EZH2 介導(dǎo)NLRP3 炎癥小體在高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中的作用及機制

代路 高世龍 周彥文 楊青霞 孟馥芬

糖尿病性心肌?。―iabetic Cardiomyopathy，DCM）是糖尿病常見的一種慢性并發(fā)癥［1］。心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)是高血糖引起心肌損傷重要的病理生理機制［2］，可介導(dǎo)糖尿病心臟的結(jié)構(gòu)和代謝變化［3］。Zeste基因增強子人類同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是一種表觀遺傳修飾物，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，在調(diào)控基因表達過程中至關(guān)重要［4］。功能失調(diào)的EZH2 與小鼠和人類多種癌癥類型的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并可通過抑制腫瘤內(nèi)抗原呈遞、免疫細(xì)胞遷移和增強CD4+T 調(diào)節(jié)細(xì)胞（Treg）抑制活性來促進免疫逃避。這些功能使EZH2 成為一個有吸引力的治療靶點。Nod 樣受體蛋白3（Nod?like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是一種多分子復(fù)合物，活化后促進細(xì)胞炎癥因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）?1β、IL?18 的成熟和釋放［5］，可加速心肌細(xì)胞凋亡［6］。本研究就EZH2 介導(dǎo)NLRP3 炎癥小體對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷進行分析，匯報如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

H9c2 大鼠心肌細(xì)胞系（CL?0089）購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗大鼠EZH2、兔抗大鼠Cleaved caspase?3和兔抗大鼠Bax（Cell Signaling Technology，5246s，9661s，2774s）；兔抗大鼠NLRP3 和兔抗大鼠ASC（Abcam，ab263899，ab180799）；兔抗大鼠caspase?1（Proteintech，22915?1?AP）；兔抗大鼠β?actin（Sino?Biological，100100?MM10）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（Bioss，bs?40295G?HRP）；lipo?fectamine 8000（碧云天，C0533）；SYBR Green PCR試劑盒（Qiagen，208054）；si?NC、si?EZH2、NLRP3過表達載體pcDNA?NLRP3 和空載體NLRP3?NC均購于吉瑪基因。7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國ABI，7500fast）。

1.3 實驗分組與方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

H9c2 心肌細(xì)胞用含10%FBS 和1%雙抗混合液的DMEM 培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 H9c2 心肌細(xì)胞損傷模型的建立

將接種于96 孔板的H9c2 心肌細(xì)胞隨機分為5 組，其中葡萄糖濃度依次為5.5、11、22、33、44 mmol/L 分別培養(yǎng)1、2、3、4 d 后檢測細(xì)胞活力。

1.3.3 實驗分組

將對數(shù)生長期H9c2 細(xì)胞接種于96 孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度為70%時，棄去培養(yǎng)基，更換為不含胎牛血清培養(yǎng)基，用5.5、33 mmol/L 葡萄糖干預(yù)48 h后，分別記為正常葡萄糖對照組（CON）、高糖損傷組（HG）；按照脂質(zhì)體法將si?NC、si?EZH2、NLRP3?NC 和NLRP3?OE 轉(zhuǎn)染至H9c2 細(xì)胞，然后用33 mmol/L 葡萄糖干預(yù)48 h 后，分別記為A 組、B 組、C 組、D 組、E 組、F 組。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

使用PBS 沖洗各組H9c2 細(xì)胞，結(jié)束后加400 μL 緩沖液制備成細(xì)胞懸液，先后依次加入10 μL Annexin V?FITC 和5 μL 7?AAD 試劑，混勻避光反應(yīng)30 min，加100 μL 緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 Western blot 檢測EZH2、NLRP3、ASC、cas?pase?1、Cleaved caspase?3、Bax 蛋白表達

收集各組心肌細(xì)胞加入RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，于-80℃下保存蛋白裂解物，BCA 法測定各組細(xì)胞蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉。兔抗大鼠EZH2（1∶1 000）、NLRP3（1∶800）、ASC（1∶800）、caspase?1（1∶500）、Cleaved caspse?3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、β?actin（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次后與結(jié)合HRP 二抗（1∶10 000）室溫下孵育1 h。ECL 顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光、顯影。Image J 軟件分析各組蛋白表達水平。

1.3.6 qRT?PCR 檢測IL?1β、IL?18的mRNA 表達

收集各組培養(yǎng)上清液，用Trizol 試劑抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，以cDNA 為模版，按照qRT?PCR 試劑盒說明配置PCR 反應(yīng)體系并設(shè)定程序。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2?ΔΔCt算法，計算IL?1β和IL?18的mRNA 表達水平。

1.3.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)制造商說明，使用lipofectamine 8000 分別將其轉(zhuǎn)染至H9c2 心肌細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，qRT?PCR 檢測EZH2和NLRP3的mRNA 表達水平以證實轉(zhuǎn)染成功。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用F分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率驗證

qRT?PCR 結(jié)果表明，與A 組比較，B 組1062 具有較好的沉默效果，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與C 組比較，D 組具有較好的過表達效果（P<0.05）。見圖1。

