廣東陽江地區(qū)地中海貧血基因突變譜分析

梁偉敏 謝文光 劉莉莉 楊立業(yè)★

地中海貧血（簡稱地貧）是全球分布最廣、累及人群最多的一種單基因病，全世界大約有3.5億基因攜帶者。地貧在地中海、東南亞等地區(qū)高發(fā)［1］。我國地貧高發(fā)區(qū)為長江以南的廣大地域，其中以海南、廣東和廣西三省為甚［2］。它給流行區(qū)的人們造成了巨大的公共衛(wèi)生問題和社會負擔。依據(jù)以往研究報道，廣東省部分地區(qū)α?地貧基因攜帶率為3.16～11.72%，β?地貧攜帶率為1.96～3.87%［3?5］。陽江地區(qū)位于廣東省西南沿海，緊鄰珠三角，扼粵西要沖，土地面積7955.9 平方公里，常住人口為260.29 萬。陽江地區(qū)是廣東省21 個地區(qū)α?和β?地貧攜帶者率最高地區(qū)之一［6］。對高發(fā)地區(qū)的人群進行遺傳基因型研究，對開展人群水平的地貧預(yù)防有重要意義。本文對陽江地區(qū)的4 538 例確診地貧樣本進行基因突變類型分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象

樣本收集從2018 年1 月至2020 年12 月陽江地區(qū)10 163 例檢測地中海貧血基因標本，標本來自陽江市婦幼保健院。標本類型為臍帶血、胎兒絨毛組織和年齡1 天～53 歲人群外周血。受試者平均年齡（18.3±14）歲，中位數(shù)年齡25 歲。所有患者或監(jiān)護人均簽署了地貧基因檢測知情同意書。受測者抽取2 mL 外周血，在4℃環(huán)境下送至PCR 實驗室進行地貧基因檢測。臍帶血或胎兒絨毛組織直接提取DNA 進行基因診斷。本研究經(jīng)院醫(yī)學倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 試劑

所有標本采用廣東凱普生物化學有限公司的α 和β 地中海貧血基因檢測試劑盒（PCR+膜雜交法）檢測［7］。

1.2.2 標本制備

取受測者EDTA?K2 抗凝血100 μL，嚴格按照試劑盒說明書來提取樣本DNA。胎兒絨毛組織先經(jīng)過兩次生理鹽水沖洗，吸出沖洗液，去除母體細胞污染，加入PBS，5 000 rpm 離心半徑13.5 cm，離心3 min，以后步驟按常規(guī)方法進行DNA 提取。

1.2.3 陽江地區(qū)α/β 地貧的分子診斷

采用廣東凱普生物的地貧基因檢測試劑盒檢測3 種缺失型α 地貧（??SEA、?α4.2、?α3.7）、3 種突變型α 地貧（αWS、αCS、αQS）和17 種中國人最常見的β 地貧，分別為：?29（A>G），?28（A>G），?30（T>C），?31（?C），? 32（C>A），27?28（+C），CapM（?AAAC，A>C），Int（T>G），CD 14?15（+G），CD 17（A>T），βE（G>A），IVS?I?1（G>A，G>T），IVS?II?654（C>T），IVS?I?5（G>C），CD 41?42（?TTCT），CD 43（G>T），CD 71?72（+A）。引物及探針見報道［7］，所有實驗流程嚴格按照試劑說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有統(tǒng)計分析用Excel 2010 完成；計數(shù)資料以n（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 地貧基因類型總體分布

10 163 例檢測的樣本中，檢測出地貧基因突變4 538 例（44.65%）。其中α 地貧3 274 例（32.21%）和β 地貧1 077 例（10.60%），α 和β 復(fù)合地貧187例（1.84%）。

2.2 α 地貧基因突變類型及其構(gòu)成比

3 274 人是α?地中海貧血的攜帶者。檢出21種α 地貧基因突變類型，最常見為??SEA/αα（59.10%），其次是?α3.7/αα（20%）、?α4.2/αα（8%）、αWSα/αα（3.57%）、αCSα/αα（3.48%）、αQSα/αα（2.57%），以上6 種單基因型占α 地貧基因型的96.72%。α 地貧基因頻率分布見表1。雙重雜合子95 例（2.92%），常見為??SEA/?α3.7（1.43%），純合子12 例（0.36%）。

表1 α?地中海貧血突變譜［n（%）］Table 1 Spectrum of α?thalassemia mutations［n（%）］

2.3 β 地貧基因突變類型及其構(gòu)成比

1 077 例是β 地中海貧血的攜帶者，檢出15 種β 地貧基因類型，其中含雜合子12 種基因型，雙重雜合子2 例（2 種基因型），1 例純合子CD17/CD17。β 地貧基因突變類型最常見為CD41?42（41.87%），其 次是IVS?II?654（21.82%）、?28（16.80%）、CD17（8.36%）和CD71?72（3.99%），共占92.84%。β 地貧基因頻率分布見表2 。常規(guī)試劑盒檢測范圍內(nèi)的?31、?32、IVS?I?5、Int 和?30 未被檢出。

