支氣管肺泡灌洗液宏基因組二代測序在非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染中的診治價(jià)值

周群 費(fèi)黎明 尤青海

當(dāng)前,非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染呈上升趨勢[1],且因其臨床表現(xiàn)無特異性,很難實(shí)現(xiàn)及時(shí)診治[2]。因此,認(rèn)識(shí)該菌感染的特點(diǎn)和多樣性,評(píng)估易感群體,早期進(jìn)行有效干預(yù)極為重要。迄今,確診肺曲霉感染的方法仍依賴于病理,但耗時(shí)較長[3]。傳統(tǒng)病原學(xué)方法費(fèi)時(shí)且檢出率低。基于高通量測序的宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)因其快速循環(huán)和高敏感性被認(rèn)為是有前景的微生物鑒別技術(shù)[4]。前期關(guān)于mNGS的研究多集中在發(fā)現(xiàn)病原體上[5]。有研究闡明,在診斷肺部真菌感染方面,mNGS較傳統(tǒng)檢測技術(shù)有更高的敏感性[6-7],但仍缺乏真菌感染的臨床經(jīng)驗(yàn),尤其在曲霉感染方面。據(jù)此,該文針對(duì)真菌感染領(lǐng)域進(jìn)行了回顧性研究,探索支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)的mNGS在非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染中的診斷效能及對(duì)臨床治療的指導(dǎo)價(jià)值。

資料與方法

一、臨床資料

收集2021年11月至2022年12月入住安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(含內(nèi)科ICU病區(qū))32例非中性粒細(xì)胞減少患者的臨床資料,其BALF的mNGS示真菌。兩位資深臨床醫(yī)師根據(jù)宿主因素、臨床特征、胸部CT、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及治療反應(yīng)評(píng)估是否為肺曲霉感染,最終17例被評(píng)估為肺曲霉感染,15例為非肺曲霉感染。以下為排除標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡<18歲;(2)中性粒細(xì)胞減少(中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)<1.5×109/L);(3)未做BALF的mNGS;(4)病歷資料不完整。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批件號(hào):PJ2023-02-42)。

二、研究方法

1 標(biāo)本收集

BALF標(biāo)本由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科專業(yè)的氣管鏡醫(yī)師采集。利多卡因局麻后,根據(jù)胸部CT選擇取樣位置,20mL生理鹽水灌入目標(biāo)段支氣管,重復(fù)3次,利用負(fù)壓回收BALF入無菌痰液收集器。為避免污染,樣本的前20mL被舍棄,剩余標(biāo)本送檢mNGS、傳統(tǒng)病原學(xué)(革蘭染色、抗酸染色、普通細(xì)菌培養(yǎng)+藥敏、真菌培養(yǎng)等)及半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)試驗(yàn)。

2 mNGS檢測

收集的BALF標(biāo)本委托予果生物科技有限公司進(jìn)行mNGS檢測。具體程序包括提取樣本核酸、構(gòu)建文庫、對(duì)樣本微生物進(jìn)行核酸測序、分析比對(duì)數(shù)據(jù)、報(bào)告可疑致病微生物。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、臨床資料特征

回顧性分析32例非中性粒細(xì)胞減少的患者,17例納入肺曲霉感染組,15例歸為非肺曲霉感染組。兩組的性別、年齡和基本臨床資料構(gòu)成相似。臨床表現(xiàn)方面,肺曲霉感染組呼吸音異常16例(94.1%),咳嗽12例(70.6%),胸悶/呼吸困難12例(70.6%),但較非肺曲霉感染組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。咯血/痰血多見于肺曲霉感染組,兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。肺曲霉感染組12例(70.6%)患者存在營養(yǎng)不良,居潛在疾病首位。肺曲霉感染組患者免疫低下情況較非肺曲霉感染組發(fā)生率高,且在全身應(yīng)用皮質(zhì)類固醇激素方面明顯高于非肺曲霉感染組(P<0.05)。肺曲霉感染組胸部CT表現(xiàn)上17例(100.0%)均為多發(fā)病變,14例(82.4%)表現(xiàn)為雙肺浸潤,13例(76.5%)可見斑片狀陰影。而曲霉感染較特異的新月征和暈征在兩組CT表現(xiàn)中均未顯現(xiàn)。兩組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

二、 mNGS與傳統(tǒng)病原學(xué)方法陽性率的比較

32例非中性粒細(xì)胞減少患者中,mNGS檢出32例(100.0%),傳統(tǒng)病原學(xué)方法檢出16例(50.0%),mNGS的陽性率明顯高于傳統(tǒng)病原學(xué)方法(P<0.001)。無論肺曲霉感染組還是非肺曲霉感染組,mNGS的陽性率均較傳統(tǒng)病原學(xué)方法明顯增高(P<0.05)(見表2)。

