接菌劑對水稻秸稈和白菜尾菜混合堆肥進程及細菌多樣性的影響

郭鵬博，溫雪，張方政，張偉，徐一鳴，洪艷華，馬金柱，魏丹，王偉東

（1.黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農業(yè)廢棄物資源化利用重點實驗室/黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163319；2 農業(yè)農村部東北平原農業(yè)綠色低碳重點實驗室；3 大慶油田水務公司水務環(huán)保研究院；4 北京市農林科學院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所）

秸稈由于含有大量的木質纖維素類成分，因此在單一物料堆肥處理過程中降解速率緩慢。宋春麗等[1]研究發(fā)現，尾菜和秸稈等固體廢棄物混合堆肥能夠適當調節(jié)堆肥的初始含水率、碳氮比，一定程度上促進堆肥啟動，提高堆肥品質。在白菜尾菜的好氧堆肥過程中，添加農作物秸稈等富含木質纖維類物質能夠在完全腐熟后得到更為優(yōu)質的堆肥產品[2]。在秸稈堆肥過程中，接種木質纖維素降解菌系可以促進堆肥過程快速啟動，使堆肥達到更好的發(fā)酵效果[3]。龔建英等[4]通過接種微生物菌劑的方式對白菜尾菜和秸稈的混合堆肥進行處理，證明接種外源微生物能夠顯著提升物料的腐熟程度。水稻秸稈和雞糞混合堆肥中添加外源氨氧化細菌可以促進堆肥快速啟動，提升堆肥物料中的細菌群落多樣性，進而促進形成腐殖質的形成[5]。實驗室前期從堆肥體系中篩選、構建了秸稈分解菌劑能提高木質纖維素類物質的分解效率[6]。

關于接種外源真菌、細菌菌劑對堆肥進程影響的研究已有報道，關于寒區(qū)水稻秸稈與尾菜混合堆肥發(fā)酵、提高堆肥處理效率和堆肥質量微生物機制研究還有待深入。研究以自主研發(fā)的木質纖維素分解菌系為接菌劑，研究接菌劑對水稻秸稈和和白菜尾菜混合堆肥發(fā)酵的效果，明確秸稈分解菌劑對堆肥化過程中理化參數、腐熟度、細菌多樣性的影響。本研究為水稻秸稈和白菜尾菜堆肥化處理提供理論依據，對實現水稻秸稈和白菜尾菜的無害化和資源化利用有指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗所使用水稻秸稈取自黑龍江八一農墾大學農學試驗基地，白菜尾菜收集于黑龍江八一農墾大學一食堂。水稻秸稈（經自然風干5～7 d）、白菜尾菜使用秸稈粉碎機（Xinhang，China）粉碎至3～5 cm 小段備用。秸稈分解菌劑為作者實驗室自主制作，核心為木質纖維素快速分解復合菌系，菌系相關特性見文獻[6]。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

實驗分為試驗組和對照組，試驗組（T1）∶水稻秸稈和白菜尾菜按7∶3 的質量比混合，按堆肥體積的5%添加秸稈分解菌劑。對照組（CK）∶水稻秸稈和白菜尾菜按7∶3 的質量比混合，按堆肥體積的5%添加121 ℃高溫高壓滅活的秸稈分解菌劑。水稻秸稈和白菜尾菜充分混合后調節(jié)含水率至60%～65%，堆體為初始高1.2 m，直徑2.2 m 的圓堆，起始體積為1.52 m3，試驗共持續(xù)42 d。堆肥高溫期每隔3 d 進行一次人工翻堆，堆肥降溫期每隔7 d 進行一次人工翻堆。

分別取兩種堆肥處理的初始物料以及在第3、7、14、21、28、35、42 天進行取樣，取樣方法選用多點混合法取樣[7]，取回的樣品分為兩部分，一部分風干用于理化參數分析，另一部分液氮速凍后于-80 ℃超低溫保存箱中保存，用于分子生物學分析。

