AECOPD合并肺炎患者外周血CD16+/56+NK細(xì)胞及IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)水平及意義分析

于書嫻 張威 劉汶睿 周建剛 高麗娜 李宗廣 俞軍

慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)與肺炎常相伴出現(xiàn),鑒于患者挪動(dòng)困難、配合度差,胸部影像診斷應(yīng)用局限,有必要尋找敏感指標(biāo)早期預(yù)測(cè)肺炎發(fā)生[1-2]。CD16+/56+自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞是抵御外來微生物侵襲的非特異性免疫細(xì)胞[3];白介素-12p70(Interleukin-12p70,IL-12p70)是細(xì)菌感染免疫中起重要作用的細(xì)胞因子[4],白介素-10(Interleukin-10,IL-10)可經(jīng)多途徑發(fā)揮抗炎作用,介導(dǎo)COPD氣道炎癥[5],干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、白介素-4(Interleukin-4,IL-4)與Th1、Th2細(xì)胞激活有關(guān),可介導(dǎo)氣道炎癥[6]。上述免疫細(xì)胞、炎癥因子可相互作用,參與肺炎進(jìn)程。本研究探究外周血CD16+/56+NK細(xì)胞及IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ在AECOPD合并肺炎患者中的表達(dá)及意義,旨在為AECOPD合并肺炎早期診療提供依據(jù)。

資料與方法

一、 一般資料

選取2019年2月～2022年2月收治的AECOPD患者為研究對(duì)象,進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2021年修訂版)》[7]中AECOPD診斷標(biāo)準(zhǔn);肺炎診斷及病情嚴(yán)重程度評(píng)估參考《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)》[8]。(2)入組前1個(gè)月內(nèi)無抗生素、糖皮質(zhì)激素類藥物、免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用。(3)精神、意識(shí)尚可,可配合完成相關(guān)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入院時(shí)已明確其它系統(tǒng)急慢性感染。(2)醫(yī)院獲得性感染者。(3)惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。(4)合并獲得性免疫缺陷綜合征、自身免疫疾病者。(5)長(zhǎng)期免疫抑制劑使用或藥物濫用史。本研究所有患者知情同意,且經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核(審批號(hào):20230116-k085)。共274例AECOPD患者納入研究,其中男175例,女99例;年齡42～99歲,平均(76.57±10.27)歲,根據(jù)是否確診肺炎,分為單純AECOPD組89例、AECOPD合并肺炎組185例,AECOPD合并肺炎組根據(jù)肺炎嚴(yán)重程度,分為重癥組85例、非重癥組100例。單純AECOPD組與AECOPD合并肺炎組兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、COPD病程、吸煙史、飲酒史等一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但AECOPD合并肺炎組患者入院時(shí)肺功能分級(jí)[慢性阻塞性肺疾病全球倡議(Global initiative for chronic obstructive lung disease,GOLD)分級(jí)[9]3級(jí)、4級(jí)占比顯著高于單純AECOPD組(P<0.05)(見表1)。

二、方法

實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè),入院當(dāng)天采用EDTA抗凝管采集患者外周靜脈血1 mL,搖勻后靜置,BD trucount 絕對(duì)計(jì)數(shù)管取100 μL血樣本,加入20 μLTB/NK試劑(美國BD公司),充分混勻后,于暗處、室溫下孵育15 min,加入1 mL 濃度1X的BD FACS溶血素(美國BD公司),振蕩混勻,于暗處、室溫下孵育15 min,離心后棄上清液,加PBS緩沖液重懸,采用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)TB/NK細(xì)胞亞群,以CD16、CD56鼠抗人單克隆抗體標(biāo)記NK細(xì)胞,記錄CD16+/56+NK細(xì)胞百分比。另采集外周靜脈血2 mL,30 min內(nèi)經(jīng)3000 rpm離心10 min,分離血清于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?采用全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(美國Bio Tek公司),以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ水平,試劑盒均購自蘇州市躍亞生物技術(shù)有限公司,操作步驟嚴(yán)格遵試劑盒說明書。

表1 兩組患者一般資料比較

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以描述符合正態(tài)分布計(jì)量資料,兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);以中位數(shù)(四分位間距)M(P25,P75)表示非正態(tài)分布計(jì)量資料,比較行Mann-WhitneyU檢驗(yàn);用n(%)表示計(jì)數(shù)數(shù)據(jù),比較行χ2檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析法;預(yù)測(cè)價(jià)值通過受試者工作特征(receiver operator characteristic curve,ROC)曲線下面積(area under curve,AUC)評(píng)估;行雙側(cè)假設(shè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

一、單純AECOPD組與AECOPD合并肺炎組患者外周血CD16+/56+NK細(xì)胞、IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)比較

