紫草素抑制PI3K/Akt/mTOR通路逆轉人胃癌細胞奧沙利鉑耐藥

張 欣 霍浩然 秦瑞峰 胡建奇 袁增江

奧沙利鉑是胃癌化療一線用藥,但胃癌細胞獲得性耐藥所致化療敏感度降低是導致治療失敗的重要原因[1]。因此,尋找高效低毒的奧沙利鉑耐藥逆轉劑對改善胃癌患者預后具有重要意義。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR)是調控細胞凋亡和自噬的關鍵信號通路,抑制PI3K/Akt/mTOR通路能夠逆轉肺腺癌順鉑耐藥、乳腺癌他莫昔芬耐藥、結腸癌氟尿嘧啶耐藥[2～4]。紫草素是紫草的主要活性成分,有研究發(fā)現(xiàn)紫草素通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路促進人結腸癌細胞、宮頸癌細胞等凋亡和自噬[5,6]。但紫草素能否通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路逆轉胃癌細胞奧沙利鉑耐藥尚鮮見報道,本研究以人胃癌奧沙利鉑耐藥細胞(MGC803/L-OHP)做為受試細胞,探討紫草素對人胃癌細胞奧沙利鉑耐藥的影響及其機制。

材料與方法

1.材料：(1)細胞：MGC803/L-OHP細胞購自中國科學院細胞庫(上海)。(2)藥物與試劑：紫草素(純度≥98%)購自中國藥品生物制品檢定所;奧沙利鉑購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;IGF-1(PI3K激活劑)購自美國Cell Signaling公司;CCK-8試劑盒、BCA 法蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司;GFP-LC3質粒、Lipofectamine 2000轉染試劑購自南京謹庭生物有限公司;Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國Invitrogen公司;p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、caspase-3、cleaved caspase-3抗體購自美國Cell Signaling公司;LC3、Beclin1、β-actin抗體購自英國Abcam公司。

2.細胞培養(yǎng)：MGC803/L-OHP細胞株經解凍復蘇后,接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基,置于細胞培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、飽和濕度)中培養(yǎng),隔天換液1次,細胞融合至80%～90%時按1∶4傳代培養(yǎng)。

3.CCK-8法檢測不同濃度紫草素對MGC803/L-OHP細胞增殖抑制率及半抑制濃度(IC50)：取對數(shù)生長期MGC803/L-OHP細胞,0.25%胰酶消化后制備單細胞懸液,1×104個/孔接種于96孔板,設0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L紫草素組,各10個復孔。常規(guī)培養(yǎng)24h后,各組分別更換含有相應濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,20微升/孔加入CCK-8試劑,避光孵育4h,通過酶標儀檢測450nm處吸光度值(A),增殖抑制率(%)=(A空白對照組-A藥物組)/A空白對照組×100%,計算IC50,重復3次實驗取平均值。計算IC50為9.58μmol/L,后續(xù)實驗紫草素濃度設定為10μmol/L。

4.分組與給藥：取對數(shù)生長期MGC803/L-OHP細胞,1×104個/孔接種于96孔板和1×105個/孔接種于6孔板,設空白對照組、奧沙利鉑(25μmol/L)組、紫草素+奧沙利鉑(10μmol/L+25μmol/L)組、紫草素+奧沙利鉑+IGF-1(10μmol/L+25μmol/L+10μmol/L)組[7,8]。培養(yǎng)24h后,各組分別更換含藥培養(yǎng)基(空白對照組更換無藥培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)24h。

5.CCK-8法檢測細胞增殖抑制率：每組隨機取10孔(96孔板)藥物干預24h后的MGC803/L-OHP細胞,通過CCK-8法檢測細胞增殖抑制率。重復3次實驗取平均值。

6.流式細胞術檢測細胞凋亡：每組隨機取10孔(6孔板)藥物干預24h后的MGC803/L-OHP細胞,不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞,按照試劑盒操作說明,5微升/孔加入Annexin V-FITC染液、5微升/孔加入PI染液混勻后,避光孵育15min,通過流式細胞儀檢測細胞凋亡狀況。重復3次實驗取平均值。