圖1 EZH2?siRNA 敲減效率和pcDNA?NLRP3 過表達效率驗證Figure 1 Verification of EZH2?siRNA knockdown efficiency and pcDNA?NLRP3 over?expression efficiency

2.2 高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)

qRT?PCR 結(jié)果顯 示，CON 組IL?1β、IL?18mRNA 表達分別為（0.92±0.13）、（1.02±0.25），低于HG 組的（1.82±0.32）、（2.10±0.26），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.240，9.469，P<0.05）。

2.3 EZH2 和NLRP3 炎癥小體在高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞中的蛋白表達

Western blot 結(jié)果顯示，CON 組EZH2、NLRP3、ASC、caspase?1 蛋白表達均低于HG 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 EZH2 和NLRP3 炎癥小體在高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞中的蛋白表達（）Table 1 Protein expression of EZH2 and NLRP3 inflammasome in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（）

表1 EZH2 和NLRP3 炎癥小體在高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞中的蛋白表達（）Table 1 Protein expression of EZH2 and NLRP3 inflammasome in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（）

2.4 抑制EZH2 可抑制高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞凋亡

Cleaved caspase?3、Bax 蛋白表達及凋亡率比較，HG 組>A 組>B 組>CON 組，HG 組與B 組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其余均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 抑制EZH2 對高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞Cleaved caspase?3、Bax 蛋白表達及凋亡率的影響（）Table 2 Effects of EZH2 inhibition on Cleaved caspase?3，Bax protein expression and apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（）

表2 抑制EZH2 對高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞Cleaved caspase?3、Bax 蛋白表達及凋亡率的影響（）Table 2 Effects of EZH2 inhibition on Cleaved caspase?3，Bax protein expression and apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（）

2.5 抑制EZH2 可抑制高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)

RT?PCR 結(jié)果顯示，IL?1β、IL?18表達量比較，CON 組，HG 組>A 組>組>CON 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 抑制EZH2 可抑制高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞IL?1β 和IL?18 的表達量（）Table 3 Inhibition of EZH2 inhibited the expression of IL?1β and IL?18 in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（）

表3 抑制EZH2 可抑制高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞IL?1β 和IL?18 的表達量（）Table 3 Inhibition of EZH2 inhibited the expression of IL?1β and IL?18 in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（）

2.6 抑制EZH2 對高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞NLRP3 炎癥小體蛋白表達的影響

Western blot 結(jié)果顯示，HG 組EZH2、NLRP3、ASC、caspase?1 蛋白表達均高于CON 組，B 組低于HG 組與A 組。見表4。

表4 抑制EZH2 對高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞NLRP3 炎癥小體蛋白表達的影響（）Table 4 Inhibitory effect of EZH2 on NLRP3 inflammasome protein expression in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（）

表4 抑制EZH2 對高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞NLRP3 炎癥小體蛋白表達的影響（）Table 4 Inhibitory effect of EZH2 on NLRP3 inflammasome protein expression in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（）

2.7 過表達NLRP3 對高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞損傷的影響

與C組比較，D組細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase?3、Bax 蛋白表達及IL?1β、IL?18mRNA 表達均升高（P<0.05）。見圖2、表5。

表5 過表達NLRP3 對高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞Cleaved caspase?3 和Bax 蛋白表達及凋亡率的影響（）Table 5 Effect of overexpression of NLRP3 on the protein expression of Cleared caspase?3 and Bax and apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（）

表5 過表達NLRP3 對高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞Cleaved caspase?3 和Bax 蛋白表達及凋亡率的影響（）Table 5 Effect of overexpression of NLRP3 on the protein expression of Cleared caspase?3 and Bax and apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（）

圖2 過表達NLRP3 對高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞Cleaved caspase?3 和Bax 蛋白表達及IL?1β、IL?18 mRNA 表達的影響Figure 2 Effect of overexpression of NLRP3 on the protein expression of Cleaved caspase?3 and Bax and the mRNA expression of IL?1β and IL?18 in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose

2.8 過表達NLRP3 對干擾EZH2 后高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞損傷的影響

與E 組比較，F(xiàn) 組凋亡率、Cleaved caspase?3、Bax 蛋白表達及IL?1β、IL?18mRNA 表達均升高（P<0.05）。見圖3、表6。

表6 過表達NLRP3 對干擾EZH2 后高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞Cleaved caspase?3 和Bax 蛋白表達及凋亡率的影響（）Table 6 Effect of overexpression of NLRP3 on the protein expression of cleared caspase?3 and Bax and apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose after interference with EZH2（）

