圍小于孕周3 周（?2SD）及透明隔腔偏小。見圖1。該孕婦此前于2017 年孕32 周時曾因胎兒“小頭畸形”引產(chǎn)。本研究經(jīng)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有基因診斷工作均取得孕婦本人及其丈夫同意，并簽署了知情同意書。

圖1 Ⅲ級超聲檢測結果Figure 1 Tertiary ultrasound results

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

采集臍血及夫妻雙方外周靜脈血各3 mL，以乙二胺四乙酸二鉀（EDTA?2K）抗凝。使用QIAGEN公司生產(chǎn)的Qiamp DNA Blood Mini Kit 對樣本進行基因組DNA 提取，提取的DNA 使用Thermo NANO DROP 2000 分光光度計檢測濃度和純度，要求DNA樣本純度OD A260/A280 介于1.8～2.0 之間。

1.2.2 高通量測序

使用下一代測序技術的方法將提取后的臍帶血及夫妻雙方外周血DNA 進行測序分析，測序所覆蓋的基因為在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）收錄的與遺傳性疾病相關的4 000 多個基因：包括神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病、遺傳代謝病、心血管系統(tǒng)遺傳病、眼耳疾病等，測序工作由廣州嘉檢醫(yī)學檢測公司完成。整個序列分析包括74 566 個編碼區(qū)，共12 424 088個堿基；平均覆蓋深度372+/?152X，大于10X 覆蓋區(qū)間占99.2%，大于20X 覆蓋區(qū)間占99.0%。參考序列版本號：GRCh37/hg19。測序原始數(shù)據(jù)通過使用BWA 軟件進行序列比對，然后針對包括單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入與缺失等變異類型采用GATK 和Var Scan 軟件進行識別、注釋和分析，同時使用CASAVA v1.7（Illumina 公司）軟件對可能存在的拷貝數(shù)變異（Copy number variation，CNV）進行分析。

1.2.3 Sanger 測序驗證

針對分析后與臨床表型相關的基因變異，采用Sanger 測序進行驗證。采用Primer5 軟件設計引物，用聚合酶鏈反應（PCR）技術擴增ASPM基因（NM_018136）變異位點c.6970dupA 及c.7541delA所在外顯子及其側翼序列，引物序列送往天一輝遠廣州基因科技有限公司合成，具體序列為：ASPM?EX28F：5′?AATGATGCATATAGCCGCAAC?3′，ASPM?EX28R：5′?TGGTAGAAACAATACTGCC?TA?3′，產(chǎn)物擴增長度約為942 bp。PCR 擴增體系包括TaKaRa 商品化LATaq預混液12.5 μL，濃度為5 mol/L 甜菜堿5 μL，濃度為10 μmol/L 的正、反向引物各1 μL，濃度為45 ng/μL 樣本DNA1.5 μL，無核酸水至25 μL；PCR 反應條件為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，進行40 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送至天一輝遠廣州基因科技有限公司進行Sanger 測序，并參照美國醫(yī)學遺傳學與基因組學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）評級指南［3］對相關位點致病性進行評估分析。

2 結果

2.1 高通量測序結果

在ASPM基因（NM_018136）上發(fā)現(xiàn)與疾病相關的變異位點：c.6970dupA（p.R2324Kfs*49）雜合復合 c.7541delA（p.Y2514Ffs*31）雜 合變異。

2.2 sanger 測序驗證結果

正常對照、父母和胎兒相應變異位點sanger 測序結果見圖2。驗證結果與高通量測序結果一致。

圖2 ASPM 基因變異位點（NM_018136）sanger 測序結果Figure 2 Sanger sequencing of ASPM gene mutation sites

3 討論

大腦的體積及腦回數(shù)量與神經(jīng)元的數(shù)量有關，而神經(jīng)元的數(shù)量和大腦本身的結構復雜度又與差異化的認知功能密切相關。但這并不意味著大腦越大認知功能就會表現(xiàn)得越好，相比于小頭畸形的“巨腦癥”同樣也有智力低下的表現(xiàn)，由此可知正常尺寸的大腦才能正常發(fā)揮腦功能不可替代的重要作用［4］。MCPH 是一種神經(jīng)源性有絲分裂疾病，其臨床特征是出生時出現(xiàn)小頭畸形和非進行性智力低下，但患者的神經(jīng)元遷移、凋亡和功能正常。已有的研究表明遺傳和環(huán)境原因均可導致該疾病的發(fā)生［5?6］。查詢OMIM 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，迄今為止已經(jīng)命名的來自世界各地不同人群的MCPH 基因座（MCPH1?MCPH28）共計28 個，其中與MCPH5 相關ASPM基因的變異報道最為豐富［7?11］。由于ASPM 屬于較早發(fā)現(xiàn)的MCPH 蛋白，因而此類蛋白相關動物模型建立亦較多［12］。