7.GFP-LC3質粒轉染后觀察自噬小體：取GFP-LC3質粒4μg加入RPMI1640培養(yǎng)基250μl,取Lipofectamine 2000轉染試劑10μl加入RPMI1640培養(yǎng)基250μl,然后將二者加在一起輕輕混勻。每組隨機取10孔(6孔板)藥物干預24h后的MGC803/L-OHP細胞,2毫升/孔更換新培養(yǎng)基,500微升/孔逐滴加入GFP-LC3質粒/Lipofectamine 2000轉染試劑混合液,輕輕混勻,避光培養(yǎng)5h,更換常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后,通過熒光顯微鏡觀察自噬小體形成狀況(綠色熒光點即為自噬小體)。重復3次實驗。

8.Western blot法檢測蛋白表達：每組隨機取10孔(6孔板)藥物干預24h后的MGC803/L-OHP細胞,消化后收集細胞,加入RIPA裂解液冰上靜置30min,4℃、12000r/min離心20min取上清,BCA法檢測蛋白濃度,10% SDS-PAGE電泳分離蛋白、轉PVDF膜、5%封閉液室溫封閉1h后,滴加稀釋后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、caspase-3、cleaved caspase-3、LC3、Beclin1、β-actin一體4℃孵育過夜,洗膜后滴加二抗室溫孵育1.5h,ECL顯影,以目標蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值做為目標蛋白相對表達量。重復3次實驗取平均值。

結 果

1.不同濃度紫草素對MGC803/L-OHP細胞增殖抑制率及IC50：紫草素0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L組細胞增殖抑制率分別為0、20.43%±2.37%、37.61%±4.08%、52.49%±6.17%、62.84%±7.36%、70.29%±7.55%。紫草素對MGC803/L-OHP細胞增殖抑制率呈劑量依賴性(P<0.05),IC50為9.58μmol/L,后續(xù)實驗紫草素濃度設定為10μmol/L(圖1)。

圖1 不同濃度紫草素對MGC803/L-OHP細胞增殖抑制率

2.紫草素對MGC803/L-OHP細胞增殖和凋亡的影響：與空白對照組比較,奧沙利鉑組細胞增殖抑制率和凋亡率升高(P<0.05);與奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑組細胞增殖抑制率和凋亡率升高(P<0.05);與紫草素+奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組細胞增殖抑制率和凋亡率降低(P<0.05,圖2、表1)。

表1 紫草素對MGC803/L-OHP細胞增殖抑制率和凋亡率的影響

圖2 紫草素對MGC803/L-OHP細胞凋亡的影響A.空白對照組;B.奧沙利鉑組;C.紫草素+奧沙利鉑組;D.紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組

3.紫草素對MGC803/L-OHP細胞自噬的影響：與空白對照組比較,奧沙利鉑組自噬小體數(shù)量增多;與奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑組自噬小體數(shù)量明顯增多;與紫草素+奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組自噬小體數(shù)量明顯減少(圖3)。

圖3 紫草素對MGC803/L-OHP細胞自噬的影響A.空白對照組;B.奧沙利鉑組;C.紫草素+奧沙利鉑組;D.紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組

4.紫草素對MGC803/L-OHP細胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達的影響：與空白對照組比較,奧沙利鉑組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達量下調(P<0.05);與奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達量下調(P<0.05);與紫草素+奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達量上調(P<0.05,圖4、表2)。

表2 紫草素對MGC803/L-OHP細胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達的影響

圖4 紫草素對MGC803/L-OHP細胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達的影響A.空白對照組;B.奧沙利鉑組;C.紫草素+奧沙利鉑組;D.紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組

5.紫草素對MGC803/L-OHP細胞caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表達的影響：與空白對照組比較,奧沙利鉑組caspase-3、cleaved caspase-3表達上調,cleaved caspase-3/caspase-3比值升高(P<0.05);與奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑組caspase-3、cleaved caspase-3表達上調,cleaved caspase-3/caspase-3比值升高(P<0.05);與紫草素+奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組caspase-3、cleaved caspase-3表達下調,cleaved caspase-3/caspase-3比值降低(P<0.05,圖5、表3)。

