Meg3在全反式視黃酸誘發(fā)小鼠腭裂中的作用

劉小轉,張軍喜,余增麗,王國旭,何志東,宋帥星,李 雪

1)河南省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心 鄭州 450003 2)國家衛(wèi)生健康委員會出生缺陷預防重點實驗室;河南省人口缺陷干預技術研究重點實驗室 鄭州 450002 3)鄭州大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室 鄭州 450001

腭裂是人類常見的顱面畸形[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn),維生素A對胚胎發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用。視黃酸是維生素A的生理活性形式,在實驗研究中常應用全反式視黃酸(all-trans retinoic acid,atRA)。有文獻[3]報道,藥理濃度的atRA可影響胎鼠神經(jīng)嵴細胞的增殖和遷移,誘發(fā)頜面部畸形,導致腭裂發(fā)生。

母系印跡基因3(maternally expressed gene 3,Meg3)是定位于染色體14q32.3的一個長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)[4]。TGF-β作為一種轉化生長因子,通過調(diào)控Smad信號通路,參與多種細胞上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程,在腭發(fā)育和融合過程中至關重要[5]。文獻[6-8]報道,Meg3可直接激活TGF-β及其下游基因Smad2/3,參與TGF-β誘導的EMT、細胞增殖和分化,因此推測Meg3在胎鼠腭突發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。

本研究采用atRA誘導建立胎鼠腭裂模型,觀察腭發(fā)育過程中胎鼠腭突間充質細胞增殖和細胞中磷酸化Smad2(phospho-Smad2,p-Smad2)、Smad2、Smad4和Smad7表達情況,檢測腭突組織中Meg3 mRNA的定位和表達,以及Meg3基因與Smad2蛋白結合情況,探討Meg3在atRA誘發(fā)腭裂過程中的作用,為腭裂的預防提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器atRA(美國Sigma公司),BCA蛋白檢測試劑盒(中國北京索萊寶公司),BrdU抗體、小鼠抗Smad2單克隆抗體、兔抗鼠p-Smad2單克隆抗體、小鼠抗Smad4單克隆抗體、小鼠抗Smad7單克隆抗體(美國Abcam公司),兔抗鼠IgG(美國Cell Signaling公司),熒光抗體IgG(美國Jackson公司),DAPI(瑞士Roche公司),磁珠(美國Thermo Fisher公司),熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)試劑盒(中國銳博公司),Power Up SYBR Green試劑盒(中國諾唯贊公司),Trizol(美國 Thermo公司)。低溫高速臺式離心機(德國Eppendorff公司),ChemiDocXRS+系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 動物模型的構建8～10周齡成年健康C56BL/6N近交系小鼠130只(雌鼠110只,雄鼠20只),來源于北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物許可證號:SCXK(京)016-0006。于晚上8:00按照雌雄比例2∶1合籠交配,第二天早上8:00檢查雌鼠,有陰栓的雌鼠記錄體重并分籠飼養(yǎng),該時間記錄為GD0;于GD10早上8:00再次對雌鼠稱量體重,兩次體重相差>2.0 g視為真性孕鼠。最終真性孕鼠90只,根據(jù)體重按照隨機數(shù)字表隨機分為atRA組和對照組,每組45只,分別給予100 mg/kg atRA和等體積的玉米油灌胃,1次/d。

1.3 標本制備兩組孕鼠分別于GD13、GD14、GD15上午10:00頸椎脫臼處死(每組各時間點15只),其中擬行BrdU染色的孕鼠(每組各時間點5只)處死前2 h腹腔注射100 mg/kg BrdU。剖腹取胎鼠。切取胎鼠頭部,多聚甲醛固定6 h,喙部朝下,常規(guī)包埋,冠狀切片。分離雙側腭突,置于含1 U/mL中性蛋白酶消化液的青霉素瓶中,37 ℃恒溫水浴箱中孵育15 min,手動輕振至腭突中嵴上皮與腭突間充質組織塊分離并呈碎片狀懸浮于液體中,用移液器吸去上皮碎片,將剩余組織和液體移至15 mL離心管中,室溫1 000 r/min離心5 min,得胎鼠腭突間充質細胞。

