茉莉酸甲酯調(diào)控荻草谷網(wǎng)蚜與小麥互作關(guān)系的研究

閆 夏，尚煥章，胡佳振，羅繼芬，邵雅婷，郭 嬌，徐世才*，羅 坤*

（1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；2.陜西省紅棗重點(diǎn)實驗室，陜西 延安 716000）

荻草谷網(wǎng)蚜（Sitobion miscanthi），屬半翅目蚜科，在中國曾被誤定名為麥長管蚜（Sitobion avenaeFabricius），是麥田病蟲害的優(yōu)勢害蟲，對麥類作物的安全生產(chǎn)以及糧食安全帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因其具有典型的R-對策害蟲的特點(diǎn)，這使得化學(xué)農(nóng)藥防治成為調(diào)控荻草谷網(wǎng)蚜的種群數(shù)量的主要手段［1］，為降低化學(xué)農(nóng)藥的亂施濫用，也曾出現(xiàn)一些利用生態(tài)調(diào)控［2-3］、物理防治［4-5］、抗性遺傳育種［6-7］等相關(guān)方式方法調(diào)控麥蚜的種群數(shù)量，然而它們的防治效果均不能滿足生產(chǎn)的需要［8］。小麥在長期遭受麥蚜取食時，也在協(xié)同進(jìn)化的作用下進(jìn)化出了自身的防御體系，因此，應(yīng)用植物自身所具有的植物激素介導(dǎo)的防御通路是發(fā)展可持續(xù)性防控病蟲害的新理念和新策略的重要路徑。

在眾多植物激素中以茉莉酸類化合物（Jasmonates，JAs）和水楊酸（Salicylic acid，SA）作為信號分子誘導(dǎo)的JA防御通路以及SA防御通路在植物的抗蟲性中發(fā)揮著重要作用［9-11］。據(jù)筆者前期的研究結(jié)果表明：麥蚜取食之后可誘導(dǎo)小麥顯著提高SA 與JAs 合成關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而引起植物組織累積大量植物防御激素，同時JAs 被證實會抑制SA 防御通路。而茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）屬于JAs的一種，外源施加后會引起JAs的大量積累，因此在MeJA 噴施小麥后極有可能通過JAs的積累打破宿主體內(nèi)的活性氧類化合物（Reactive oxygen species，ROS）的動態(tài)平衡，對害蟲的取食、生理活動及寄主選擇產(chǎn)生影響［12-13］。此外，植物激素介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)可顯著減緩宿主的營養(yǎng)生長［14］，而抗氧化酶系在“權(quán)衡”植物的生長與防御之間也發(fā)揮重要作用，同時害蟲為建立長期的寄生關(guān)系，害蟲也可以通過提高抗氧化酶的活性［15］，以清除體內(nèi)累積的ROS，進(jìn)而降低膜質(zhì)的過氧化程度。同時，生物體內(nèi)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的變化常常作為細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的衡量指標(biāo)，而植物與昆蟲內(nèi)保護(hù)酶活性的高低恰恰能反映出其清除自由基的能力，以及其受到攻擊的程度［16］。對于外源施加MeJA 引起JAs 的積累從而對小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜抗氧化防御酶活性的相關(guān)研究較為缺乏。

本研究通過對小麥外源噴施MeJA［17］，在不同的處理時間點(diǎn)測定小麥體內(nèi)以及取食該小麥的荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)保護(hù)酶系，包括過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）等酶活性變化以及MDA 的含量變化，以明確JAs 的積累對麥蚜的取食、生理活動的間接影響，為探究外源施加MeJA的綠色防治荻草谷網(wǎng)蚜提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：供試小麥品種為西農(nóng)979，將小麥種子單盆單株種植于直徑10 cm，高8.5 cm 的花盆中，（花盆中基質(zhì)與土壤體積比1∶1），小麥用防蟲網(wǎng)保護(hù)，在條件為23 ℃±3 ℃，L：D=14∶10，相對濕度50%±5%的人工智能溫室中生長，統(tǒng)一水肥。待14 d 后到達(dá)三葉期時用于試驗。

供試蟲源：采自陜西省楊凌區(qū)，無翅型單克隆系荻草谷網(wǎng)蚜，經(jīng)延安大學(xué)動物生態(tài)學(xué)實驗室多代飼養(yǎng)馴化。

供試試劑：MeJA（純度為95%）、吐溫20（純度為95%）、冰乙酸（純度為99.5%）均購自上海麥克林生化科技有限公司，生理鹽水購自唐派醫(yī)療有限公司。

酶活測定試劑盒：蛋白定量（TP）測定試劑盒、CAT、POD、SOD、MDA酶活測定試劑盒，以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

