丁香-肉桂藥對(duì)揮發(fā)油的抗氧化作用研究

曾鵬輝 竇晨 高家菊 金月 侯安國 馬云淑

【摘 要】

目的：分析丁香-肉桂藥對(duì)共提取揮發(fā)油（丁香-肉桂揮發(fā)油）的成分及其抗氧化作用，為該藥對(duì)臨床合理應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎性病癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：通過GC-MS分析丁香-肉桂揮發(fā)油成分，DPPH、ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)及總還原力測定丁香-肉桂揮發(fā)油的抗氧化能力，MTT法測定丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活力影響；H2O2刺激RAW264.7細(xì)胞建立氧化損傷模型，試劑盒檢測丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)細(xì)胞CAT、SOD、GSH-PX、MDA水平的影響。結(jié)果：GC-MS分析鑒定出丁香-肉桂揮發(fā)油20種成分，其中丁香酚、α-古巴烯、β-石竹烯、肉桂醛等成分相對(duì)含量較高，丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)ABTS+自由基和DPPH自由基都有較好的清除作用，其IC50分別為（24.15±1.03）μg/mL和（47.23±1.89）μg/mL，其總抗氧化能力FRAP值與丁香-肉桂揮發(fā)油濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系；10～80 μg/mL丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性沒有影響；40 μg/mL的丁香-肉桂揮發(fā)油能顯著提高抗氧化因子SOD、GSH水平，并降低過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物L(fēng)DH、MDA水平（P＜0.01）。結(jié)論：丁香-肉桂揮發(fā)油通過提高抗氧化因子活性，抑制脂質(zhì)過氧化酶反應(yīng)，改善細(xì)胞氧化損傷，具有較好的抗氧化能力。

【關(guān)鍵詞】 丁香；肉桂；自由基；氧化損傷

【中圖分類號(hào)】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）04-0041-07

Study on effect of Antioxidation of Volatile Oil of Pair of Caryophylli flos-Cinnamomi cortex

ZENG Penghui1 DOU Chen1 GAO Jiaju1 JINYue1 HOU Anguo1，3 MA Yunshu1，2*

1.School of Chinese Materia Medica， Yunnan University of Chinese Medicine，Kunming 650500， China;

2.Yunnan Key Laboratory of Applied Drug Delivery System and Preparation Technology， Kunming 650500， China;

3. Yunnan Key Laboratory of Yi and Dai Medicines， Kunming 650500， China

Abstract：

Objective To investigate the composition and the antioxidant effect of volatile oilfrom pair of Caryophylli flos-Cinnamomi cortex （VOCC）by co-extracting， and provide experimental evidence for rational clinical application of this herb pair in arthritic disease. Method The components OF VOCC were analyzed by GC-MS， the antioxidant capacity of VOCC was determined by DPPH， ABTS+ free radical scavenging experiments and total reducing power， and the effect of VOCC on the cell viability of RAW264.7 cells was determined by MTT method; H2O2 stimulated RAW264.7 cells to establish Oxidative damage model， and the the effects of VOCC on the levels of CAT， SOD， GSH-PX and MDA in cells were determined bythe testing kit. Result GC-MS analysis identified 20 components in VOCC， among which eugenol， α-cubane， β-caryophyllene and cinnamaldehyde were relatively high in content. VOCC had a good scavenging effect on ABTS+ free radicals and DPPH free radicals with IC50was （24.15±1.03）μg/mL and （47.23±1.89）μg/mL respectively. The total antioxidant capacity FRAP value and the concentration of Dinggui volatile oil showed a dose-effect relationship with concentration of VOCC. 10-100 μg/mL of VOCC had no effect on the viability of RAW264.7 cells; 40 μg/mL of VOCCcould increase the levels of antioxidant factors SOD and GSH， and decrease the levels of lipid peroxide products LDH and MDA （P<0.01）. Conclusion VOCCcould ameliorate cellular oxidative damage by promoting the activity of antioxidant factors and inhibiting lipid peroxidase reaction， and has good antioxidant capacity.