表2 β?地中海貧血突變譜［n（%）］Table 2 Spectrum of β?thalassemia mutations alone［n（%）］

2.4 α 地貧基因合并β 地貧基因突變類型及其構(gòu)成比

檢出187 例α 復(fù)合β 地貧，基因突變頻率最高為??SEA/αα/ CD41?42（48 例，25.67%），其次為?SEA/αα/?28（18 例，9.62%）、??SEA/αα/IVS?II?654（16 例，8.56%）、?α3.7/αα/CD41?42（12 例，6.42%）、?α3.7/αα/IVS?II?654（10 例，5.35%）。見表3。

表3 α?地貧合并β?地貧突變的基因型分布Table 3 The genotype distribution of α?thalassemia combined with β?thalassemia mutations

2.5 特殊基因突變類型

在標本中發(fā)現(xiàn)11 例有三種突變復(fù)合的基因類型，獲得7 例病人的血常規(guī)數(shù)據(jù)，其中6 例有??SEA基因突變。年齡10～52 歲，檢測血常規(guī)發(fā)現(xiàn)MCV都低于70 fl，血紅蛋白濃度大部分低于90 g/L，最低61 g/L，最高120 g/L，跨度很大。見表4。

表4 α?珠蛋白和β?珠蛋白三種突變的患者的紅細胞參數(shù)Table 4 Red blood cell parameters of triple mutations of α?globin and β?globin

3 討論

陽江地處廣東沿海經(jīng)濟帶西翼地區(qū)，屬于四級城市。本文研究陽江地區(qū)的地貧基因突變類型與以往檢測結(jié)果類似［8］，α 地貧和β 地貧人群常見基因突變類型與廣東地區(qū)一致［4?5］，但是基因攜帶率較高，這與實驗標本人群有關(guān)。標本來自婦幼保健院，因為做基因檢測的部分人群已經(jīng)進行過血常規(guī)篩查，所以陽性率大大提高。

地中海貧血是由于珠蛋白基因缺陷或者突變，導致珠蛋白肽鏈合成障礙所致的遺傳性溶血性疾病，可導致出生死亡或缺陷［9］。目前，地貧尚無有效的治療方法，只有通過控制地貧患兒的出生降低發(fā)病率，提高人口素質(zhì)，所以對婚前育齡人群地貧防治尤為重要［10］。

以往研究表明，廣西、廣東、海南地區(qū)β 地貧基因突變的都是CD41?42 為主，而福建最高頻率的變異位點是IVS?Ⅱ?654［11?14］。福建、廣西、廣東和海南這四個地區(qū)的β 地貧基因突變主要基因型是CD41?42、CD17、CD71?72 和IVS?Ⅱ?654［11?14］。各個地區(qū)既有相同點又有各自的特點［15］。有研究表明地貧基因突變類型與人群分布密切相關(guān)［7］，據(jù)歷史記載，廣東、廣西和福建等地部分人群都來自長江中下游地區(qū)人群遷徙［16］。

我國與其他地區(qū)的基因突變圖譜也有一定差異，中國人和東南亞人常見β 突變位點是CD41?42、CD17、IVS?Ⅱ?654、CD71/72、?28 和CD26；亞洲印 第安人為IVS?I?5、CD8?9、IVS?I?1、CD41?42、619?bp；黑人常見的β 珠蛋白突變?yōu)?29，?88、PolyA；地中海人為IVS?I?110、CD39、IVS?I?1、IVS?Ⅱ?745、IVS?I?6 和IVS?Ⅱ?1［9］。大量的研究表明，β 地貧基因突變及頻率分布具有明顯的種族特征及地域差異［17］，對β 地貧不同民族、不同地域的差異性的研究，對各高發(fā)群體和地區(qū)的優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義［18］。本研究病例中有11 例合并三種地貧基因突變，對7 例的血常規(guī)調(diào)查顯示，MCV 普遍偏低，血紅蛋白跨度很大，可以粗略看出合并三種基因突變類型的人群，基因表達異質(zhì)性大，病情因人而異。有一例28 歲年輕女性患者αWSα/?α3.7合并βCD41?42/βN 基因突變，血紅蛋白為120 g/L，沒有明顯貧血。地貧的發(fā)病機制是由于珠蛋白肽鏈合成出現(xiàn)障礙，造成肽鏈數(shù)量的不平衡而導致溶血性貧血［19］，越不平衡貧血越嚴重。該病人可能是珠蛋白α 鏈和β 鏈的表達達到相對平衡狀態(tài)，導致其血象沒有表現(xiàn)出貧血。

近年來，隨著人口流動和南北通婚增加，各地區(qū)人口結(jié)構(gòu)越來越復(fù)雜，地貧基因突變類型也越來越復(fù)雜。本研究對陽江地區(qū)地中海貧血基因突變類型進行分析，可以更好地為陽江地區(qū)地中海貧血的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢提供參考資料，對減少本地區(qū)重度地貧患兒的出生具有一定的意義。