表6 過表達NLRP3 對干擾EZH2 后高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞Cleaved caspase?3 和Bax 蛋白表達及凋亡率的影響（）Table 6 Effect of overexpression of NLRP3 on the protein expression of cleared caspase?3 and Bax and apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose after interference with EZH2（）

圖3 過表達NLRP3 對干擾EZH2 后高糖誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞Cleaved caspase?3 和Bax 蛋白表達及IL?1β、IL?18 mRNA 表達的影響Figure 3 Effect of overexpression of NLRP3 on the protein expression of Cleared caspase?3 and Bax and the mRNA expression of IL?1β and IL?18 in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose after interference with EZH2

3 討論

持續(xù)高血糖狀態(tài)會引起心肌細(xì)胞代謝紊亂、心臟自主神經(jīng)的病變等，進而引起心肌炎，因此高血糖是導(dǎo)致心肌炎癥的先決條件［7?8］。許多研究表明，在各種糖尿病小鼠模型中，組織細(xì)胞因子表達增加，進而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，提示炎癥在DCM 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［9］。本研究結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境下，H9c2 大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase?3、Bax 蛋白表達和IL?1β、IL?18mRNA 表達水平上調(diào)，提示高血糖可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡和炎癥反應(yīng)，這與以往的研究結(jié)果相一致。

據(jù)報道，染色質(zhì)中組蛋白的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄后修飾障礙與DCM 有關(guān)［10］，組蛋白甲基化是一種關(guān)鍵的翻譯后修飾，可以調(diào)節(jié)心血管疾病，包括心臟炎癥反應(yīng)［11］。EZH2 是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，通過其SET 結(jié)構(gòu)域催化組蛋白H3 賴氨酸27 的三甲基化修飾（H3K27me3），從而來保持下游靶基因的沉默狀態(tài)。在許多癌癥中，EZH2 高表達且促進癌癥發(fā)生和惡變。因此EZH2 成為抗癌藥物的理想靶點［12］。一項研究發(fā)現(xiàn)，沉默EZH2 可改善db/db 小鼠和HG 培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞的心臟功能和并防止心肌細(xì)胞凋亡［13］。一項研究表明，在大鼠和小鼠I 型糖尿病模型中，高糖通過EZH2 上調(diào)心肌成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白表達、心肌成纖維細(xì)胞分化、遷移和增殖，促進心肌纖維化［14］。這些研究結(jié)果表明，EZH2 與心臟炎癥有關(guān)，并參與了DCM 的病程進展。

本研究結(jié)果表明，高糖誘導(dǎo)后，H9c2 心肌細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體蛋白表達增加，提示高糖能激活NLRP3 炎癥小體，進而促進IL?1β 和IL?18 的表達和釋放。在H9c2 細(xì)胞的體外研究表明，NLRP3炎癥小體和IL?1βmRNA 表達增加遵循葡萄糖濃度依賴性模式，證實葡萄糖是NLRP3 炎癥小體的有效激活劑［15］，抑制H9c2 細(xì)胞中的NLRP3 表達，可使高糖狀態(tài)下caspase?1 和IL?1β 的蛋白表達減少，降低細(xì)胞死亡率。

本研究結(jié)果表明，高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞后，NLRP3 炎癥小體表達增加，siRNA 沉默EZH2 可降低NLRP3 炎癥小體蛋白表達，提示EZH2 可通過調(diào)節(jié)表觀遺傳修飾靶向調(diào)控NLRP3 炎癥小體。EZH2 能夠調(diào)控中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)整聯(lián)蛋白信號途徑和細(xì)胞黏附的動態(tài)變化。EZH2 缺失會損傷先天性粒細(xì)胞整聯(lián)蛋白依賴性的跨內(nèi)皮遷移，并且在多發(fā)性硬化動物模型中，EZH2 缺失會限制疾病進展。NLRP3 是介導(dǎo)動脈粥樣硬化與炎癥反應(yīng)的橋梁，EZH2 能夠?qū)ζ溥M行甲基化阻斷NLRP3 與相關(guān)蛋白的結(jié)合，進而促進黏附結(jié)構(gòu)的改變。靶向阻斷EZH2 與NLRP3 炎癥小體因子的相互作用，能夠消除NLRP3 炎癥小體對心肌細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)作用。進一步研究結(jié)果提示，siRNA沉默EZH2 的同時過表達NLRP3 蛋白可逆轉(zhuǎn)干擾EZH2 減輕高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，證實EZH2 通過調(diào)節(jié)表觀遺傳修飾促進NLRP3 炎癥小體表達，從而介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)心肌損傷的分子機制。

綜上所述，高糖環(huán)境下EZH2 通過調(diào)節(jié)表觀遺傳修飾激活NLRP3 炎癥小體，從而介導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)作用機制，為尋找臨床防治糖尿病心肌損傷提供新思路。