1.2.2 理化參數的測定

在堆肥試驗期間，每天13：00 時測定堆體中心溫度及堆肥試驗周邊環(huán)境溫度，測量儀器為筆式溫度計（MITIR，China）。將新鮮樣品置于105 ℃的電熱鼓風干燥箱（Boxun，China）中烘干8 h，利用失重法測定樣品含水率[8]。pH 采用pH 檢測器（Horiba，Japan）進行測定[9]。有機質含量采用重鉻酸鉀容量法進行測定[8]。全氮含量測定利用凱氏定氮法，采用凱氏定氮儀（Hanon，China）對堆肥原料全氮含量進行測定[8]。全鉀含量利用火焰光度法，采用火焰光度計（Yidian，China）進行測定[8]。利用燃燒氧化-非分散紅外法，采用元素分析儀（Analytikjena，Germany）對堆肥物料總有機碳含量進行測定[9]。種子發(fā)芽指數采用籽粒發(fā)芽法進行測定[10]。木質纖維素含量采用纖維素測定儀（Velp，Italy），并利用Van Soest 方法確定木質素、纖維素和半纖維素的含量[11]。

1.2.3 細菌多樣性分析

高通量測序的樣品選取試驗組和對照組處理的初始物料，高溫期，降溫期及腐熟期物料，即第0、7、28、42 天的樣品，分別命名為A0、A7、A28、A42 和C0、C7、C28、C42。

總DNA 提取采用改良的氯苯法[12]，細菌引物采用515F Modified，806R Modified，進行PCR 擴增。將純化好的樣品送至北京百邁客生物科技有限公司利用Illumina Miseq PE250 平臺進行細菌多樣性分析。

表1 引物及其序列Table 1 Primers and their sequences

1.2.4 數據分析

采用Origin 2018 軟件對樣品的理化參數進行分析。使用Trimmomatic、Cutadapt（version 1.9.1）、FLASH（version 1.2.11）等軟件得到高質量的序列用于生物信息學分析。使用IBM SPSS Statistics 26 分析實驗結果的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 堆肥過程中理化參數的變化

2.1.1 堆肥過程中溫度的變化

如圖1 所示，試驗組和對照組溫度隨時間變化趨勢一致，在堆肥試驗第1 天，試驗組與對照組均進入高溫期（≥50 ℃）。試驗組堆肥第4 天溫度達到最高，為70.2 ℃，高溫期共持續(xù)21 d。對照組堆肥第3天的溫度達到最高，為65.6 ℃，高溫期共持續(xù)15 d。隨后堆體溫度隨環(huán)境溫度變化逐漸降低，最終與環(huán)境溫度趨于一致，堆肥過程中試驗組溫度顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖1 堆肥過程中溫度的變化Fig.1 Temperature change during composting

2.1.2 堆肥過程中pH 的變化

如表2 所示，在堆肥過程中試驗組和對照組pH均呈現先降低后升高的趨勢。兩組堆肥的pH 變化均在堿性范圍內且變化幅度較小，始終維持在7.4～8.5之間。

表2 堆肥過程中pH、有機質、總有機碳、全氮、全鉀的變化Table 2 Changes of pH，organic matter，total organic carbon，total nitrogen and total potassium in composting process

2.1.3 堆肥過程中有機質的變化

如表2 所示，兩組堆肥物料中的有機質含量在前期快速下降，在21 d 之后逐漸穩(wěn)定。堆肥初始物料的有機質含量為60.1%，試驗結束時，試驗組有機質含量下降至37.5%，對照組有機質含量下降至44.3%，試驗組的有機質含量變化較快，且總量顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.1.4 堆肥過程中總有機碳的變化

如表2 所示，堆肥過程中物料總有機碳含量在前期迅速下降并趨于穩(wěn)定，試驗組總有機碳含量顯著低于對照組（P＜0.05）。兩組堆肥在試驗初期總有機碳含量均為277.7 g·kg-1，試驗組總有機碳含量在21 d時趨于穩(wěn)定，下降至227.0 g·kg-1；對照組的總有機碳含量在28 d 時趨于穩(wěn)定，下降至230.2 g·kg-1。

2.1.5 堆肥過程中全氮的變化

如表2 所示，堆肥過程中全氮含量變化逐漸升高最終趨于穩(wěn)定。兩組堆肥初始物料中全氮含量均為0.95%，在堆肥結束時，試驗組的全氮含量為1.39%，對照組的全氮含量為1.31%。

