細(xì)菌非編碼小RNA的生物學(xué)特征及作用機(jī)制研究進(jìn)展

王海燕　賀婷停　李昊陽

摘要：細(xì)菌非編碼小RNA（sRNA）是一類長度為50～500 nt、一般不編碼蛋白質(zhì)的具有調(diào)控功能的小RNA，主要通過與靶mRNA堿基配對或與靶蛋白質(zhì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用.sRNA參與細(xì)菌氨基酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、環(huán)境脅迫響應(yīng)以及毒力作用等眾多重要生理過程的調(diào)控，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子等構(gòu)成多層級的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同作用使細(xì)菌對環(huán)境變化做出快速且精細(xì)的響應(yīng).由于sRNA在細(xì)菌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要作用，發(fā)現(xiàn)新的sRNA并闡明它們的調(diào)控功能成為原核生物基因表達(dá)調(diào)控研究的一個熱點(diǎn).本綜述對細(xì)菌sRNA的篩選、鑒定、作用機(jī)制以及生物學(xué)功能等方面取得的進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，希望給相關(guān)領(lǐng)域的研究者提供一個較為全面的視角.

關(guān)鍵詞：細(xì)菌; 非編碼sRNA; 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

中圖分類號：Q939.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1001-8395（2023）05-0581-10

細(xì)菌常常暴露在惡劣的自然環(huán)境中，為了應(yīng)對外界環(huán)境的變化，細(xì)菌已進(jìn)化形成一套精密的應(yīng)答機(jī)制來適應(yīng)各種環(huán)境變化.長期以來，普遍認(rèn)為細(xì)菌基因的表達(dá)調(diào)控主要存在于轉(zhuǎn)錄水平，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中同樣存在由非編碼RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控.細(xì)菌非編碼RNA是一大類具有調(diào)控功能的RNA分子，通過各種機(jī)制調(diào)控多種生理過程，這些RNA包括核開關(guān)（riboswitch）、CRISPR RNA、非編碼小RNA（sRNA）等[1]，其中sRNA是研究最多的一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子.細(xì)菌sRNA通常不進(jìn)行翻譯（但是也有例外[2-3]），主要通過與被調(diào)控的靶mRNA進(jìn)行堿基配對來調(diào)控靶標(biāo)的翻譯或穩(wěn)定性[4]，少數(shù)sRNA通過與蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮功能[5].和蛋白類調(diào)控因子相比，sRNA分子小，合成及周轉(zhuǎn)所需能量和時間少，sRNA結(jié)構(gòu)可以在不同構(gòu)象之間快速切換，確保了對環(huán)境壓力信號的迅速反應(yīng).因此，sRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控在細(xì)菌中扮演重要角色[6-7].

近年來，高通量測序特別是RNA-seq已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新sRNA的主流方法，研究者相繼從大腸桿菌、沙門氏菌、結(jié)核桿菌、霍亂弧菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等多種細(xì)菌中預(yù)測到大量sRNA，每種細(xì)菌的sRNA數(shù)目約在幾十到200 個之間[8].然而，對sRNA的實(shí)驗(yàn)鑒定及功能研究還比較有限，已有的研究主要集中于大腸桿菌和沙門氏菌等幾種革蘭氏陰性細(xì)菌，對于革蘭氏陽性菌，即使在模式菌枯草芽孢桿菌中經(jīng)過功能鑒定的sRNA也只有十來個.細(xì)菌sRNA作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，參與細(xì)胞生理的多個層面，包括碳源、氨基酸和金屬離子的利用，細(xì)胞分裂，DNA水平轉(zhuǎn)移，群體感應(yīng)，生物膜形成和毒力基因表達(dá)等，對細(xì)菌應(yīng)對環(huán)境變化產(chǎn)生快速響應(yīng)至關(guān)重要[9-13].本文對細(xì)菌sRNA的發(fā)現(xiàn)方法、功能機(jī)制以及研究策略進(jìn)行簡要總結(jié)，以期能對細(xì)菌sRNA有一個更加全面和清晰的認(rèn)識.