1.4 胎鼠腭部組織學觀察取GD13、GD14、GD15胎鼠頭部冠狀切片,經(jīng)過逐級脫蠟、復水、HE染色、脫水、透明、封片,在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 胎鼠腭突組織中腭突間充質細胞增殖的檢測取GD13、GD14、GD15各5只胎鼠頭部冠狀切片,常規(guī)脫蠟至水,體積分數(shù)0.3%H2O2室溫孵育10 min,正常羊血清孵育20 min,加BrdU抗體(1∶800)37 ℃孵育2 h,加 IgG熒光二抗(1∶300)37 ℃孵育 1 h,DAPI(1∶100) 37 ℃復染10 min。每只胎鼠隨機取1張切片共5張,在熒光顯微鏡下,選擇腭突間充質細胞固定區(qū)域統(tǒng)計細胞總數(shù)和BrdU陽性細胞數(shù),計算BrdU陽性細胞率。

1.6 胎鼠腭突間充質細胞中Meg3的FISH法定位取GD14胎鼠(每組5只)頭部冠狀切片,經(jīng)過標準脫蠟脫水后,加FISH試劑盒中的Meg3和18S探針(用Cy3標記,激發(fā)光555 nm,發(fā)射光570 nm;結果為紅色熒光)混合物,37 ℃孵育過夜。用含甲酰胺的2×SSC洗3遍,加DAPI(1∶100,藍色熒光) 37 ℃復染10 min,1×PBS洗滌后在共聚焦顯微鏡下成像。18S為陽性參照。

1.7 胎鼠腭突間充質細胞中Meg3 mRNA表達的檢測取分離的GD14胎鼠腭突間充質細胞(每組3只),Trizol法提取總RNA并測定其含量,反轉錄得cDNA,適當稀釋,按照Power Up SYBR Green試劑盒說明書操作,以β-actin作為內(nèi)參,進行實時熒光定量PCR。采用2-ΔΔCt法計算Meg3 mRNA相對表達量。引物由尚亞生物技術有限公司設計并合成,引物序列見表1。

表1 PCR引物

1.8 胎鼠腭突間充質細胞中Smad通路蛋白表達的檢測取分離的GD14胎鼠腭突間充質細胞(每組3只),加入裂解液,冰上裂解細胞,同時加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,提取蛋白,用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度,計算上樣量,然后制膠、上樣(50 μg/孔)、電泳、轉膜,50 g/L脫脂奶37 ℃封閉2 h;加Smad2抗體(1∶2 000),p-Smad2、Smad4、Smad7、GAPDH抗體(均為1∶1 000)4 ℃孵育過夜,加IgG二抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h;用增強發(fā)光液(EpiZyme)顯影,應用ChemiDocXRS+系統(tǒng)掃描,用Image J計算條帶灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.9 胎鼠腭突間充質細胞中Meg3與Smad2蛋白結合情況的檢測采用RNA結合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)實驗檢測。取分離的GD14胎鼠腭突間充質細胞(每組3只),加入裂解液,冰上裂解細胞;將每個樣本的裂解混合液分成2份,分別加入Smad2抗體和IgG抗體(均為10 μg/mL)4 ℃孵育過夜,使用磁珠沉淀結合蛋白;用Trizol提取沉淀中的mRNA,然后檢測Meg3 mRNA的表達,方法同1.7。

2 結果

2.1 兩組胎鼠腭部發(fā)育情況的比較兩組胎鼠腭突組織學表現(xiàn)見圖1。GD13,兩組胎鼠腭突均垂直生長,無明顯區(qū)別。GD14,對照組胎鼠兩側腭突抬高、水平生長,向腭中線延伸,舌體下降;atRA組胎鼠雙側腭突抬高延遲,舌體下降不明顯。GD15,對照組胎鼠兩側腭突互相接觸,完全融合;atRA組胎鼠雙側腭突體積小,未融合,腭裂明顯。

ps:腭突;t:舌體

2.2 兩組胎鼠腭突間充質細胞增殖情況的比較兩組胎鼠頭部冠狀切片BrdU染色結果見圖2和表2。GD13和GD14,atRA組BrdU陽性細胞率均低于對照組;GD15,對照組無BrdU陽性細胞,atRA組BrdU陽性細胞率達(1.18±0.71)%。