2.1.6 堆肥過程中全鉀的變化

如表2 所示，堆肥過程中全鉀含量呈現逐漸升高的趨勢。堆肥初始物料的全鉀含量為1.09%，在堆肥結束時，試驗組的全鉀含量為2.15%，對照組的全鉀含量為1.99%。

2.1.7 堆肥過程中木質素、纖維素、半纖維素的變化

堆肥過程中物料木質素、纖維素、半纖維素含量的變化如表3 所示。三者均呈現先降低最后趨于穩(wěn)定的趨勢。在試驗組中，堆肥初始物料的纖維素、半纖維素、木質素含量分別為48.28%、14.30%、16.57%，堆肥結束時分別下降至31.62%、11.08%、10.95%。對照組堆肥初始物料的纖維素、半纖維素、木質素的含量為47.85%，14.00%，16.57%，在堆肥結束時分別下降至36.43%、11.71%、12.20%。堆肥結束時試驗組中纖維素、木質素、半纖維素的降解率顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.2 堆肥過程中腐熟度的變化

2.2.1 堆肥過程中碳氮比的變化

如表4 所示，堆肥過程中碳氮比的變化呈現逐漸降低最終趨于穩(wěn)定的趨勢，堆肥過程中試驗組的碳氮比顯著低于對照組（P＜0.05）。在試驗中，兩組堆肥的初始的碳氮比均為29.16，在堆肥結束時試驗組碳氮比為15.79，對照組的碳氮比為17.03，對照組和試驗組的碳氮比均呈現逐漸降低的趨勢。

表4 堆肥過程中碳氮比、種子發(fā)芽指數（GI）的變化Table 4 Changes of C/N ratio and seed germination index（GI）during composting

2.2.2 堆肥過程中種子發(fā)芽指數的變化

如表4 所示，對照組和試驗組的種子發(fā)芽指數均呈現逐步升高的趨勢，兩組堆肥初始物料的種子發(fā)芽指數均為41.9%，在堆肥末期，試驗組堆肥物料的種子發(fā)芽指數為81.2%。對照組的種子發(fā)芽指數最終上升至73.2%，試驗組腐熟情況更好。

2.3 堆肥過程中的細菌多樣性的變化

2.3.1 細菌門的組成和相對豐度

從細菌門水平豐度和組成情況來看，如圖2 所示，在添加秸稈分解菌劑的試驗組中，相對豐度大于1%的門分類水平菌有8 個，主要為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）等，其相對豐度之和在所有堆肥樣品中超過95%。其中變形菌門豐度最高，在試驗組中各時期的豐度分別為A0 （56.27%）、A7 （36.83%）、A28（31.42%）和A42（30.28%）。門分類水平上試驗組和對照組的菌群組成相同，但各菌門的相對豐度及其在各時期具有顯著差異（P＜0.05）。如圖3 所示，在對照組細菌門水平上，變形菌門同樣是相對豐度最高的優(yōu)勢菌門且同樣呈現逐漸降低的趨勢，由初始物料中的73.40%，堆肥結束時顯著降低至36.72%（P＜0.05）。放線菌門相對豐度先逐漸升高最終趨于穩(wěn)定，在高溫期和腐熟期分別為15.02%（P＜0.05），21.17%（P＜0.05）。厚壁菌門的相對豐度隨著堆肥試驗的進行逐漸降低，在降溫期和腐熟期分別為6.47%（P＜0.05）、3.29%（P＜0.05）。

圖2 堆肥樣品（T1）中細菌門水平豐度圖Fig.2 The abundance chart at bacteria phylum level in compost samples（T1）

圖3 堆肥樣品（CK）中細菌門水平豐度圖Fig.3 The abundance chart at bacteria phylum level in compost samples（CK）

厚壁菌門為秸稈分解菌劑的優(yōu)勢細菌門，試驗組與對照組相比，在堆肥的各個時期厚壁菌門豐富度明顯較高，尤其在高溫期與降溫期。在高溫期，試驗組與對照組厚壁菌門的豐富度分別為19.07%和10.03%，在降溫期分別為19.75%和6.47%，試驗組降溫期的豐富度高于高溫期。