Keywords：Caryophylli Fols；Cinnamomum Cassia；Free Radicals；Oxidative Damage

中藥丁香（Caryophylli Fols）來源于桃金娘科植物的干燥花蕾，具有溫中降逆、溫腎助陽等功效［1］；肉桂（Cinnamomum cassia）來源于樟科植物肉桂的干燥樹皮，具有散寒止痛、溫經(jīng)通脈等功效［2］。丁香、肉桂的配伍使用是在遵守中醫(yī)藥理論指導(dǎo)的前提下，通過長期中醫(yī)臨床應(yīng)用實(shí)踐總結(jié)出來的經(jīng)典散寒止痛藥對(duì)，臨床上常用于各類治療關(guān)節(jié)炎性病癥的外用貼劑中配伍使用，如傷濕止痛膏、復(fù)方南星止痛膏、通絡(luò)祛痛膏等。研究［3］表明，炎性病變?cè)诠切躁P(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理中起著非常重要的作用，軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞以及浸潤的免疫細(xì)胞釋放的大量炎癥因子，都會(huì)對(duì)關(guān)節(jié)的合成代謝和分解代謝過程產(chǎn)生影響。此外，炎癥還會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的炎性浸潤，對(duì)機(jī)體造成氧化損傷并產(chǎn)生大量自由基，進(jìn)而加速軟骨破壞［4］。

氧化應(yīng)激在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中也起到相當(dāng)重要的作用，活性氧類（ROS）的過量積累不僅會(huì)影響軟骨細(xì)胞的合成代謝，加速軟骨細(xì)胞衰老和凋亡，還會(huì)導(dǎo)致軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而喪失正常的生物功能，促進(jìn)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［5-7］。綜上所述，關(guān)節(jié)炎的形成發(fā)展與炎癥及氧化應(yīng)激有著密不可分的關(guān)系。

研究［8-9］表明，丁香中的丁香酚有良好的抗炎抗氧化作用，可降低細(xì)胞中多種炎癥因子的釋放，并有較好的清除自由基能力。肉桂的抗炎抗氧化作用主要體現(xiàn)在對(duì)炎癥細(xì)胞因子、環(huán)氧化酶、免疫細(xì)胞及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)［10］。丁香、肉桂的主要活性成分丁香酚、肉桂醛等均為揮發(fā)性成分［11］，本文采用GC-MS對(duì)丁香-肉桂藥對(duì)混合提取的揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行研究，探索藥對(duì)揮發(fā)油抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為丁香-肉桂藥對(duì)臨床合理應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎病癥及其作用機(jī)制分析提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 丁香、肉桂均購自昆明德陽遠(yuǎn)知中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張潔副教授鑒定為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾和樟科植物肉桂的干燥樹皮。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購買于美國BI公司；脂多糖（LPS）、二甲基亞砜（DMSO）為美國Sigma公司；MTT（貨號(hào)G4000，美國Progema公司）；乳酸脫氫酶（LDH）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；抗壞血酸（VC）、過氧化氫、水楊酸鈉、七水合硫酸亞鐵、冰醋酸均為分析純，購自廣州光華科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三吡啶基三嗪（TPTZ）、2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、硫酸鐵、無水乙酸、三氯化鐵，無水乙醇、30%過氧化氫、鹽酸、水楊酸鈉、無水乙酸鈉均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 儀器 Agilent 7890a-5975c氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；4750E型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國NUAIRE公司）；PX822ZHE電子天平（d=0.01 g，奧豪斯儀器有限公司）；10 L揮發(fā)油提取器（四川蜀玻有限公司）。

2 方法

2.1 揮發(fā)油的提取與GC-MS分析 取丁香和肉桂飲片適量，將其粉碎后各稱取200 g和600 g混合，加水量為6.4 L，浸泡8 h，回流提取6 h，收集上層的揮發(fā)油并加入無水硫酸鈉，靜置過夜以去除水分，離心得丁香-肉桂藥對(duì)混合揮發(fā)油（丁香-肉桂揮發(fā)油）。取0.2 mL丁香-肉桂揮發(fā)油，用正己烷定容至10 mL并超聲，過濾，備用。