ASPM基因位于1q31.3 染色體上，包含62 567 bp，3 477 個氨基酸，28 個外顯子，其編碼的蛋白存在于有絲分裂過程中的紡錘體和中心體上。該基因結構域包括一個N 端、一個81IQ（異亮氨酸?谷氨酰胺）結構域和一個Calponin 同源結構域和一個C 端［13］。該基因與小頭畸形間的關系目前研究已較為明確［1，14］。Fujimori 等［15］的研究 亦表明ASPM對神經(jīng)干/祖細胞的增殖和分化至關重要。Gemma 等［16］也發(fā)現(xiàn)ASPM在神經(jīng)發(fā)生開始和早期階段表達很高，隨著神經(jīng)發(fā)生的進行逐漸減少。Buchman 等［17］的研究同樣認為ASPM在促進Wnt介導的神經(jīng)發(fā)生過程中提供了“動力”的作用，該基因的正確表達對于神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元遷移至關重要。上述研究均進一步支持ASPM基因致病變異與神經(jīng)發(fā)育異常會導致小頭畸形的產(chǎn)生，此外動物實驗［18?19］也證實了該結論。

由于存在不良孕產(chǎn)史且表型相似，臨床懷疑遺傳性疾病的可能性較大，因而本次妊娠在超聲再次發(fā)現(xiàn)胎兒頭圍偏小時孕婦要求進行產(chǎn)前診斷。后續(xù)高通量測序發(fā)現(xiàn)了與疾病相關的ASPM基因上存在c.6970dupA 復合c.7541delA 雜合變異，其中c.7541delA 為堿基缺失改變，該缺失變異使得后續(xù)閱讀編碼框發(fā)生了移碼改變，進而引起編碼功能蛋白的改變，該變異遺傳自母親，后續(xù)sanger 測序驗證也證實了該檢測結果；除此變異外，在ASPM基因上還發(fā)現(xiàn)了c.6970dupA 雜合變異，該變異不僅使第2 324 位密碼子發(fā)生改變（Arg2324Lys），同時由于堿基的插入使得后續(xù)閱讀框同樣發(fā)生了移碼改變，最終在第2 373 位密碼子變?yōu)榻K止密碼子，從而導致編碼蛋白提前終止，正常合成的功能蛋白發(fā)生截短，該變異遺傳自父親，后續(xù)同樣使用sanger 測序的方法對其進行了驗證，結果一致。上述變異位點查閱相關數(shù)據(jù)庫及國內外文獻資料，均未見有病例報道。有關ASPM基因的變異位點查詢Clinvar 數(shù)據(jù)庫得知，目前記錄的致病和疑似致病變異當中，移碼變異所占比例接近一半（109/243），而包括良性、疑似良性的變異位點中均未記錄有框移碼變異（0/314），通過變異人群頻率、遺傳模式、文獻報道及蛋白功能影響等信息，結合生物信息學軟件預測，根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南［3］，判定該基因2 個位點的變異性質均為“疑似致病”，2PM+2PP，即2 個中等和2 個支持證據(jù)。

國內外關于小頭畸形的文獻報道目前仍較為有限，疾病的相關發(fā)病機制仍處于研究當中。針對小頭畸形的最新定義為臨床進行疾病的診斷提供了科學依據(jù)，也進一步降低了假陽性率。但同時也應該考慮到對于部分存在胎兒頭圍偏小（>2SD，<3SD）但超聲結果未達到該診斷標準的受孕家庭，如果僅依據(jù)測量值來進行該疾病的早期診斷依然存在一定的局限性和漏診的可能性，且由于超聲的頭圍測量值會由于超聲醫(yī)生本身的技術水平、胎兒孕周大小而存在一定差異，因而更加科學的方法應該是同時結合超聲、家族史或不良孕產(chǎn)史等臨床信息，必要時聯(lián)合目前成熟開展的高通量測序進行產(chǎn)前分子診斷以明確致病因素。本研究在結合臨床超聲檢測結果及孕婦類似不良孕產(chǎn)史進行綜合判斷，分析認為胎兒小頭畸形的可能性較大，后續(xù)采用高通量測序方法進行產(chǎn)前分子診斷，發(fā)現(xiàn)了與疾病相關的ASPM基因上存在疑似致病變異位點，研究結果不僅擴充了小頭畸形的基因變異譜，也為后續(xù)臨床醫(yī)生為該家庭提供遺傳建議及臨床決策提供了科學依據(jù)。