AECOPD合并肺炎組患者血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ水平均顯著高于單純AECOPD組(P<0.05),但兩組患者外周血CD16+/56+NK細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

二、 不同肺炎程度患者外周血CD16+/56+NK細(xì)胞、IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)比較

重癥組患者血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ水平均顯著高于非重癥組(P<0.05),但兩組患者外周血CD16+/56+NK細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

三、外周血CD16+/56+NK細(xì)胞、IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)分析顯示,AECOPD患者血清IL-12p70與IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05),但患者外周血CD16+/56+NK細(xì)胞與血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)均無顯著相關(guān)性(P>0.05)(見表4)。

四、血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)對(duì)AECOPD合并肺炎預(yù)測(cè)價(jià)值分析

以合并肺炎為狀態(tài)變量,以血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ為檢驗(yàn)變量,ROC曲線顯示,血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ及四者聯(lián)合預(yù)測(cè)AECOPD合并肺炎的AUC分別為0.677、0.778、0.618、0.717、0.789(見圖1、表5)。

五、 血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)對(duì)AECOPD合并肺炎嚴(yán)重程度預(yù)測(cè)價(jià)值分析

以合并重癥肺炎為狀態(tài)變量,以血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ為檢驗(yàn)變量,ROC曲線顯示,血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ及四者聯(lián)合預(yù)測(cè)AECOPD合并重癥肺炎的AUC分別為0.600、0.682、0.611、0.598、0.687(見圖2、表6)。

表2 單純AECOPD組與AECOPD合并肺炎組患者外周血CD16+/56+NK細(xì)胞、IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)比較[M(P25,P75)]

表3 不同肺炎程度患者外周血CD16+/56+NK細(xì)胞、IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)比較[M(P25,P75)]

表4 外周血CD16+/56+NK細(xì)胞、IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)相關(guān)性分析(r)

表5 血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)對(duì)AECOPD合并肺炎預(yù)測(cè)價(jià)值分析

表6 血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)對(duì)AECOPD合并肺炎嚴(yán)重程度預(yù)測(cè)價(jià)值分析

圖1 血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ預(yù)測(cè)AECOPD合并肺炎的ROC曲線

討 論

AECOPD合并肺炎時(shí),患者病情進(jìn)一步加重,使得臨床治療更為棘手,早期識(shí)別肺炎是關(guān)鍵[10]。本研究中AECOPD合并肺炎患者GOLD分級(jí)3級(jí)、4級(jí)占比更高,說明AECOPD患者合并肺炎時(shí)肺功能更差,這主要因?yàn)榉窝装l(fā)生時(shí)可促進(jìn)肺組織大量炎性物質(zhì)釋放、黏性分泌物聚集,加重氣道損傷和阻塞情況[11],故肺功能進(jìn)一步下降。

圖2 血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ預(yù)測(cè)重癥肺炎的ROC曲線

NK細(xì)胞是固有免疫中主要細(xì)胞,因NK細(xì)胞表面CD16、CD56表達(dá)陽性率分別可達(dá)90%、95%左右,而CD3往往不表達(dá),故一般將CD16+/56+淋巴細(xì)胞視為NK細(xì)胞[12]。吳凱等[13]研究指出,AECOPD發(fā)生時(shí),CD16+/56+NK細(xì)胞可代償性升高以抵御外來病原微生物侵襲。也有研究認(rèn)為,COPD患者NK細(xì)胞毒性功能有缺陷,AECOPD發(fā)生時(shí)NK細(xì)胞明顯降低,其介導(dǎo)的細(xì)胞免疫能力下降[14]。本研究結(jié)果顯示,外周血CD16+/56+NK細(xì)胞水平與AECOPD患者是否合并肺炎及肺炎嚴(yán)重程度均無關(guān),提示其檢測(cè)可能無法預(yù)測(cè)患者AECOPD合并肺炎與否以及肺炎嚴(yán)重程度,可能因?yàn)楸狙芯炕颊叨酁槔夏耆?本身存在外周血NK細(xì)胞活性下降、免疫機(jī)能減退情況,在AECOPD急性發(fā)作或合并肺部感染時(shí),外周血CD16+/56+NK細(xì)胞可能存在一定代償性增加,但幅度有限,故最終檢測(cè)結(jié)果并無明顯變化。

IL-12p70是IL-12活性單位,主要由B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞表達(dá),可促進(jìn)Th1細(xì)胞分化、成熟,誘導(dǎo)T細(xì)胞、NK細(xì)胞分泌IFN-γ,從而促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞形成、增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性[15]。研究指出[16],肺炎球菌可激活樹突狀細(xì)胞大量表達(dá)IL-12p70,這與肺炎球菌肺炎發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。本研究顯示,AECOPD合并肺炎患者血清IL-12p70表達(dá)升高,且合并重癥肺炎患者更高,提示IL-12p70可參與肺炎發(fā)生、惡化,這可能與感染病原體激活抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)IL-12p70有關(guān)。