1細(xì)菌sRNA的分類

細(xì)菌sRNA長度多在50～500 nt，絕大部分不編碼蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄后可形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，通過各種作用機(jī)制調(diào)控細(xì)菌的多種生理過程，影響遍及細(xì)菌的整個生命周期.目前已鑒定的細(xì)菌sRNA，根據(jù)其功能及作用方式可分為3大類：具有看家功能的sRNA，與靶蛋白結(jié)合的sRNA，與靶mRNA堿基配對結(jié)合的sRNA.已發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌sRNA絕大多數(shù)屬于第三種類型，是sRNA發(fā)揮調(diào)控功能最普遍的一種方式，即調(diào)節(jié)mRNA的翻譯和穩(wěn)定性.這類調(diào)控RNA根據(jù)其編碼基因的染色體位置進(jìn)一步被分為兩類：順式編碼（cis-encoded）sRNA和反式編碼（trans-encoded）sRNA.順式編碼sRNA（又叫antisense sRNA）由其調(diào)控靶基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，通過與靶mRNA完全互補(bǔ)配對影響其穩(wěn)定性.反式編碼sRNA通常由染色體的基因間隔區(qū)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，還有一部分由mRNA的5或3UTR加工產(chǎn)生，這類sRNA通過不完全堿基配對方式結(jié)合靶mRNA調(diào)控其穩(wěn)定性或翻譯.雖然細(xì)菌中sRNA的數(shù)量并不多，但同一個sRNA可以調(diào)控多個靶基因，同一個靶基因也可以被多個sRNA所調(diào)控，使sRNA能夠參與對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不同節(jié)點(diǎn)、不同嚴(yán)謹(jǐn)性的協(xié)同控制.

2細(xì)菌sRNA的發(fā)現(xiàn)

由于sRNA是一類序列較短、通常不編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，不受無義或移碼突變的影響，且很多只在特定環(huán)境下（如生長狀態(tài)、溫度、pH、離子濃度等）誘導(dǎo)表達(dá)，這給細(xì)菌sRNA的發(fā)現(xiàn)帶來一定的困難.

早期發(fā)現(xiàn)的sRNA主要是通過實(shí)驗(yàn)分離得到，包括放射性標(biāo)記法、鳥槍克隆法（RNA組學(xué)）以及免疫共沉淀法[14-17].這些方法主要適合高豐度、組成型sRNA的篩選，例如4.5S、tmRNA、RNase P以及Spot 42等[18-20].隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展及相應(yīng)的生物信息學(xué)分析工具不斷開發(fā)，利用基因組或轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，大量sRNA被預(yù)測出來[21]，成為發(fā)現(xiàn)細(xì)菌sRNA的主流方法.生物信息學(xué)預(yù)測軟件主要是參考細(xì)菌sRNA的序列保守性、二級結(jié)構(gòu)和熱動力學(xué)穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)錄信號等特征，包括基于比較基因組學(xué)開發(fā)的QRNA、ERPIN、MSARI、INFERNAL、ISI，基于二級結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性開發(fā)的RNAZ和CARNAC，以及基于孤兒啟動子轉(zhuǎn)錄信號特征開發(fā)的sRNAscanner、sRNAPredict3/SIPHT等[22].相比于實(shí)驗(yàn)方法，生物信息學(xué)方法通過對高通量測序數(shù)據(jù)的分析，可在短期內(nèi)獲得大量sRNA的相關(guān)信息，具有成本低、時間快等優(yōu)點(diǎn).但該方法的一個缺點(diǎn)是預(yù)測具有一定的不可靠性，因此，需結(jié)合生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，方法包括qRT-PCR和Northern雜交等，其中Northern雜交是驗(yàn)證非編碼sRNA存在的金標(biāo)準(zhǔn).

3sRNA靶基因的高通量篩選及實(shí)驗(yàn)鑒定

細(xì)菌非編碼sRNA主要通過堿基互補(bǔ)配對的方式對靶基因mRNA進(jìn)行調(diào)控，如何有效找出靶基因是研究sRNA功能的關(guān)鍵因素.由于sRNA與靶mRNA是不完全堿基配對，配對核心區(qū)域一般只有7個堿基左右，因此，靶基因的預(yù)測及篩選具有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)性.迄今為止，已發(fā)展多種方法來篩選sRNA所調(diào)控的靶基因，包括生物信息學(xué)預(yù)測、組學(xué)篩選、實(shí)驗(yàn)與高通量測序相結(jié)合的方法等.

