單間作小麥響應(yīng)白粉病菌侵染的差異代謝物及代謝通路*

陳 升,吳鑫雨,何建楊,周 懂,劉振洋,湯 利,鄭 毅,2,肖靖秀**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 昆明 650201;2.云南開放大學(xué) 昆明 650233)

小麥(Triticum aestivumL.)是世界上重要的糧食作物。小麥白粉病(Blumeria graminisf.sp.tritici)是直接影響小麥減產(chǎn)的真菌性病害;在我國小麥種植區(qū),白粉病通常會造成10%～50%的產(chǎn)量損失[1-3]。氮(N)是植物重要的礦質(zhì)營養(yǎng)元素,直接影響小麥白粉病的發(fā)生及病害的嚴重程度[4-5]。前人從氮素調(diào)控群體結(jié)構(gòu)、改變植物生理生化過程等系統(tǒng)解析了氮介導(dǎo)小麥白粉病發(fā)生的機制[6-7]。當?shù)毓?yīng)過多時,小麥群體結(jié)構(gòu)增大、細胞壁木質(zhì)素合成減少、質(zhì)外體和葉表面的氨基酸及酰胺濃度增加、酚類物質(zhì)合成減少,植株抗病性下降、病菌侵染和繁衍增加[6]。氮素調(diào)控小麥抗性的分子和生理機制尚需深入研究。

代謝組學(xué)是研究植物應(yīng)對外界刺激反應(yīng)的一種方法[8],它可以通過對生物體的組織、細胞、甚至整個生物體的分析得到不同的代謝組學(xué)特征[9],可以作為有效的工具識別宿主對生物脅迫的生化反應(yīng)和病原體代謝途徑[10]。前人利用代謝組學(xué)方法從代謝物種類差異的角度揭示了小麥抗赤霉病[11]和條銹病[12]的分子機制。但目前利用代謝組學(xué)方法解析氮調(diào)控小麥白粉病抗性的生理代謝機制還鮮有報道。

間作在我國傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中均發(fā)揮著重要作用,能維持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性,控制作物病害的發(fā)生,是國內(nèi)外研究的熱點[13]。小麥蠶豆(Vicia fabaL.)間作是許多國家和地區(qū)廣泛采用的間作模式[14],具有增產(chǎn)、控病優(yōu)勢[15-16]。Luo 等[3]發(fā)現(xiàn)小麥蠶豆間作改變田間冠層小氣候,降低了小麥白粉病的發(fā)生,同時,小麥和蠶豆種間互作調(diào)控小麥植株體內(nèi)的氮含量及氮的累積、分配也是間作降低白粉病發(fā)生的機制之一[6,17]。顯然,間作調(diào)控小麥植株氮含量、累積及分配,必然導(dǎo)致相關(guān)代謝物的差異。但是,現(xiàn)有的研究尚鮮從間作調(diào)控小麥代謝物的角度分析間作降低小麥白粉病發(fā)生的機制;此外,小麥差異代謝產(chǎn)物-氮水平-小麥白粉病的關(guān)系也并不清楚。因此本文通過盆栽試驗,在小麥白粉病菌侵染的條件下,利用代謝組學(xué)分析不同氮水平下單作、間作小麥的差異代謝物,試圖解析不同氮水平下間作調(diào)控小麥-白粉病菌互作提高小麥抗白粉病生理代謝機制,研究可為深入理解多樣性種植降低小麥白粉病的發(fā)生提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和供試材料

試驗在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營養(yǎng)系實驗室內(nèi)進行,光照時間為12 h,避光時間為12 h,光照強度3000 lx。試驗期間溫度保持在18～21 ℃,濕度55%～70%。盆栽試驗供試土壤采自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山試驗農(nóng)場,為旱地紅壤,土壤基本理化性狀: 有機質(zhì)26.46 g·kg-1,全氮1.89 g·kg-1,堿解氮92 g·kg-1,速效磷16 g·kg-1,速效 鉀116 g·kg-1,pH 5.7。供試肥料為尿素(含N 46.0%)、普通過磷酸鈣(含P2O516.0%)和硫酸鉀(含K2O 50.0%)。