圖2 兩組GD13、CD14、GD15胎鼠腭突間充質細胞增殖情況(BrdU×200,白色方框為量化分析區(qū)域)

表2 兩組GD13、GD14、GD15胎鼠BrdU陽性細胞率的比較 %

2.3 GD14胎鼠腭突間充質細胞中Meg3的定位和表達Meg3基因主要定位在GD14胎鼠腭突間充質細胞的細胞核,見圖3。對照組、atRA組胎鼠腭突間充質細胞中Meg3 mRNA相對表達量分別為(1.00±0.14)、(1.73±0.09),atRA組高于對照組(t=7.310,P<0.001)。

圖3 GD14胎鼠腭突間充質細胞中Meg3的定位(FISH,×200)

2.4 兩組GD14胎鼠腭突間充質細胞中Smad通路相關蛋白表達的比較見圖4和表3。與對照組相比,atRA組GD14胎鼠腭突間充質細胞中p-Smad2和Smad4蛋白表達水平降低,Smad7蛋白表達水平增加,兩組Smad2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 兩組GD14胎鼠腭突間充質細胞中Smad通路相關蛋白的表達

表3 兩組GD14胎鼠腭突間充質細胞中Smad通路相關蛋白表達水平的比較

2.5 兩組GD14胎鼠腭突間充質細胞中Meg3與Smad2蛋白結合情況的比較atRA組和對照組GD14胎鼠腭突間充質細胞中Meg3基因均與Smad2蛋白結合,富集的Meg3 mRNA相對表達量分別為(36.0±3.5)、(6.0±2.1),atRA組大于對照組(t=12.729,P<0.001)。

3 討論

腭的發(fā)育過程中,主要通過基因調(diào)控網(wǎng)絡介導細胞遷移、增殖、凋亡、分化以及細胞外基質分泌等,從而控制腭架的生長、升高和融合[9],任一環(huán)節(jié)失調(diào)都會導致腭突融合失敗,從而導致腭裂。顱神經(jīng)嵴來源的間充質細胞是腭突的主要組成細胞[10]。相關研究[11]發(fā)現(xiàn),腭突抬高不足或發(fā)育遲緩與胚胎腭突間充質細胞的增殖抑制有關。atRA可以通過抑制胎鼠腭突間充質細胞增殖導致腭裂發(fā)生[12-14]。本研究HE染色結果再次證實atRA對腭突發(fā)育有影響,atRA組胎鼠在腭突生長關鍵期GD14和GD15[15]腭突抬高延遲,未能完全接觸融合,腭裂表型明顯。基于本研究中HE染色展現(xiàn)的形態(tài)學特點,我們選擇GD14胎鼠作為主要研究對象,探討腭裂發(fā)生的可能機制。

Meg3參與多種細胞的增殖、遷移、EMT等過程[16]。Meg3表達上調(diào)可促進牙髓干細胞發(fā)生成骨分化,細胞中成骨標志物runt相關轉錄因子2和骨鈣素表達上調(diào)[17]。TGF-β家族通過調(diào)節(jié)細胞增殖、生長以及分化等,在胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用,Smad蛋白是TGF-β家族信號傳導的關鍵下游分子[18]。本研究結果顯示,atRA組GD14胎鼠腭突間充質細胞增殖能力較對照組明顯減弱,胎鼠腭突間充質細胞中Meg3 mRNA表達水平高于對照組,p-Smad2和Smad4蛋白表達水平低于對照組,Smad7表達水平高于對照組,兩組Smad2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義;RIP實驗結果表明胎鼠腭突間充質細胞中Smad2蛋白能夠直接與Meg3基因結合,atRA組胎鼠腭突間充質細胞中Smad2蛋白對Meg3基因的富集率顯著高于對照組。由此推測atRA可能通過促進Meg3與Smad2的靶向結合,進而抑制TGF-β/Smad信號通路的激活,影響胎鼠腭突間充質細胞的增殖,從而導致腭裂的發(fā)生。