表3 紫草素對MGC803/L-OHP細胞caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表達及cleaved caspase-3/caspase-3比值的影響

圖5 紫草素對MGC803/L-OHP細胞caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表達的影響A.空白對照組;B.奧沙利鉑組;C.紫草素+奧沙利鉑組;D.紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組

6.紫草素對MGC803/L-OHP細胞LC3、Beclin1蛋白表達的影響：與空白對照組比較,奧沙利鉑組LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1表達上調,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.05);與奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑組LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1表達上調,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.05);與紫草素+奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1表達下調,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P<0.05,圖6、表4)。

表4 紫草素對MGC803/L-OHP細胞LC3、Beclin1蛋白表達及LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值的影響

圖6 紫草素對MGC803/L-OHP細胞LC3、Beclin1蛋白表達的影響A.空白對照組;B.奧沙利鉑組;C.紫草素+奧沙利鉑組;D.紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組

討 論

紫草素是中藥紫草的主要活性成分,具有抗炎、增強機體免疫力等藥理學作用[9,10]。近年來,紫草素抗腫瘤活性被發(fā)現(xiàn)并深入挖掘,已證實紫草素能夠逆轉人肺腺癌細胞、卵巢癌細胞順鉑耐藥[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn),紫草素對MGC803/L- OHP細胞具有劑量依賴性的增殖抑制作用;與奧沙利鉑單藥干預比較,紫草素+奧沙利鉑聯(lián)合能夠顯著提高MGC803/L-OHP細胞增殖抑制率,而紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組細胞增殖抑制率明顯低于紫草素+奧沙利鉑組。提示紫草素可逆轉人胃癌細胞奧沙利鉑耐藥,而該作用能夠被PI3K激活劑IGF-1明顯逆轉。

誘導細胞凋亡與自噬是鉑類藥物抗腫瘤的主要機制。caspase-3可被細胞色素C等誘導活化,cleaved caspase-3能夠切割細胞膜結構蛋白、核蛋白并破壞核酸、DNA等結構而導致細胞凋亡[13]。LC3是細胞自噬過程發(fā)生的標志性蛋白,具有兩種亞型(無活性LC3-Ⅰ,具有促細胞自噬活性的LC3-Ⅱ),生理狀態(tài)下LC3主要以LC3-Ⅰ亞型存在,自噬發(fā)生時LC3-Ⅰ被剪切活化生成LC3-Ⅱ,所以LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值能夠反映LC3蛋白活化程度及細胞自噬水平。Akt為PI3K下游靶基因,是細胞凋亡和自噬過程重要的信號轉導因子。PI3K活化形式p-PI3K能夠誘導Akt磷酸化,p-Akt則能夠誘導cleaved caspase-3磷酸化而失去促凋亡活性[14]。

p-Akt能夠誘導mTOR磷酸化,p-mTOR則能夠加速細胞周期運轉而促進細胞增殖、能夠抑制泛素蛋白表達而抑制細胞自噬[15]。Beclin1是LC3-Ⅱ轉運蛋白,轉移LC3-Ⅱ到自噬體膜發(fā)揮促細胞自噬作用,而p-mTOR能夠誘導Beclin1磷酸化失活而間接抑制細胞自噬[16]。本研究發(fā)現(xiàn),與奧沙利鉑單藥干預比較,紫草素+奧沙利鉑聯(lián)合能夠明顯提高MGC803/L-OHP細胞凋亡率和自噬小體數(shù)量,下調p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達,上調cleaved caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1表達,提高cleaved caspase-3/caspase-3、LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值;PI3K激活劑IGF1能夠明顯逆轉上述紫草素+奧沙利鉑聯(lián)合干預作用。提示促進細胞凋亡和自噬可能是紫草素逆轉人胃癌細胞奧沙利鉑耐藥的重要機制,可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路而上調凋亡和自噬相關蛋白表達有關。

綜上所述,紫草素可逆轉人胃癌細胞奧沙利鉑耐藥,其作用機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路而促進胃癌細胞凋亡和自噬有關。本研究結果為紫草素做為胃癌化療輔助用藥提供了實驗依據(jù),但其作用機制還需進一步研究。