試驗供試小麥品種為易感小麥白粉病的‘揚麥15’,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;供試蠶豆品種為‘玉溪大粒豆’。試驗所用的小麥白粉病菌為混合型白粉病菌,來自四川廣泛流行的白粉病菌株,由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;在恒溫恒濕培養(yǎng)箱(溫度18 ℃,濕度60%)中連續(xù)種植小麥,在小麥三葉期進行菌種擴繁,供后續(xù)接種使用。

1.2 試驗設(shè)計與管理

試驗設(shè)計為雙因素設(shè)計,A 因素為種植模式: 小麥蠶豆間作(wheat-faba bean intercropping,IW),小麥單作(monocropped wheat,MW);B 因素為施氮水平:施氮量分別為75 mg·kg-1(N1)、150 mg·kg-1(N2)、225 mg·kg-1(N3)。共6 個處理,每個處理重復(fù)3 次。所有處理中,小麥和蠶豆的磷(P2O5) (過磷酸鈣,含P2O516.0%)、鉀(K2O)肥(硫酸鉀,含K2O 50.0%)施用量均為100 mg·kg-1。

盆栽試驗使用230 mm×130 mm 的塑料花盆。單作小麥每盆6 株,分2 行排列,行距10 cm,株距5 cm;小麥蠶豆間作中小麥、蠶豆各種1 行,行距10 cm,小麥株距5 cm,每盆3 株,蠶豆株距10 cm,每盆2 株。

盆栽試驗開始前挑選顆粒飽滿、大小均勻且無病蟲害的小麥、蠶豆種子避光催芽3 d。試驗前每盆稱1.5 kg 干土,倒入各處理稱好的肥料,拌勻后轉(zhuǎn)入試驗花盆中,之后將花盆隨機擺放在培養(yǎng)架上;每兩天澆一次水,每次每盆澆水200 mL。

1.3 病菌接種與病害調(diào)查

挑選恒溫恒濕培養(yǎng)箱中前期培養(yǎng)的長勢相同的感病小麥,取布滿白粉病病斑的葉片中段5 cm,每3株試驗小麥用一段感病葉片來摩擦接種。為保證分生孢子活性,剪一段接種一次,逐盆快速接種。

在白粉病接種的第3～10 天,根據(jù)《小麥白粉病測報調(diào)查規(guī)范》的8 級嚴重度分級標準[18],對小麥發(fā)生病害情況進行調(diào)查。根據(jù)病葉上病斑菌絲層覆蓋葉片面積占葉片總面積的比率分為8 級,分別對應(yīng)1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%和100%。計算公式如下:

1.4 小麥樣品采集

在小麥白粉菌接種72 h 時采集新鮮葉片,每個處理3 個生物學(xué)重復(fù),采集的葉片混勻后裝入凍存管中,立即存放在-80 ℃低溫冰箱中凍存,用于進一步的廣泛靶向代謝組測定。

1.5 樣品提取與分離

先將小麥葉片放置于凍干機(Scientz-100F)中真空冷凍干燥;利用研磨儀(MM 400,Retsch)研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末狀;稱取100 mg 的粉末,溶解于0.6 mL 70%甲醇提取液中;溶解后的小麥樣品于4 ℃冰箱過夜,期間渦旋6 次,提高提取率;離心(轉(zhuǎn)速10 000 g,10 min)后,吸取上清,用微孔濾膜(0.22 μm pore size)過濾樣品,并保存于進樣瓶中,用于UPLCMS/MS 分析。