2.3.2 細菌屬的組成和相對豐度

在細菌屬水平上，對照組和試驗組各個時期的菌屬組成和相對豐度均有顯著差異（P＜0.05）。在試驗組中，如圖4 所示，相對豐度大于1%的屬分類水平菌有8 個，主要為假單胞菌屬（Pseudomonas）、血桿菌屬（Sanguibacter）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）等。在試驗組堆肥原料中，相對豐度較高的菌屬分別為假單胞菌屬、叢毛單胞菌屬、血桿菌屬，進入高溫期后，纖維桿菌屬（Fibrobacter）、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）、Gemmatirosa的相對豐度較高。進入降溫期后，噬氫菌屬、Gemmatirosa、Demequina為主要的優(yōu)勢菌屬，腐熟期的主要優(yōu)勢菌屬為噬氫菌屬、纖維弧菌屬（Cellvibrio）和Demequina。

圖4 堆肥樣品（T1）中細菌屬水平豐度圖Fig.4 The abundance chart at bacteria genus level in compost samples（T1）

如圖5 所示，對照組的細菌屬水平上，相對豐度大于1%的主要優(yōu)勢細菌屬有11 個，主要分為假單胞菌屬（Pseudomonas）、高溫雙岐菌屬（Thermobifida）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）等。在堆肥原料中的優(yōu)勢菌屬分別為不動桿菌屬（Acinetobacter）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。進入高溫期后，假黃單胞桿菌屬、螯合球菌屬（Chelatococcus）、Gemmatirosa的相對豐度均顯著升高（P＜0.05），成為高溫期的優(yōu)勢菌屬。在降溫期，Tagaea、高溫雙岐菌屬、熱多孢菌屬（Thermopolyspora）成為主要的優(yōu)勢細菌屬，高溫雙岐菌屬和Gemmatirosa是堆肥腐熟期的主要優(yōu)勢細菌屬。

圖5 堆肥樣品（CK）中細菌屬水平豐度圖Fig.5 The abundance chart at bacteria genus level in compost samples（CK）

2.4 細菌群落結構Alpha 多樣性

2.4.1 細菌多樣性指數

選取Simpson、Chao1、ACE 和Shannon 四個指數來分析堆肥過程中各個時期細菌的Alpha 多樣性的變化。在97%相似度水平下，各樣品Alpha 多樣性指數值統(tǒng)計如表5 所示。在細菌類群上，試驗組在高溫期、降溫期優(yōu)勢細菌屬的多樣性和豐富度顯著高于對照組（P＜0.05）。在試驗組中，高溫期和降溫期樣品中的豐富度和多樣性最高。在對照組中，腐熟期的細菌豐富度最高，但在各時期無顯著性變化（P＞0.05）。降溫期和腐熟期的細菌多樣性顯著高于原料和高溫期（P＞0.05）。在試驗組中，細菌的Chao1 和ACE、Simpson 和Shannon 指數總體上均呈現先升高后降低的趨勢。在對照組中，細菌的Chao1 和ACE 指數未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）。Simpson、Shannon 指數先降低后升高最終趨于穩(wěn)定。

表5 堆肥樣品中細菌類群分類Table 5 Classification of bacterial groups in compost samples

2.5 細菌群落結構Beta 多樣性

如圖6（A、B）所示，在細菌群落結構上，原料和高溫期的樣本各自聚類，距離較遠，降溫期和腐熟期距離較近。說明堆肥原料和高溫期樣品細菌的群落結構與其他時期相比差異較大，而降溫期和腐熟期樣品細菌的群落結構較為接近。

圖6 堆肥樣品的PCA 主成分分析。細菌的PCA 主成分分析（A：試驗組，B：對照組）Fig.6 Principal component analysis of compost samples.Principal component analysis of bacteria（A：T1，B：CK）