氣相色譜條件：安捷倫DB-5MS柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；初始柱溫為40 ℃（停留1 min），先以10 ℃/min速率升溫9 min至130 ℃并保持5 min，再以8 ℃/min速率升溫15 min至250 ℃并保持5 min；設(shè)定進(jìn)樣口端溫度為280 ℃，所使用載氣為高純氦氣，保持載氣流量為1 mL/min；采用分流進(jìn)樣模式，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL；設(shè)置溶劑延遲時(shí)間為4 min，總分離時(shí)間為35 min。

質(zhì)譜條件：電離轟擊方式為EI，電子能量調(diào)整為70 eV，設(shè)定離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜端溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍：m/z 50～600。

2.2 ABTS+自由基清除能力的測定 參考文獻(xiàn)［12］的方法并稍作改進(jìn)，將7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L的過硫酸鉀混合，黑暗處靜置12 h，用無水乙醇稀釋生成的ABTS+溶液，使其在30 ℃，734 nm波長下的吸光度為（0.7±0.02），即得到ABTS+工作液。取150 μL的ABTS+溶液加入50 μL不同濃度樣品液，空白組用甲醇代替樣品溶液，對(duì)照管用蒸餾水代替ABTS+工作液，重復(fù)試驗(yàn)3次，室溫避光放置30 min，于波長734 nm下測定其吸光度。

2.3 DPPH自由基清除能力的測定 參考文獻(xiàn)［13］的方法并稍作改進(jìn)，配制0.2 mmol/L DPPH工作液，取100 μL的DPPH溶液加入同體積不同濃度樣品液，空白組用甲醇代替樣品溶液，對(duì)照管用甲醇代替DPPH工作液，重復(fù)試驗(yàn)3次，室溫避光放置30 min，于波長517 nm下測定其吸光度。

2.4 總還原力FRAP法測定 參考文獻(xiàn)［14］的方法并稍作改進(jìn)，配置FRAP工作液，將300 mmol/L的醋酸鹽緩沖液，10 mmol/L-TPTZ和20 mmol/L的FeCl3按照10∶1∶1的比例混勻，37 ℃水浴30 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。195 μL的FRAP試劑和5 μL不同的樣品液37 ℃孵育6 min，重復(fù)試驗(yàn)3次，室溫避光放置30 min，于波長593 nm下測定其吸光度。

2.5 揮發(fā)油細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將RAW264.7細(xì)胞按5.0×104個(gè)/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄去上清，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度樣品溶液處理細(xì)胞；對(duì)照組細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，每孔加20 μL的MTT溶液，置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液后再加入150 μL二甲基亞砜，振蕩溶解10 min。492 nm下測定吸光值。

2.6 H2O2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞氧化損傷模型 將RAW264.7細(xì)胞按5.0×104個(gè)/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，進(jìn)行分組處理，對(duì)照組加入含0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的H2O2溶液，孵育8 h。采用MTT法檢測吸光度，操作同2.5。

2.7 丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞存活率影響 取RAW264.7細(xì)胞按5.0×104/孔的細(xì)胞濃度接種在96孔板中，置于5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，進(jìn)行分組處理，對(duì)照組加入含0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的丁香-肉桂揮發(fā)油溶液，每組6個(gè)復(fù)孔，24 h后全部組加入H2O2溶液孵育8 h。采用MTT法檢測吸光度，操作同2.5。

2.7 氧化因子測定 將RAW264.7巨噬細(xì)胞按照每孔4.0×105個(gè)的細(xì)胞濃度接種在6孔板中（每孔加入2 mL），孵育24 h。去除培養(yǎng)基，對(duì)照組和模型組加入含0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含有不同濃度揮發(fā)油的培養(yǎng)基孵育24 h，然后模型組和實(shí)驗(yàn)組更換為含600 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基處理8 h，對(duì)照組更換為完全培養(yǎng)基。按照試劑盒說明書要求收集培養(yǎng)基上清液或者細(xì)胞蛋白用于測定SOD、CAT、LDH和GSH的含量。