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)(SHIMADZU Nexera X2,https://www.shimadzu.com.cn/)和串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry,MS/MS)(Applied Biosystems 4500 QTRAP,http://www.appliedbiosystems.com.cn/)。液相條件主要包括色譜柱: Agilent SB-C18 1.8 μm,2.1 mm×100 mm;流動相: A 相為超純水(加入0.1%的甲酸),B 相為乙腈(加入0.1%的甲酸);洗脫梯度: 0.00 min B 相比例為5%,9.00 min內(nèi)B 相比例線性增加到95%,并維持在95% 1 min,10.00～11.10 min,B 相比例降為5%,并以5%平衡至14 min;流速0.35 mL·min-1;柱溫40 ℃;進樣量4 μL。質(zhì)譜條件主要包括電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)溫度550 ℃,質(zhì)譜電壓5500 V (正模式)/-4500 V (負模式),簾氣(curtain gas,CUR) 25 psi,碰撞誘導(dǎo)電離(collision-activated dissociation,CAD)參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿(QQQ)中,每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential,DP)和碰撞能(collision energy,CE)進行掃描檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0 軟件比較單間作小麥在不同氮水平下白粉病菌侵染情況,進行獨立性T檢驗、兩因素方差分析,使用Origin 2021、Excel 2016 進行數(shù)據(jù)處理、繪圖。主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)用R 軟件的內(nèi)置統(tǒng)計pccomp 函數(shù),設(shè)置pccomp 函數(shù)參數(shù)scale=Ture,表示對數(shù)據(jù)進行unit variance sacling (UV)歸一化。OPLS-DA 在原始數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)換后進行中心化處理,然后利用R軟件中的MetaboAnalystR 包OPLSR.Anal 函數(shù)進行分析,繼而進行建模分析。差異代謝物篩選標準: 選取差異倍數(shù)值(fold change)≥2 和fold change≤0.5 的代謝物。代謝物在對照組和試驗組中差異為2 倍以上或0.5 以下,則認為差異顯著。通過KEGG Pathway 得到差異代謝物中重要的代謝通路。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異顯著代謝物的注釋結(jié)果進行分類和通路富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥蠶豆間作對小麥白粉病發(fā)病率和嚴重度的影響

在本試驗條件下,小麥白粉病菌接種3 d 后出現(xiàn)發(fā)病癥狀。由表1 可知,白粉病發(fā)病率和病情指數(shù)主要受氮水平和氮水平×種植模式的影響。由圖1可知,在發(fā)病初期(接種后3～4 d),單作、間作發(fā)病率和病情指數(shù)均無差異。隨著侵染時間的延長,單間作模式下小麥白粉病在N1、N2、N3 水平的發(fā)病率和病情指數(shù)均表現(xiàn)為上升趨勢。N1 水平下,在接種后的第5 天,間作顯著降低了白粉病發(fā)病率38.81%;N2 水平下,在病原菌接種第6 天,間作顯著降低發(fā)病率35.66%;N3 水平下,在病原菌接種后5～7 d,間作顯著降低發(fā)病率25.54%。同樣的,N1 和N2 水平下,在接種后第6～9 天,間作顯著降低白粉病病情指數(shù)21.97%和21.17%;N3 水平下,在接種后第5～6 天,間作顯著降低白粉病病情指數(shù)20.11%。綜合來看,低氮水平下間作對白粉病的控制較好。

圖1 與蠶豆間作和施氮水平對小麥白粉病發(fā)生的影響Fig.1 Effects of intercropping with faba bean and nitrogen application level on powdery mildew occurrence in wheat

表1 不同發(fā)病時期的氮水平、種植模式和氮水平×種植模式對小麥白粉病發(fā)病率和病情指數(shù)的影響Table 1 Effects of nitrogen level,planting pattern and nitrogen level × planting pattern on incidence and disease index of wheat powder mildew in different disease periods