生物信息學(xué)軟件主要根據(jù)RNA序列保守性、sRNA-mRNA堿基配對及結(jié)合自由能、RNA二級結(jié)構(gòu)等因素預(yù)測sRNA的靶基因，是最簡單、快速的靶基因預(yù)測方法.迄今為止，有TargetRNA2[23]、CopraRNA/IntaRNA[24]和sTarPicker[25]等軟件被開發(fā)用于預(yù)測sRNA的靶mRNA，不同軟件預(yù)測方式不同，預(yù)測出的靶基因有時差異較大.此外，由于大部分預(yù)測軟件都是基于大腸桿菌及沙門氏菌中已經(jīng)鑒定的sRNA及靶基因進(jìn)行學(xué)習(xí)的，因此，用于其他非模式菌以及革蘭氏陽性菌也可能出現(xiàn)較多假陽性結(jié)果，給后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證造成干擾.

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）是目前使用最多的靶基因篩選方法，其一般流程是：1） 在宿主菌中轉(zhuǎn)入一個誘導(dǎo)型sRNA表達(dá)質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)入不含sRNA的空載體;2） 在細(xì)菌生長對數(shù)期誘導(dǎo)sRNA表達(dá)，短暫誘導(dǎo)后收集菌體提取總RNA;3） 將sRNA誘導(dǎo)表達(dá)菌株和對照菌株的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，比較找出誘導(dǎo)后上調(diào)或下調(diào)的基因，即為候選靶基因.不過，這種方法篩選到的是sRNA誘導(dǎo)表達(dá)后的差異基因，但無法區(qū)分這些差異基因來自于sRNA的直接調(diào)控還是間接調(diào)控.一般來說，采用較短的誘導(dǎo)時間（15～30 min）可以盡可能減少間接調(diào)控基因的RNA水平變化.此外，RNA-seq只能檢測mRNA水平發(fā)生變化的靶基因，無法獲得翻譯水平受到影響的靶基因.因此，該方法仍然具有一定的局限性.

實(shí)驗(yàn)與高通量測序相結(jié)合篩選靶基因的方法主要分為兩大類.一類是基于革蘭氏陰性菌中sRNA-mRNA結(jié)合通常需要伴侶蛋白（如RNA結(jié)合蛋白Hfq和ProQ）輔助、或結(jié)合后會招募核酸酶（如RNase E）參與mRNA降解等特性，通過免疫沉淀特定蛋白來捕獲sRNA-mRNA-蛋白復(fù)合體，再用RNA連接酶將配對的sRNA-mRNA首尾相連，最后對連接RNA進(jìn)行高通量測序.RIL-seq（RNA interaction by ligation and sequencing）[26]、CLASH（UV-crosslinking， ligation and sequencing of hybrids）等就是基于該原理設(shè)計(jì)的靶基因篩選策略，通過測序數(shù)據(jù)分析，理論上可以捕獲細(xì)胞特定時期天然狀態(tài)下所有sRNA的體內(nèi)靶標(biāo).另一類是基于革蘭氏陽性菌中sRNA-mRNA結(jié)合無固定結(jié)合蛋白這一特點(diǎn)，主要方法如MAPS（MS2-affinity purification coupled with RNA-Seq）[27].MAPS的原理是在sRNA上融合一段來自于噬菌體的RNA序列MS2，然后利用可結(jié)合MS2 RNA的蛋白進(jìn)行免疫共沉淀捕獲sRNA及其結(jié)合的靶mRNA或靶蛋白，最后通過RNA-seq或蛋白質(zhì)譜分析獲得靶基因.