3 結(jié)果

3.1 GC-MS分析 如圖1所示，丁香-肉桂揮發(fā)油通過GC-MS檢測到了22種成分，依據(jù)NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索分析鑒定出20種揮發(fā)性成分，其峰面積之和占總峰面積的97.88%。其中丁香酚、α-古巴烯、β-石竹烯、肉桂醛這四種成分相對(duì)含量較高。具體成分信息見表1。

3.2 ABTS+法 如圖2所示，當(dāng)丁香-肉桂揮發(fā)油濃度從6.25 μg/mL增加到50 μg/mL，對(duì)ABTS+自由基的清除率從4.81%增加到85.12%，后趨于穩(wěn)定，其IC50為（24.15±1.03）μg/mL。隨著揮發(fā)油濃度的增加，其對(duì)ABTS+自由基的清除率也隨之增加，表明丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)ABTS+自由基有較好的清除作用，其抗氧化作用在低濃度時(shí)弱于維生素C（VC），高濃度時(shí)相當(dāng)。

3.3 DPPH法 如圖3所示，隨著丁香-肉桂揮發(fā)油濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除率也隨之增加，當(dāng)丁香-肉桂揮發(fā)油濃度從6.25 μg/mL增加到100 μg/mL，對(duì)DPPH自由基的清除率從5.11%增加到78.82%，其IC50為（47.23±1.89）μg/mL，表明丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，但抗氧化作用弱于VC。

3.4 FRAP法 抗氧化劑可以通過提供單個(gè)電子的可以使Fe3+-TPTZ配合物還原成藍(lán)色的Fe2+-TPTZ配合物，因此可以從吸光度值來判斷抗氧化劑的總抗氧化能力［15］。如圖4所示，總抗氧化能力與丁香-肉桂揮發(fā)油濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系，丁香-肉桂揮發(fā)油具有一定的抗氧化能力，但其總抗氧化能力弱于VC。

3.5 丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)RAW264.7細(xì)胞的存活率檢測 如圖5所示，20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活力具有較好的維持作用，分別達(dá)到95.73%、96.89%、92.77%；120 μg/mL丁香-肉桂揮發(fā)油給藥組細(xì)胞活力為69.14%，因此本實(shí)驗(yàn)選擇給藥劑量為20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL。結(jié)果表明，0～80 μg/mL丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)RAW264.7細(xì)胞沒有毒性。

3.6 H2O2造模實(shí)驗(yàn) 如圖6所示，使用H2O2刺激細(xì)胞后會(huì)使細(xì)胞的存活率下降，且隨著濃度增大，其對(duì)細(xì)胞的殺傷力越大。當(dāng)H2O2濃度為600 μmol/L時(shí)，此時(shí)細(xì)胞存活率接近一半。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇600 μmol/L的H2O2刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷模型。

3.7 給藥后存活率檢測 丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)對(duì)氧化損傷模型細(xì)胞的存活率如圖7所示，與正常組相比，模型組細(xì)胞的存活率顯著降低；與模型組相比，不同濃度的丁香-肉桂揮發(fā)油組細(xì)胞存活率較模型組分別提高。表明丁香-肉桂揮發(fā)油可減少因H2O2刺激而引起的細(xì)胞死亡。

3.8 氧化因子測定 乳酸脫氫酶（LDH）是葡萄糖酵解所必需的酶，LDH不僅可將葡萄糖催化脫氫為丙酮酸，還可進(jìn)一步將丙酮酸還原為乳酸，故LDH活性與巨噬細(xì)胞激活程度相關(guān)，是巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志之一［16］。由圖8可知，模型組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)的LDH水平顯著升高（P<0.01）；藥物組與模型組相比，丁香-肉桂揮發(fā)油各劑量組均能顯著降低巨噬細(xì)胞LDH活性（P<0.05），且濃度越高，效果越好，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