2.2 單間作小麥差異代謝物的初步分析

PCA 是一種無監(jiān)督模式識別的多維數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法的多元統(tǒng)計分析,研究組間代謝物差異變化情況。對單作、間作小麥差異代謝物進行了主成分分析(圖2),N1、N2 和N3 水平下,單作和間作小麥樣品在主成分PC1 分離分別達44.42%、31.15%和41.57%,PC2 分別達22.29%、25.85%和 17.42%,PC1 和PC2 的模型分別解釋了總方差的66.71%、57.00%和58.99%,結(jié)果表明氮水平和單作、間作兩個處理之間明顯分離,達到了相對滿意的預(yù)測結(jié)果。

圖2 不同施氮水平下單間作小麥葉片代謝物主成分分析Fig.2 Principal component analysis of leaves metabolites of mono-and inter-cropped wheat at different nitrogen application levels

2.3 單間作小麥差異代謝物的OPLS-DA 分析

OPLS-DA 是一種有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析方法,過濾了不相關(guān)的正交信號,所獲得的差異代謝物更加可靠。R2X、R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預(yù)測能力[19]。對不同氮水平小麥單作、間作的葉片代謝物經(jīng)OPLSDA 得分分析(圖3A、B、C),可以看出氮水平和單作、間作存在得分差距,表明兩個處理間的代謝產(chǎn)物存在差異。N1 模型的評價參數(shù)R2X、R2Y和Q2分別為0.655、0.992 和0.728,N2 分別為0.543、0.997和0.767,N3 分別為0.583、1 和0.846。其中,Q2＞0.5表示模型擬合有效。本模型對數(shù)據(jù)進行200 次隨機排列組合試驗(圖3D、E、F),N1、N2 中Q2的P=0.11,N3 的P＜0.005;N1、N2 和N3 中 的R2Y均P＜0.005,表明本OPLS-DA 模型效果良好,可為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供支持。

圖3 不同施氮水平下單間作小麥葉片代謝物正交偏最小二乘法-判別分析得分圖(A、B、C)與置換模型檢驗圖(D、E、F)Fig.3 Orthogonal partial least squares method-discriminant analysis score maps (A,B,C) and displacement model test maps (D,E,F) of leaf metabolites in mono-and inter-cropped wheat at different nitrogen application levels

2.4 單間作小麥葉片差異代謝物篩選及分析

通過UPLC-MS/MS 檢測,病菌侵染的小麥葉片共檢測到822 種代謝產(chǎn)物(表2),分為11 大類: 黃酮、萜類、有機酸、生物堿、氨基酸及其衍生物、酚酸、木脂素和香豆素、脂質(zhì)、核苷酸及其衍生物、鞣質(zhì)以及其他類(維生素、糖及醇類等)。

表2 不同施氮水平下單間作小麥葉片差異代謝物分類Table 2 Classification of differential metabolites of leaves of mono-and inter-cropped wheat at different nitrogen application levels

從表2 可以看出,單作、間作小麥在低氮(N1)條件下共檢測到69 種顯著差異代謝物,其中上調(diào)的差異代謝物主要為生物堿(21 種)、氨基酸及其衍生物(14 種)、核苷酸及其衍生物(5 種)和有機酸(3 種)等,下調(diào)的差異代謝物主要為有機酸(5 種)、核苷酸及其衍生物(5 種)、酚酸(3 種)和脂質(zhì)(2 種)等。正常施氮(N2)條件下共檢測到52 種顯著差異代謝物,其中上調(diào)的差異代謝物主要為黃酮(5 種)、生物堿(3 種)、氨基酸及其衍生物(1 種)等,下調(diào)的差異代謝物主要為核苷酸及其衍生物(15 種)、酚酸(7 種)、有機酸(5 種)和氨基酸及其衍生物(5 種)等。高氮(N3)條件下共檢測到88 種顯著差異代謝物,其中上調(diào)的差異代謝物主要為氨基酸及其衍生物(11 種)、生物堿(10 種)、有機酸(5 種)等,下調(diào)的差異代謝物主要為酚酸(21 種)、生物堿(10 種)、黃酮(9 種)等。