這些通過高通量測序篩選獲得的靶基因，還需要進(jìn)行體外、體內(nèi)相互作用的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以確認(rèn)其可靠性.體外相互作用的檢測方法主要包括凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)EMSA、足跡法footprinting[28]以及趾紋法toeprinting[29]等，用于檢測RNA-RNA以及RNA-蛋白質(zhì)的相互作用.體內(nèi)相互作用實(shí)驗(yàn)主要是利用報(bào)告基因（GFP或lacZ）來檢測sRNA-mRNA的相互作用，是驗(yàn)證sRNA與靶mRNA相互作用最常用的方法.首先利用copraRNA/IntaRNA軟件預(yù)測二者的相互作用位點(diǎn)，由于大部分sRNA與靶mRNA的結(jié)合位于靶mRNA的5UTR或起始密碼子附近的區(qū)域，因此，可以構(gòu)建靶基因5UTR及起始密碼子附近區(qū)域與報(bào)告基因編碼區(qū)融合的表達(dá)質(zhì)粒，sRNA誘導(dǎo)表達(dá)單元可以與報(bào)告基因構(gòu)建在同一個載體上，也可以構(gòu)建在不同的載體上.將含有sRNA以及融合報(bào)告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一個細(xì)胞，通過sRNA誘導(dǎo)前后報(bào)告基因表達(dá)水平的變化來判斷sRNA是否調(diào)控該mRNA.體內(nèi)相互作用實(shí)驗(yàn)不僅可以驗(yàn)證sRNA對靶基因的調(diào)控，還可以通過堿基突變方式尋找sRNA-mRNA的結(jié)合位點(diǎn)，因此成為檢驗(yàn)sRNA-mRNA相互作用最可靠的方法.

4細(xì)菌sRNA的作用機(jī)制及生物學(xué)功能

細(xì)菌sRNA的表達(dá)通常受不同生長時期或各種脅迫因素的誘導(dǎo)，sRNA水平在某種特定條件下達(dá)到最高.當(dāng)sRNA被誘導(dǎo)產(chǎn)生后，可通過不同方式調(diào)控靶基因的表達(dá).通常情況下，少數(shù)sRNA直接與蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮調(diào)控功能，大多數(shù)sRNA通過堿基配對與靶基因mRNA結(jié)合對其進(jìn)行調(diào)控，最新的研究顯示，sRNA還可以通過結(jié)合其他sRNA發(fā)揮調(diào)控功能.

4.1sRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合 這類sRNA在體內(nèi)通過模擬靶蛋白的天然底物結(jié)構(gòu)，與底物競爭性結(jié)合靶蛋白從而影響靶蛋白的功能.例如大腸桿菌全局性調(diào)控蛋白CsrA是一種RNA結(jié)合蛋白，可結(jié)合在mRNA分子上進(jìn)而影響其穩(wěn)定性或翻譯，CsrA的結(jié)合嚴(yán)格依賴于RNA上的GGA基序.非編碼sRNA CsrB上含有多個GGA基序可同時結(jié)合超過18個CsrA，從而與mRNA競爭性結(jié)合CsrA，釋放CsrA對靶mRNA的調(diào)控.例如大腸桿菌glgCAP操縱子參與糖原合成，CsrA與glgC的SD序列結(jié)合，抑制glgC mRNA的翻譯并加速glgCAP mRNA降解，導(dǎo)致糖原合成減少.當(dāng)CsrB大量表達(dá)時，CsrB螯合CsrA釋放glgCAP mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而促進(jìn)mRNA翻譯，使糖原合成增加[5，30]（圖1）.與CsrB和CsrA類似的sRNA和RNA結(jié)合蛋白廣泛存在于多種細(xì)菌的基因組中，例如熒光假單胞菌有3個CsrB類似sRNA（RsmX/Y/Z）和兩個CsrA類似蛋白（RsmA/E），表明這種sRNA與蛋白結(jié)合的調(diào)控機(jī)制在細(xì)菌中是常見的[31].此外，6S RNA也是一個研究比較清楚的與蛋白結(jié)合的sRNA，其二級結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的DNA構(gòu)象類似，可以競爭結(jié)合σ70 RNA聚合酶（Eσ70），從而影響相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[32-34].大腸桿菌的Eσ70主要負(fù)責(zé)對數(shù)生長期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)細(xì)菌生長進(jìn)入穩(wěn)定期，6S RNA大量產(chǎn)生并螯合Eσ70，使依賴于Eσ70的對數(shù)期基因轉(zhuǎn)錄關(guān)閉，而依賴于其他σ因子的穩(wěn)定期或脅迫基因轉(zhuǎn)錄得以開啟（圖1）.6S RNA在原核生物中高度保守，枯草芽孢桿菌有兩個6S RNA同源RNA，分別為6S-1和6S-2[35-36]，二者均可以與RNA聚合酶結(jié)合抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄.