IL-10主要由Treg細(xì)胞分泌,可抑制單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等活性,減少促炎因子釋放,阻止炎癥細(xì)胞活化、遷移、黏附等過程,在機(jī)體抗炎反應(yīng)中發(fā)揮作用[17]。AECOPD患者氣道炎癥反應(yīng)加劇,可誘導(dǎo)促炎因子大量表達(dá),與此同時(shí),為降低氣道高反應(yīng)性、維持炎癥反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡,以IL-10為代表的抗炎因子分泌也反饋性升高,因此檢測(cè)IL-10表達(dá)可間接反映炎癥反應(yīng)程度[18]。本研究顯示,AECOPD合并肺炎患者血清IL-10升高,且合并重癥肺炎患者更高,表明IL-10與肺炎的發(fā)生、惡化有關(guān),推測(cè)與機(jī)體炎癥反應(yīng)增強(qiáng)、IL-10代償性升高有關(guān)。既往也有研究顯示[19],重癥肺炎患者血清IL-10表達(dá)較普通肺炎升高,且與免疫功能呈負(fù)相關(guān)。

IL-4為Th2細(xì)胞代表因子,可激活B細(xì)胞釋放IgE、IgG1,介導(dǎo)氣道高反應(yīng)性;還能促進(jìn)杯狀細(xì)胞增生、黏液糖蛋白釋放及粘液分泌,介導(dǎo)成纖維細(xì)胞激活、趨化,與氣道炎癥和重構(gòu)關(guān)系密切[20]。IFN-γ為Th1細(xì)胞代表因子,可激活單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞、促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放,直接參與氣道炎癥;還能通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9釋放,參與肺組織細(xì)胞外基質(zhì)降解等,與肺氣腫發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)[21]。已有研究顯示[22-23],AECOPD患者血清IL-4、IFN-γ表達(dá)均較穩(wěn)定期COPD及健康人群明顯升高,二者均參與COPD炎癥反應(yīng)進(jìn)程。本研究中,AECOPD合并肺炎患者血清IL-4、IFN-γ表達(dá)均升高,且合并重癥肺炎患者更高,說明IL-4、IFN-γ表達(dá)參與肺炎的發(fā)生與進(jìn)程,這可能與患者肺部感染發(fā)生后,機(jī)體促炎、抗炎反應(yīng)均激活,呈現(xiàn)出免疫失衡、混亂狀態(tài)有關(guān)。方堃等[24]報(bào)道也發(fā)現(xiàn),重癥肺炎患者血清IL-4、IFN-γ較健康對(duì)照組均明顯升高。

本研究還發(fā)現(xiàn),AECOPD患者血清IL-12p70與IL-10、IL-4、IFN-γ表達(dá)呈正相關(guān),提示這些指標(biāo)存在內(nèi)在聯(lián)系,可能在AECOPD合并肺炎發(fā)生、進(jìn)展中起協(xié)同作用,但相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。此外,本研究發(fā)現(xiàn),血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ對(duì)AECOPD合并肺炎均有一定預(yù)測(cè)價(jià)值,其中以IL-10、IFN-γ預(yù)測(cè)價(jià)值較高(AUC均>0.7),且四項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)價(jià)值更高,提示上述指標(biāo)可作為AECOPD合并肺炎的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。不過上述指標(biāo)對(duì)肺炎嚴(yán)重程度預(yù)測(cè)敏感度、準(zhǔn)確性并不高,因此臨床評(píng)估AECOPD肺炎程度時(shí)還應(yīng)結(jié)合其他癥狀、體征綜合分析。由于肺部感染病原微生物不同,治療方案也不同,所以血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ是否對(duì)患者合并細(xì)菌性感染、病毒性感染存在鑒別診斷價(jià)值尚不得而知;此外,上述指標(biāo)是否可作為患者短期預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)也有待進(jìn)一步探究。

綜上所述,血清IL-12p70、IL-10、IL-4、IFN-γ在AECOPD合并肺炎患者中表達(dá)較單純AECOPD患者均明顯升高,且在合并重癥肺炎中表達(dá)更高,其中IL-10、IFN-γ對(duì)合并肺炎預(yù)測(cè)價(jià)值較高,可作為AECOPD合并肺炎的早期預(yù)測(cè)指標(biāo),但外周血CD16+/56+NK細(xì)胞表達(dá)與AECOPD合并肺炎與否及肺炎嚴(yán)重程度無明顯關(guān)系。