不同施氮量下的共同差異代謝物也不同。在韋恩圖中(圖4),N1 和N2 共同的差異代謝物有11 個,N2 和N3 共同的差異代謝物有9 個,N1 和N3 共同的差異代謝物高達26 個。而它們共同擁有的差異代謝物是核苷酸及其衍生物中的核糖腺苷,它分別在N1 和N3 水平中表達顯著上調(diào),而在N2 水平顯著下調(diào)。單作、間作小麥的共同差異代謝物在N1和N3 水平中表現(xiàn)最多,在3 個氮水平下的共同差異代謝物只在N1 和N3 水平顯著上調(diào),因此推測單作、間作小麥在N1、N3 水平中共同的顯著差異代謝物與病害發(fā)生相關(guān)。

圖4 不同施氮水平下單間作小麥葉片差異代謝物Venn 圖Fig.4 Venn diagram of differential metabolites in mono-and inter-cropped wheat leaves at different nitrogen application levels

2.5 差異代謝物KEGG 分類和富集分析

差異代謝物在相互作用的過程中形成了多種通路。基于白粉病侵染條件下,對單作、間作小麥葉片中不同氮水平所鑒定的通路注釋并對結(jié)果分析,同時選取前20 種顯著通路繪制KEGG 富集圖。單作、間作小麥在低氮水平下,這些差異代謝物主要富集在代謝途徑(31 個)、次生代謝的生物合成(17 個)和氨基酸的生物合成(15 個),其中代謝途徑和氨基酸的生物合成顯著富集(P＜0.05) (圖5A)。在正常施氮水平下(圖5B),差異代謝物主要富集在代謝途徑(25 個)、次生代謝的生物合成(8 個)和嘌呤嘧啶(8 個),其中代謝途徑顯著富集(P＜0.05)。在高氮水平下(圖5C),差異代謝物主要富集在代謝途徑(34 個)、次生代謝物的生物合成(24 個)和氨基酸的生物合成(13 個),其中次生代謝物的生物合成和氨基酸的生物合成顯著富集(P＜0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)低氮和高氮兩個水平在氨基酸的生物合成代謝通路都顯著富集,推測此代謝通路與小麥白粉病的發(fā)生有關(guān)。

圖5 單間作小麥在不同施氮水平的差異代謝物KEGG 分類和富集圖Fig.5 KEGG classification and enrichment of differential metabolites in mono-and inter-cropped wheat at different nitrogen application levels

2.6 單間作小麥葉片差異代謝物層次聚類分析

對上調(diào)、下調(diào)差異倍數(shù)前10 的代謝物篩選出來并制作熱圖進行分析(圖6)。其中間作在低氮條件下(圖6A)上調(diào)了氨基酸及其衍生物(谷胱甘肽還原型、L-色氨酸、L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺)、生物堿(N-阿魏酰五羥色胺、3-吲哚丙烯酸、甲氧基吲哚乙酸和3-吲哚乙腈)、有機酸(3-脲基丙酸)、黃酮(芹菜素-7,4′-二甲醚),下調(diào)了核苷酸及其衍生物(肌苷、8-羥基鳥苷和3′-腺嘌呤核苷酸)、有機酸(2-丙基蘋果酸、2-異丙基蘋果酸和3-異丙基蘋果酸)、酚酸(香草乙酮和丁香醛)、氨基酸及其衍生物(L-鳥氨酸)、生物堿(薏苡素)。

圖6 單間作小麥在不同施氮水平的差異代謝物的層次聚類圖Fig.6 Hierarchical cluster diagrams of differential metabolites of mono-and inter-cropped wheat at different nitrogen application levels

間作在正常施氮條件(圖6B)上調(diào)生物堿(2-羥基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3(2H)-酮葡萄糖苷、對香豆?；泛瓦胚?、黃酮[槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-(4′′-O-葡萄糖基)鼠李糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖苷]、氨基酸及其衍生物(谷胱甘肽還原型)、萜類(海松酸)、脂質(zhì)(3-羥基十八烷酸)、其他(蕓香糖),下調(diào)了酚酸(阿魏酸、對甲氧基苯丙酸、肉桂酸、芥子酸和香草乙酮)、核苷酸及其衍生物(2′-脫氧鳥苷、8-羥基鳥苷和胸苷)、生物堿(薏苡素)、木質(zhì)素和香豆素(5,7,8-三羥基-6-甲氧基香豆素)。