3 討論

3.1 接菌劑對堆肥過程中理化參數的影響

溫度是堆肥過程中的重要參數，是直觀表達堆肥物料腐熟度和腐熟速率的指標。試驗中，對照組及試驗組高溫期均超過了15 d，且最高溫度均超過65 ℃。接種秸稈分解菌劑的試驗組堆體溫度升高更快，同時高溫期持續(xù)時間更長，證明秸稈分解菌劑可以促進堆肥過程啟動，延長高溫發(fā)酵時間，從而促進堆肥物料腐熟。堆肥前期，由于物料含水率較高，易降解的有機物被堆體內的微生物大量分解[13]，產生大量有機酸使pH 不斷降低，在堆肥高溫期微生物生長代謝活性增強，有機酸被分解和形成腐殖質[14]，同時含氮化合物分解產成NH3，由于NH3的積累導致pH 不斷升高。研究中，試驗組的有機質含量、總有機碳含量相比對照組變化較快，且總量顯著低于對照組（P＜0.05），表明接入秸稈分解菌劑增強了易降解有機物、總有機碳的細菌活性，導致試驗組中物料的有機質、總有機碳分解更加充分。研究中添加秸稈分解菌劑同樣提升堆肥物料中的全氮、全鉀含量，但是對全氮的提升效果并不顯著，可能是堆肥過程中產生的高溫導致全氮以氨氣的形式大量揮發(fā)[15]。研究中，試驗組的纖維素、木質素、半纖維素含量較對照組下降明顯，其中纖維素的下降最為明顯，證明秸稈分解菌劑可以有效分解堆肥物料中的木質纖維素的含量，且該菌劑中以分解纖維素的功能細菌為主。

3.2 接菌劑對堆肥過程中腐熟度的影響

碳氮比是指有機物中碳的總含量與氮的總含量的比值，是評價堆肥是否腐熟和穩(wěn)定的重要參考指標，理論上堆體的碳氮比在15 左右時物料已完全腐熟[16]。堆肥結束時，試驗組的碳氮比表明其堆體已經達到較好的腐熟效果，與對照組相比，試驗組的碳氮比表明接種秸稈分解菌劑可以促進堆體的腐熟。種子發(fā)芽指數同樣是衡量堆體物料腐熟的一項重要指標，當種子發(fā)芽指數大于80%后，證明堆體已達到完全腐熟[17]。試驗中試驗組的種子發(fā)芽指數已超過80%，原因為接種秸稈分解菌劑能夠促進有機物分解為部分種子發(fā)芽所需的營養(yǎng)物質。

3.3 接菌劑對堆肥過程中細菌多樣性的影響

與對照組相比，試驗組中各個時期豐度均相對較高的細菌門為厚壁菌門，在高溫期與降溫期尤為明顯。厚壁菌門是一類能在高溫環(huán)境下存活的菌群[18]，添加的秸稈分解菌劑在微生物分類門水平上99%以上為厚壁菌門，證明接種的秸稈分解菌劑可以在堆肥的各個時期存活，進而發(fā)揮作用。與對照組相比，試驗組中的假單胞菌屬，纖維桿菌屬，Demequina的含量相對較高。假單胞菌屬對淀粉多糖類有機物具有較強分解能力，在堆肥前期大量出現[19]，但可能由于其不耐高溫的原因，因此在高溫期后豐度逐漸降低。纖維桿菌屬在自然界中大量存在于在反芻動物的瘤胃中，在其細胞周質中有纖維素酶，具有分解纖維素的能力，試驗組前期纖維桿菌屬豐度較低，但隨著時間推移其豐度逐漸升高，可能由于秸稈分解菌劑中具有的纖維桿菌隨著時間的推移逐漸利用堆體內的營養(yǎng)元素從而大量增殖，進而發(fā)揮其分解纖維素的作用。

堆肥過程中細菌群落多樣性越高，可能越有助于物料的分解。整個堆肥過程中試驗組細菌群落的多樣性始終高于對照組，且有機物的分解效率更高，原因為試驗組中添加秸稈分解菌劑導致的，秸稈分解菌劑可以對堆體內細菌豐富度和多樣性帶來提升。

4 結論

添加秸稈分解菌劑能夠促進水稻秸稈和白菜尾菜混合堆肥快速啟動，延長堆肥過程中高溫期時間，顯著提高堆肥物料的養(yǎng)分含量，并促使物料達到完全腐熟。同時添加秸稈分解菌劑可以顯著提升堆體高溫期和降溫期細菌的多樣性和豐富度，提升了堆肥的最終品質。實驗為生物法處理農業(yè)及糧食產業(yè)廢棄物提供了理論依據及技術支持。