4.2sRNA與mRNA結(jié)合 順式編碼sRNA通常由蛋白基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，大多是通過高通量測序被發(fā)現(xiàn)的，研究最多的是細(xì)菌的毒素-抗毒素系統(tǒng).細(xì)菌毒素蛋白基因反義鏈編碼的抗毒素實(shí)質(zhì)是一個非編碼sRNA，抗毒素sRNA與毒素mRNA完全配對，影響mRNA的穩(wěn)定性或翻譯，從而中和毒素[37].例如大腸桿菌I型毒素-抗毒素系統(tǒng)TisAB/IstR-1，在正常生長條件下，抗毒素sRNA IstR-1（70 nt）表達(dá)，通過其5端的25個堿基與毒蛋白tisAB mRNA的5UTR互補(bǔ)配對，抑制翻譯并招募RNase III加速其降解，使毒蛋白低表達(dá)細(xì)菌得以正常生長.在SOS應(yīng)激條件下，IstR-1表達(dá)水平下降，tisAB mRNA持續(xù)翻譯促進(jìn)毒蛋白積累，導(dǎo)致細(xì)菌生長減緩[38-39].枯草芽孢桿菌染色體上的原噬菌體區(qū)域編碼的I型毒素-抗毒素系統(tǒng)BsrG/SR4也具有類似的調(diào)控機(jī)制[40].除了毒素-抗毒素系統(tǒng)外，地衣芽孢桿菌的枯草菌素家族蛋白酶基因apr的反義鏈可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生sRNA AprA，它與蛋白酶基因mRNA相互作用抑制其翻譯，從而降低蛋白酶水平[41].

反式編碼sRNA在細(xì)菌中數(shù)量最多，通過部分堿基配對調(diào)控靶mRNA的表達(dá)，其作用機(jī)制主要包括以下4種方式（圖2）：1）sRNA與mRNA結(jié)合后會招募核糖核酸酶對sRNA-mRNA復(fù)合體進(jìn)行降解，促進(jìn)靶mRNA的降解.例如在α變形桿菌中，細(xì)胞生長到穩(wěn)定期以及處于脅迫條件時，sRNA StsR高表達(dá)，然后與細(xì)胞分裂/細(xì)胞壁基因簇dcw mRNA的5UTR結(jié)合，招募內(nèi)切核酸酶RNase E切割dcw mRNA，進(jìn)而加速外切核酸酶對mRNA的降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂速度減慢[42].2）sRNA結(jié)合封閉靶mRNA的核酸酶切割位點(diǎn)，增加mRNA的穩(wěn)定性.如在腸沙門氏菌中，細(xì)菌通過改變細(xì)胞膜性質(zhì)來抵抗外界環(huán)境的變化，基因cfa1（編碼環(huán)丙烷脂肪酸合酶）參與細(xì)胞膜重塑過程.在正常生長過程中，sRNA RydC可與Hfq共同作用結(jié)合在cfa1 mRNA的RNase E識別位點(diǎn)，保護(hù)cfa1 mRNA免遭RNase E切割，從而維持細(xì)胞在生長過程中細(xì)胞膜的特性[43].3）sRNA結(jié)合于靶mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)及附近，阻止核糖體與mRNA結(jié)合，從而抑制靶mRNA的翻譯.該方式是sRNA最主要的作用方式，也是生物信息學(xué)預(yù)測sRNA靶基因的一個重要參數(shù).如大腸桿菌的sRNA Spot 42，長度為109 nt，特異性結(jié)合在操縱子galETKM mRNA的galK（編碼半乳糖激酶）的翻譯起始區(qū)域，阻斷核糖體結(jié)合抑制galK翻譯，使半乳糖激酶與UDP-半乳糖差向異構(gòu)酶（由galE編碼）的比率發(fā)生改變，從而適應(yīng)不同的生存環(huán)境[44].4）sRNA與mRNA的5UTR結(jié)合，改變5UTR區(qū)的構(gòu)象使核糖體結(jié)合位點(diǎn)得以暴露，促進(jìn)靶基因的翻譯.如在鐵離子不足的條件下，大腸桿菌sRNA RyhB高表達(dá)，與大腸桿菌素（colicin）受體基因cirA mRNA的5UTR結(jié)合暴露核糖體結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)cirA mRNA的翻譯，使細(xì)菌對大腸桿菌素更加敏感[45].