間作在高氮條件(圖6C)上調(diào)了氨基酸及其衍生物(L-天冬酰胺、L-高甲硫氨酸和L-色氨酸)、生物堿(3-吲哚乙腈、N-阿魏酰五羥色胺和甲氧基吲哚乙酸)、有機酸(3-脲基丙酸和十六烷基二酸)、酚酸(1-O-阿魏酰-3-O-對香豆酰甘油)、萜類(海松酸),下調(diào)了酚酸(對甲氧基苯丙酸、1-O-阿魏?？鼘幩?、3-O-阿魏?？鼘幩?、綠原酸、新綠原酸和5-O-阿魏?？崴?、生物堿(吲哚、對香豆?；泛蚇-葡萄糖基對香豆酰腐胺)、木質(zhì)素和香豆素(東莨菪內(nèi)酯-7-O-葡萄糖醛酸苷)。

3 討論

本試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果[2]一致,小麥蠶豆間作可以顯著降低小麥白粉病的發(fā)病率和病情指數(shù),說明小麥蠶豆間作能夠有效防治小麥白粉病。在田間條件下,小麥蠶豆間作降低了白粉病不同發(fā)病階段的發(fā)病率,有效抑制了白粉病的侵染[11]。但是本試驗條件下,由于人工接種，病原菌侵染壓力較大,因此病害侵染初期(接種后0～5 d)和末期(接種后10 d)并未發(fā)現(xiàn)間作降低發(fā)病率和病情指數(shù)(圖1)。

本試驗條件在白粉病菌侵染下,單作、間作小麥葉片檢測到多種差異代謝物,主要包括氨基酸及其衍生物、生物堿、黃酮、有機酸和酚酸等物質(zhì)(表2)。本研究發(fā)現(xiàn),雖然單作、間作小麥響應(yīng)白粉病菌侵染的差異代謝物受氮水平調(diào)控,但是在低氮(N1)和高氮(N3)條件下,間作主要調(diào)控了氨基酸的生物合成。其中N1、N3 水平下,間作主要上調(diào)了谷胱甘肽還原型、L-色氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺和L-高甲硫氨酸等氨基酸及其衍生物,在N2 水平下,間作僅上調(diào)了谷胱甘肽還原型。谷胱甘肽是植物代謝組中的關(guān)鍵抗氧化劑之一,它還有利于將硒轉(zhuǎn)化為還原硒,是與氨基酸結(jié)合的一種化學(xué)形式[20]。色氨酸在一定程度上具有對生物活性和抗病、蟲害反應(yīng)的作用[21]。而苯丙氨酸是苯丙烷生物合成的底物,在苯丙氨酸解氨酶的催化作用下經(jīng)過特定的途徑轉(zhuǎn)化為具有苯丙烷骨架特征的次生代謝產(chǎn)物[22]。苯丙烷類化合物在植物受到病原菌侵染時,能夠提高植物的抗性[23-24]。說明間作種植可能通過調(diào)節(jié)作物特定氨基酸的生物合成或代謝過程來提高作物自身抗性。

氨基酸是較容易受到環(huán)境壓力影響的代謝物,它們參與多種代謝途徑和許多次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),這些次級代謝產(chǎn)物參與防御、信號和結(jié)構(gòu)過程[25]。因此氨基酸在植物抗病性中的作用受到廣泛關(guān)注。小麥接種條紋花葉病毒后,葉片中苯丙氨酸減少,脯氨酸、精氨酸和異亮氨酸增加[26]。表明病原菌侵染植物后,氨基酸代謝會發(fā)生改變。本試驗條件下,并未比較接種前后代謝產(chǎn)物的差異,因此尚不能確定單作、間作小麥在代謝產(chǎn)物方面響應(yīng)病原菌侵染的差異。