聚焦肺曲霉感染組BALF的mNGS、培養(yǎng)和GM試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)三組間有明顯差異(P<0.001)。mNGS組的陽性率均明顯高于培養(yǎng)組及GM試驗(yàn)組(P均<0.001),而培養(yǎng)組和GM試驗(yàn)組比較無明顯差異(P>0.05)(見表3)。

三、非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染組病原體分布

混合感染在非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染組較常見。(圖1)描述了肺曲霉感染組BALF的mNGS中共病原種類分布。該方法對(duì)共病原的鑒定效果令人滿意(94.1%),其中曲霉-細(xì)菌-其他真菌-病毒混合感染最多見(23.5%)。共病原中最常見的細(xì)菌是銅綠假單胞菌,真菌占首位的是白色念珠菌,最多見的病毒是人類皰疹病毒1型和人巨細(xì)胞病毒(圖2),提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)肺曲霉感染患者混合感染的防治。

圖1 肺曲霉感染組BALF的mNGS中共病原種類分布(n=17)

圖2 肺曲霉感染組BALF的mNGS中共病原分布(n=17)

四、BALF的mNGS對(duì)非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染抗菌治療的指導(dǎo)作用

(表4)顯示了17例非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染患者的抗菌治療記錄。根據(jù)mNGS結(jié)果,88.2%的患者改變了抗菌治療方案,52.9%的患者調(diào)整了抗菌譜,76.5%的患者開始使用抗曲霉菌藥物。需注意11.8%的患者治療方案無變化,因其前期已經(jīng)驗(yàn)性抗曲霉治療。這其中跟蹤了2例非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染患者抗曲霉治療前后mNGS中曲霉序列數(shù)的動(dòng)態(tài)改變。1例抗曲霉治療1周及2周后復(fù)查mNGS未見曲霉菌,但患者癥狀未消失,炎癥指標(biāo)仍高,結(jié)合臨床繼續(xù)抗曲霉治療。另1例患者抗曲霉治療半月后mNGS未見曲霉菌,但患者癥狀未改善且炎癥指標(biāo)及GM試驗(yàn)均高,故繼續(xù)抗曲霉治療。1月后復(fù)查再現(xiàn)曲霉菌,但其序列數(shù)顯著降低,炎癥指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn),GM試驗(yàn)正常,綜合考慮繼續(xù)予抗曲霉治療10天后停藥。

表1 患者的臨床特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及影像特征

表2 mNGS和傳統(tǒng)病原學(xué)方法陽性率比較[n(%)]

表3 肺曲霉感染組BALF的mNGS、培養(yǎng)和GM試驗(yàn)陽性率比較[n(%)]

表4 mNGS對(duì)非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染抗菌治療的指導(dǎo)作用[n(%)]

討 論

肺曲霉感染常發(fā)生于中性粒細(xì)胞減少等免疫缺陷宿主,但在非中性粒細(xì)胞減少的重癥患者中[8],肺曲霉感染比例攀升,因缺乏特異性臨床表現(xiàn)及早期精準(zhǔn)的診斷手段,其病死率竟高于中性粒細(xì)胞減少患者[9]。迄今為止,用于肺曲霉感染的微生物學(xué)分析包括真菌涂片和培養(yǎng)、GM試驗(yàn)、PCR、曲霉菌屬特異性免疫層析側(cè)流裝置試驗(yàn)。其中GM試驗(yàn)建議送檢BALF標(biāo)本,其陽性高度傾向肺曲霉感染,陰性也有重要的排除價(jià)值[10],而血清GM試驗(yàn)診斷效能偏低[11]。近期研究顯示,一種可溶性的識(shí)別受體正五聚蛋白3的多態(tài)性和曲霉的易感性呈正相關(guān)[12]。然而,這些檢測對(duì)肺曲霉感染的恰當(dāng)初始治療和改善預(yù)后的指導(dǎo)作用有限。mNGS是一種新的微生物診斷方法,其微生物學(xué)適應(yīng)證包括臨床懷疑新發(fā)病原體或特殊病原體感染;傳統(tǒng)病原學(xué)方法檢測出的病原體不能完全解釋臨床表現(xiàn),疑似合并存在其它病原體感染;臨床懷疑感染,但傳統(tǒng)病原學(xué)方法未能檢測出病原體,經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療療效欠佳;傳統(tǒng)病原學(xué)方法發(fā)現(xiàn)病原體,但臨床表現(xiàn)高度懷疑該病原體出現(xiàn)特殊的毒力表型。同時(shí)mNGS可通過發(fā)現(xiàn)菌種特異性的耐藥基因解決部分耐藥問題[13]。mNGS對(duì)曲霉菌有較高的診斷價(jià)值。目前關(guān)于mNGS與肺曲霉菌的研究甚少[14-16]。這些研究中,Chen等人[14]和Zhang等人[15]報(bào)道了mNGS在診斷曲霉菌和耶氏肺孢子菌共同感染中的應(yīng)用,Zhang等人[15]和He等人[16]報(bào)道肺曲霉感染患者存在皮質(zhì)類固醇治療的皮肌炎、COPD和哮喘等合并癥,這與我們的結(jié)果是一致的。