小麥組織酶活測定：選取長勢一致的三葉期西農(nóng)979 小麥噴施濃度為2.50 mmol/L 的MeJA，對照組噴施蒸餾水。并在處理后6、12、24 h 等3 個時間點(diǎn)剪取葉片，稱量后按照質(zhì)量體積比為1∶9，加入0.9%的生理鹽水，利用預(yù)冷12 h的研缽研磨成勻漿后，4 000 r/min 離心15 min，吸取上清后獲得10%組織勻漿上清，放置-80 ℃超低溫冰箱保存用于后續(xù)植物酶活測定。小麥組織各酶活的測定參考對應(yīng)酶活試劑盒的使用說明書，并對反應(yīng)時長略作調(diào)整。

荻草谷網(wǎng)蚜酶活測定：選取長勢一致的三葉期西農(nóng)979 噴施濃度為2.50 mmol/L 的MeJA，對照組噴施蒸餾水。并在噴施后12 h接種已饑餓處理12 h的荻草谷網(wǎng)蚜成蟲（無翅型），每株小麥接種50頭成蟲，并于接種6、12、24 h等3個時間點(diǎn)收集小麥葉片上取食的蚜蟲，液氮速凍之后保存至-80 ℃超低溫冰箱中用以后續(xù)酶活的測定。荻草谷網(wǎng)蚜10%組織均漿上清的制備及酶活測定參考對應(yīng)試劑盒。

1.3 供試器材

2X-600低速離心機(jī)（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；DZ-98-ⅡA 電熱恒溫水浴鍋（上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司）；TU-100 恒溫金屬水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；721N EPoch 微孔板分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-3200 紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0 軟件對小麥組織以及荻草谷網(wǎng)蚜抗氧化酶等酶活數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用獨(dú)立性T 檢驗進(jìn)行差異性分析（P＜ 0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜SOD活性的影響

由圖1可知，在外源MeJA 噴施后小麥葉片組織中SOD活性在前12 h顯著低于對照組（CK）（P＜0.05），但在24 h 后與對照組恢復(fù)至同一水平。MeJA 處理后的小麥的SOD 水平在實驗的24 h 內(nèi)并沒有明顯起伏，但未處理的對照組SOD 水平呈現(xiàn)下降趨勢。在試驗開始6 h 后，對照組小麥SOD 酶活性較處理組高12.07 U/mg，而12 h 后對照組SOD 活性開始下降，直至24 h 對照組與處理組SOD 活性下降至同一水平，期間噴施MeJA 后的小麥SOD 活性始終保持在18 U/mg左右。

圖1 噴施MeJA對小麥及荻草谷網(wǎng)蚜SOD活性的影響

在荻草谷網(wǎng)蚜取食噴施MeJA 的小麥后對荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)SOD活性有顯著影響（P＜0.05）。在取食處理后小麥6 h 后荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)SOD 活性開始上升，較取食未處理小麥的荻草谷網(wǎng)蚜高出9.31 U/mg；但在24 h 后對照組荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)SOD 活性持續(xù)升高至36.18 U/mg，處理組荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)SOD 活性開始下降，并在24 h 時處理組荻草谷網(wǎng)蚜的SOD活性開始低于對照組荻草谷網(wǎng)蚜（圖1）。

2.2 對小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜POD活性的影響

與SOD 活性變化趨勢不同，小麥對照組以及MeJA 處理組的POD 活性整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖2）。在前12 h 對照組與MeJA 處理組的POD 活性沒有顯著差異（P＞0.05），但在24 h 后MeJA 處理組的POD 活性開始顯著低于對照組（P＜0.05）。在整個實驗過程中，MeJA處理組的POD活性始終低于對照組。

圖2 噴施MeJA對小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜POD活性的影響

荻草谷網(wǎng)蚜取食噴施MeJA 的小麥后POD 活性與對照組相比沒有顯著變化（P＞0.05）。雖然，處理組荻草谷網(wǎng)蚜POD 活性沒有顯著變化，但研究中發(fā)現(xiàn)取食未被噴施MeJA 小麥的荻草谷網(wǎng)蚜的POD 活性，隨著時間的延長，活性較為穩(wěn)定；但取食處理組小麥的荻草谷網(wǎng)蚜在12 h 時POD 活性從6 h 時的3.21 U/mg 上升至4.21 U/mg，并且在12 h 后處理組荻草谷網(wǎng)蚜的POD 活性開始高于對照組荻草谷網(wǎng)蚜（圖2）。

2.3 對小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜CAT活性的影響

與對照組相比，外源施加MeJA 對小麥葉片的CAT活性均無顯著差異。然而，在整個實驗過程中，隨著時間的推移無論對照組小麥還是MeJA 處理組的小麥葉片中CAT活性均呈現(xiàn)下降趨勢（圖3）。