本研究發(fā)現(xiàn)病原菌侵染后,作為次生代謝物的生物堿在低氮水平下間作顯著上調(diào)了N-阿魏酰五羥色胺、3-吲哚乙腈、3-吲哚丙烯酸和甲氧基吲哚乙酸,但是隨著施氮量的增加,生物堿上調(diào)和下調(diào)數(shù)量一致(表2),且在高氮條件下次生代謝物的生物合成也有顯著富集,說明間作調(diào)控生物堿應(yīng)答病原菌的侵染與施氮量密切相關(guān)。有研究表明,生物堿類物質(zhì)具有一定抗菌活性作用[27-28]。本研究中五羥色胺的衍生物N-阿魏酰五羥色胺隨著施氮量的增加也有不同差異倍數(shù)的變化,推測其與白粉病菌侵染有關(guān)。

黃酮類(芹菜素-7,4’-二甲醚)、黃酮醇(槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖苷)也均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。有研究表明黃酮類等代謝物質(zhì)在植物體內(nèi)也具有一定的抗菌、抗氧化等功能,對病原體的入侵具有一定的抵御效果,可以增強病原體的防御[29]。其中色氨酸、脯氨酸等氨基酸代謝的中間產(chǎn)物也參與了類黃酮、木質(zhì)素等抗病相關(guān)物質(zhì)的合成[30]。

其他的一些次生代謝物如萜類、酚酸類等物質(zhì)對病原物也有直接抑菌的活性和信號傳導(dǎo)的作用,能誘導(dǎo)植物表現(xiàn)抗病性從而阻止病原體入侵的作用[31-32]。高氮會減少馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)葉片中綠原酸的濃度,降低馬鈴薯對病原菌的抗性[33]。高氮還會減少棉花(Gossypium hirsutumL.)葉片中萜類醛的分泌,從而受到病原菌侵染[34]。在低氮情況下,番荔枝[Annona emarginata(Schltdl.) H.Rainer]中與防御有關(guān)的揮發(fā)物質(zhì)(如單萜和倍半萜)合成增加,使植物抗病性增強[35]。本試驗中正常施氮和高氮下萜類(海松酸)均有不同程度上調(diào),而酚酸類隨著施氮水平的增加下調(diào)的數(shù)量不斷增多,高氮水平下常見的酚酸如阿魏酸、綠原酸和新綠原酸均出現(xiàn)明顯下調(diào)。由此推斷在小麥白粉病發(fā)生侵染后誘導(dǎo)了相關(guān)抗病代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,幫助植物在防御途徑中做出貢獻。

4 結(jié)論

人工接種小麥白粉病菌條件下,小麥蠶豆間作主要降低了侵染后期(接種后5 d)白粉病的發(fā)病率和病情指數(shù)。病原菌侵染后,單作、間作小麥葉片差異代謝物受氮水平調(diào)控,其中氮脅迫條件下(N1和N3)差異代謝物均高于正常氮水平(N2)。與單作相比,間作小麥葉片黃酮、生物堿、氨基酸及其衍生物和酚酸等多種代謝產(chǎn)物發(fā)生改變。在氮脅迫下,N1 水平間作上調(diào)了谷胱甘肽還原型、L-色氨酸、L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺,N3 水平間作上調(diào)了L-天冬酰胺、L-高甲硫氨酸和L-色氨酸。推測這些代謝產(chǎn)物,尤其是氨基酸及其衍生物可能參與調(diào)控抵御白粉病病菌的侵染。本研究利用代謝組學(xué)揭示了單作、間作小麥應(yīng)答白粉病病菌侵染的生理代謝差異,為深入理解單作和間作小麥應(yīng)對病害發(fā)生的代謝差異提供了理論依據(jù)和支撐。