本研究回顧性評(píng)價(jià)了BALF的mNGS在非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染中的診斷效能。比對(duì)臨床資料發(fā)現(xiàn),與非肺曲霉感染組相比,咯血/痰血更多見于肺曲霉感染組,這與曲霉菌易侵犯血管引起出血或滲血有關(guān),部分病人可出現(xiàn)大咯血窒息,故對(duì)有咯血或痰血的曲霉患者需提高警惕。肺曲霉感染組患者在全身應(yīng)用皮質(zhì)類固醇類藥物方面明顯多于非肺曲霉感染組,說明曲霉易感染免疫狀態(tài)較差的患者,故對(duì)應(yīng)用激素、免疫抑制劑或合并慢性病的患者需加強(qiáng)曲霉菌檢測,警惕合并曲霉感染。

本研究通過對(duì)BALF中幾種檢測手段的比較發(fā)現(xiàn)mNGS的檢測效能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)病原學(xué)方法,BALF的mNGS較培養(yǎng)及GM試驗(yàn)的診斷陽性率均高,且曲霉菌在核酸提取過程中屬于較難破壁微生物,不易被檢出,故即使檢出序列數(shù)低仍提示其為致病菌可能[13],說明mNGS是一種可信度較高的檢測技術(shù)。mNGS相對(duì)于其他微生物檢測方法的另一個(gè)優(yōu)勢是鑒別的病原譜較廣,能同時(shí)鑒定出細(xì)菌、真菌及病毒等病原體,特別在少見菌及苛養(yǎng)菌的鑒別中更顯優(yōu)勢。這項(xiàng)技術(shù)對(duì)混合感染或特殊感染的患者尤其獲益,故臨床診療中出現(xiàn)經(jīng)驗(yàn)性治療或據(jù)傳統(tǒng)病原學(xué)方法抗感染治療失敗時(shí),可通過完善mNGS檢測排查有無混合感染或特殊感染的可能。當(dāng)然,mNGS檢測的是病原核酸,并非病原微生物,故對(duì)檢出的多種病原體需綜合判斷其致病性,避免造成抗菌藥物的濫用而誘導(dǎo)其耐藥。mNGS無異常時(shí)還可輔助診斷肺部非感染性疾病,但仍需警惕原始樣本量少或病原微生物存在破壁困難造成的假陰性可能,必要時(shí)需復(fù)測mNGS或聯(lián)合其他病原學(xué)檢測手段聯(lián)合排查。再者,mNGS技術(shù)能有效指導(dǎo)抗菌治療[17-18]。在本研究中,76.5%患者初始的抗感染治療方案均未經(jīng)驗(yàn)性覆蓋真菌,而是依據(jù)mNGS結(jié)果開始抗曲霉治療。2例患者動(dòng)態(tài)監(jiān)測的mNGS結(jié)果提示,BALF中曲霉菌在抗曲霉治療中雖可能短暫轉(zhuǎn)陰,但仍不能松懈,需結(jié)合臨床表現(xiàn)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)綜合判斷是否需繼續(xù)抗曲霉治療,否則曲霉感染仍有再次加重的風(fēng)險(xiǎn),抗曲霉治療需長療程進(jìn)行。故mNGS是診斷和精準(zhǔn)抗曲霉治療的一項(xiàng)有利技術(shù)。

本研究存在以下不足:首先,這是單中心回顧性研究,因此內(nèi)在偏倚不可避免。目前BALF的mNGS在非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染中的研究很少,迫切需要多中心前瞻性大樣本研究。其次,由于缺乏對(duì)mNGS的普遍一致性解讀,故判定mNGS報(bào)道的微生物結(jié)果為感染還是定植菌,最終還必須經(jīng)由熟悉微生物學(xué)知識(shí)的臨床專業(yè)人員參考臨床表現(xiàn)及其他化驗(yàn)檢查進(jìn)行歸類。最后,mNGS雖然高效,但高成本和高技術(shù)要求限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。但mNGS對(duì)不能解釋的和嚴(yán)重的肺炎是一種有力診斷工具,而且除了診斷價(jià)值外,mNGS可應(yīng)用于整個(gè)非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染患者病程中曲霉負(fù)荷狀態(tài)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測,從而可進(jìn)一步檢驗(yàn)抗曲霉治療的療效及評(píng)定抗曲霉治療療程。

BALF的mNGS對(duì)非中性粒細(xì)胞減少肺曲霉感染是一項(xiàng)高效的診斷方法,需被廣泛采用。在診斷混合感染和調(diào)整抗菌治療方案及療效評(píng)價(jià)方面優(yōu)于其他檢測手段,這種新的方法有成為金標(biāo)準(zhǔn)的潛能。