谷胱甘肽（GSH）是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的三肽，具有抗凋亡、抗炎、促進(jìn)組織修復(fù)、清除自由基等多種重要生理功能［17-18］。由圖9可知，模型組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)的GSH水平顯著降低（P<0.01）；藥物組與模型組相比，丁香-肉桂揮發(fā)油各劑量組均能顯著提高巨噬細(xì)胞GSH活性（P<0.05），且濃度越高，效果越好，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

丙二醛（MDA）含量是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)，MDA含量升高引發(fā)生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，并且其分解產(chǎn)物會(huì)引起細(xì)胞損傷，改變細(xì)胞膜構(gòu)型、結(jié)構(gòu)和通透性進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激［19］。由圖10可知，模型組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)的MDA水平顯著提高（P<0.01）；與模型組相比，丁香-肉桂揮發(fā)油各劑量組均能顯著降低巨噬細(xì)胞MDA活性（P<0.05），且濃度越高，效果越好，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用［20］。由圖11可知，模型組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)的SOD水平顯著降低（P<0.01）；與模型組相比，丁香-肉桂揮發(fā)油各劑量組均能顯著提高巨噬細(xì)胞SOD活性（P<0.05），且濃度越高，效果越好，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

4 討論

在正常情況下，需氧生物通過組織良好的酶和非酶的自我防御系統(tǒng)來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［21］。當(dāng)機(jī)體內(nèi)氧自由基主要是ROS的過度表達(dá)，會(huì)使細(xì)胞受損，最終導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生［22］。巨噬細(xì)胞不僅參與宿主防御，有識(shí)別和清除微生物病原體的功能，同時(shí)也是ROS等促氧化劑作用的主要靶點(diǎn)［23］。因巨噬細(xì)胞易受ROS影響且在免疫系統(tǒng)中非常重要，故研究多采用巨噬細(xì)胞作為氧化損傷模型［24-26］。

研究結(jié)果顯示，丁香-肉桂揮發(fā)油對(duì)ABTS+自由基和DPPH自由基都有較好的清除作用，其總抗氧化能力與丁香-肉桂揮發(fā)油濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系；且能顯著提高經(jīng)H2O2誘導(dǎo)損傷后的RAW264.7細(xì)胞存活率；細(xì)胞中SOD和GSH活性明顯提高，同時(shí)MDA和LDH含量顯著降低。因此丁香-肉桂揮發(fā)油是通過提高抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化酶反應(yīng)的活性來達(dá)到抗氧化的作用效果。

據(jù)文獻(xiàn)［27］報(bào)道，丁香揮發(fā)油中相對(duì)含量較高的成分有丁香酚、β-石竹烯、乙酸丁香酚酯和α-古巴烯等。肉桂揮發(fā)油中肉桂醛、α-古巴烯、α-蒎稀、β-蒎稀、α-依蘭油烯等的成分含量較高［28］。結(jié)合GC-MS分析結(jié)果可知，文獻(xiàn)［29-30］報(bào)道的丁香、肉桂各自揮發(fā)油中含量最高的幾個(gè)成分，在二者混合提取時(shí)均有出現(xiàn)，其中β-石竹烯、α-古巴烯等成分在揮發(fā)油中的相對(duì)含量較高，且有研究發(fā)現(xiàn)其單體成分均具有良好的抗氧化作用。有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證丁香-肉桂揮發(fā)油發(fā)揮抗氧化作用是否主要與β-石竹烯、α-古巴烯等有關(guān)。

本文初步探究丁香-肉桂揮發(fā)油的體外抗氧化活性和對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，為丁香-肉桂的聯(lián)合抗氧化應(yīng)用與抗骨關(guān)節(jié)炎提供了一定的依據(jù)，但該藥對(duì)配方應(yīng)用對(duì)其抗骨關(guān)節(jié)炎與抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制尚需開展進(jìn)一步相關(guān)動(dòng)物、細(xì)胞分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)研究，為該藥對(duì)在臨床合理應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2022-06-18 編輯：陶希睿）