圖3 噴施MeJA對小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜CAT活性的影響

由圖3 可知取食處理后小麥的荻草谷網(wǎng)蚜的CAT 活性在24 h 時顯著高于對照組荻草谷網(wǎng)蚜（P＜0.05），但在前期時外源MeJA 對荻草谷網(wǎng)蚜的CAT活性的影響并不顯著（P＞0.05）。24 h時對照組荻草谷網(wǎng)蚜CAT 活性下降，同時處理組的CAT 活性開始上升并顯著高于對照組荻草谷網(wǎng)蚜的CAT 活性?？傮w來說，取食噴施MeJA 小麥的荻草谷網(wǎng)蚜的CAT 活性的變化趨勢與對照組相反，對照組的CAT活性隨著時間推移先上升后下降，而處理組的CAT活性力先處于了一個較高的水平后開始下降但一段時間后又有上升趨勢。

2.4 對小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜MDA含量的影響

MeJA 處理后的小麥葉片內(nèi)的MDA 含量并沒有顯著影響（P＞0.05）。在噴施MeJA 后的6 h 以及12 h 時，處理后的小麥中MDA 含量都略高于對照組，但并沒有顯著差異，并且小麥葉片中MDA 的含量水平并沒有隨著時間的推移產(chǎn)生明顯的變化（圖4）。

圖4 噴施MeJA對小麥以及荻草谷網(wǎng)蚜MDA含量的影響

取食噴施MeJA 處理小麥的荻草谷網(wǎng)蚜的MDA含量與對照組荻草谷網(wǎng)蚜相比沒有顯著差異（P ＞0.05）。但是，在處理組荻草谷網(wǎng)蚜取食24 h 后開始有升高趨勢，從6 h 和12 h 時的0.60 nmol/mg 左右的含量水平上升至0.91 nmol/mg，反觀對照組的MDA 含量隨時間變化并沒有明顯起伏，始終在0.60 nmol/mg左右（圖4）。

3 討論和結(jié)論

通常，生物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡中，而當(dāng)植物或者昆蟲受到脅迫時，其體內(nèi)MDA 的含量會大幅度上升，而MDA 含量的高低也代表了其體內(nèi)細(xì)胞膜受到的攻擊程度，因此MDA的含量與保護(hù)酶活性高低緊密相關(guān)；保護(hù)酶系中的SOD 主要作用為清除超氧陰離子自由基（O2-），這個過程會產(chǎn)生過氧化氫（H2O2），后續(xù)通過POD 或者CAT進(jìn)一步分解或利用［18］。

本研究結(jié)果表明在外源MeJA 的作用下，無論是直接作用的小麥還是取食處理后小麥的荻草谷網(wǎng)蚜其細(xì)胞膜均未受到明顯攻擊。但取食后的荻草谷網(wǎng)蚜SOD以及 CAT活性均有所升高，表明荻草谷網(wǎng)蚜在取食處理后的小麥后體內(nèi)O2-升高，使得其受到一定程度的損傷，因此可以看到在24 h 時荻草谷網(wǎng)蚜體內(nèi)MDA 含量是有一定的升高趨勢的。而對于小麥來說，外源MeJA 的噴施使得其SOD、POD的酶活在一定程度上下降，說明外源MeJA 噴施降低了小麥體內(nèi)O2-的含量，使其不易受到傷害。但有研究表明POD 能將酚類物質(zhì)氧化為醌及其聚合物，可以抑制昆蟲取食［19］，因此MeJA 的噴施可能降低了小麥的抗蟲性。

在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，噴施MeJA 會使得小麥內(nèi)JA 合成相關(guān)基因上調(diào)，而JA 的合成會促進(jìn)植物生成色胺（Tryptamine，TAM）［20-21］，而TAM 轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物包括5-羥色胺（serotonin）和生長素（Auxin），其中5-羥色胺證實會提高植食性昆蟲的適應(yīng)性［21-22］，而生長素的主要作用是促進(jìn)植物體的生長，在一定程度上會改善蚜蟲的取食環(huán)境，但同時蚜蟲取食又會使得SA 防御通路激活，使得防御相關(guān)病程相關(guān)蛋白基因（Pathogenesis-related protein genes1，PR-1）表達(dá)量上調(diào)［23］。相反，MeJA 噴施會使得SA 的合成關(guān)鍵基因苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL），以及病程相關(guān)基因1的非表達(dá)子（Nonexpressor of pathogenesis-related gene 1，NPR1）的表達(dá)量顯著下降，但會使得色氨酸脫羧酶（Tryptophan decarboxylase，TDC）的表達(dá)量顯著上升，這些變化極有可能進(jìn)一步降低小麥體內(nèi)的ROS 水平，使得抗氧化酶系的活性未呈現(xiàn)顯著變化（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

綜上所述，由于MeJA 的噴施引起的JAs的積累對小麥抗蚜性的影響是多方面的，且相互之間會有影響。因此外源MeJA 的噴施引起的JAs 的積累雖然會對荻草谷網(wǎng)蚜產(chǎn)生不利影響，但會因后續(xù)小麥內(nèi)自身防御系統(tǒng)的拮抗作用，而被抵消。因此，對于植物激素誘導(dǎo)的小麥抗蚜性的研究需更深層次的研究。