4.3雙功能sRNA 傳統(tǒng)意義上，sRNA為不編碼蛋白的非編碼RNA，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)個別sRNA也可以作為mRNA編碼小肽行使功能.迄今為止，共發(fā)現(xiàn)5個雙功能sRNA，即大腸桿菌的SgrS[46]、金黃色葡萄球菌的RNA III[47]和Psm-mec[48]、膿性鏈球菌的Pel RNA[49]以及枯草芽孢桿菌的SR1[50]，其中SgrS的特性及功能在大腸桿菌和沙門氏菌中研究得較清楚.細(xì)菌利用細(xì)胞膜上的PTS系統(tǒng)將葡萄糖運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)，同時磷酸化生成6-磷酸葡萄糖（G6P），當(dāng)糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝不能協(xié)調(diào)匹配，就可能導(dǎo)致胞內(nèi)G6P積累，產(chǎn)生細(xì)胞毒性.在G6P脅迫下，轉(zhuǎn)錄因子SgrR大量產(chǎn)生并激活sRNA SgrS的轉(zhuǎn)錄，SgrS可與PTS系統(tǒng)的葡萄糖滲透酶基因ptsG mRNA的SD序列結(jié)合阻止核糖體結(jié)合，并招募RNase E加速mRNA降解，從而抑制新的PtsG蛋白合成.此外，sRNA SgrS還編碼一個長度僅為43個氨基酸的小肽SgrT，SgrT可與細(xì)胞膜上已經(jīng)存在的PtsG蛋白結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)活性[2]（圖3）.SgrS的這兩個功能似乎是互斥的，即一個SgrS分子只能以一種方式發(fā)揮作用，表現(xiàn)出對G6P脅迫響應(yīng)的時間順序：即SgrS首先以sRNA形式與靶mRNA配對快速響應(yīng)脅迫，而SgrT蛋白要在脅迫后30 min才產(chǎn)生，進(jìn)一步發(fā)揮抑制PtsG蛋白活性的功能.

4.4作為sRNA“海綿”間接調(diào)控靶基因的表達(dá) sRNA除了結(jié)合靶蛋白和靶mRNA，還可以作為RNA“海綿”，通過結(jié)合具有調(diào)控功能的sRNA，間接調(diào)控靶mRNA的表達(dá).例如沙門氏菌sRNA SroC，由Glu/Asp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白操縱子gltIJKL的gltI mRNA的3端加工產(chǎn)生，可以競爭結(jié)合具有全局性調(diào)控功能的sRNA GcvB，形成sRNA-sRNA配對，進(jìn)而招募RNase E對GcvB進(jìn)行降解，以緩解GcvB對氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝相關(guān)基因（也包括gltIJKL mRNA）的抑制作用[51]（圖4）.此外，SroC還可以結(jié)合sRNA MgrR，釋放其對eptB mRNA的抑制作用，影響細(xì)菌對多黏菌素B的敏感性[52].枯草芽孢桿菌中一個獨(dú)立轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的sRNA RosA也可作為RNA海綿，結(jié)合至少兩種sRNA，即參與氧化脅迫調(diào)節(jié)的RoxS以及參與鐵脅迫調(diào)節(jié)的FsrA.RosA的轉(zhuǎn)錄受到碳代謝關(guān)鍵調(diào)控因子CcpA的抑制，在以阿拉伯糖為碳源時，CcpA表達(dá)受到抑制，使RosA的轉(zhuǎn)錄增加，RosA競爭性結(jié)合RoxS，從而緩解RoxS對TCA循環(huán)以及細(xì)胞呼吸鏈相關(guān)基因的抑制作用，由此將RoxS對氧化脅迫的調(diào)控作用與碳代謝又聯(lián)系起來[53].

4.5sRNA參與多個代謝通路的協(xié)同控制 反式編碼sRNA通過短的不完全堿基配對與靶mRNA結(jié)合，因此，同一個sRNA可以調(diào)節(jié)相關(guān)通路的多個基因，協(xié)同控制相應(yīng)的生理過程.sRNA參與細(xì)菌鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控是研究得比較深入的案例.鐵元素是絕大多數(shù)生命必需的營養(yǎng)物質(zhì)，通常以蛋白輔因子形式存在，大腸桿菌一般擁有上百種含鐵蛋白，包括代謝酶、電子傳遞蛋白、感應(yīng)與調(diào)控蛋白等，參與一系列重要的生物過程.但鐵過量又會給生命帶來嚴(yán)重威脅，因此，細(xì)菌必須隨時維持細(xì)胞內(nèi)鐵元素水平的相對穩(wěn)定，即鐵穩(wěn)態(tài).轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Fur是最關(guān)鍵的鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子，此外，還有多個sRNA參與細(xì)菌鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，最著名的是sRNA RyhB.研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胞內(nèi)游離Fe2+濃度較低時，RyhB參與調(diào)控100多個基因的表達(dá)以維持胞內(nèi)鐵離子穩(wěn)態(tài)：1） 抑制非必需含F(xiàn)e2+蛋白的表達(dá)，包括約50個Fe-S蛋白基因以及21個Fe2+結(jié)合蛋白基因，以使細(xì)胞內(nèi)有限的鐵用于必需的生命過程;2） 抑制Fe-S簇合成的“管家”Isc系統(tǒng)，促進(jìn)脅迫響應(yīng)的Suf系統(tǒng)，節(jié)約鐵離子以滿足最需要的Fe-S蛋白合成;3） 促進(jìn)鐵攝取相關(guān)蛋白CirA以及ShiA的表達(dá)，增加細(xì)胞外鐵離子的輸入[54].

另一方面，同一個靶mRNA又可被不同的sRNA所調(diào)節(jié)，使細(xì)胞內(nèi)不同的靶mRNA通過sRNA連接成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)以協(xié)調(diào)細(xì)菌的生理和行為.在大腸桿菌和其他腸道細(xì)菌中，生物膜形成涉及對鞭毛合成和生物膜基質(zhì)合成兩個過程的反向控制，不同sigma因子、一系列級聯(lián)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子以及大量sRNA協(xié)同作用共同調(diào)控這一過程.其中，開啟鞭毛基因表達(dá)最上層的轉(zhuǎn)錄激活因子FlhDC，負(fù)責(zé)生長穩(wěn)定期基因轉(zhuǎn)錄的sigma因子σS，以及生物膜基質(zhì)重要組分菌毛合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子CsgD，這3個基因的mRNA被證明是多個sRNA的作用中心.研究顯示，flhDC mRNA可被3種sRNA ArcZ、OmrA/OmrB以及OxyS結(jié)合而抑制表達(dá)，被McaS結(jié)合則促進(jìn)翻譯.σSmRNA可被sRNA DsrA、RprA 和ArcZ正調(diào)控，促進(jìn)菌毛及生物膜形成.csgD mRNA 可被sRNA McaS、RprA、GcvB、RydC、RybB和OmrA/OmrB負(fù)調(diào)控，抑制菌毛及生物膜形成[55]（圖5）.綜合來看，這些sRNA根據(jù)其對鞭毛及生物膜合成的調(diào)控效應(yīng)可分為4類：1） 促進(jìn)生物膜形成、下調(diào)鞭毛合成（如ArcZ）[56-57];2） 作用正好相反，即刺激鞭毛合成、干擾生物膜基質(zhì)合成（如McaS）[58];3） 下調(diào)這兩種功能（如OmrA/OmrB）[59];4） 在鞭毛和生物膜功能的控制中具有多種更復(fù)雜的影響（如RprA）[60].不同sRNA共同作用的最終效應(yīng)取決于sRNA和mRNA的表達(dá)時期、速率與水平、sRNA與mRNA結(jié)合力等多種因素[55].

5小結(jié)與展望

非編碼sRNA在細(xì)菌中廣泛存在，其調(diào)控作用遍及細(xì)菌的整個生命過程.在細(xì)菌基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)中，sRNA與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子等構(gòu)成多層級的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同作用使細(xì)菌對環(huán)境脅迫做出快速且精細(xì)的響應(yīng).目前，細(xì)菌sRNA的研究主要集中在大腸桿菌和沙門氏菌等革蘭氏陰性細(xì)菌，對革蘭氏陽性菌及非模式菌的sRNA研究還比較缺乏.對在實(shí)際應(yīng)用中具有重要價值的非模式菌（如致病菌、工業(yè)生產(chǎn)菌等）開展研究，探索sRNA如何調(diào)控細(xì)菌的致病性、耐藥性及脅迫應(yīng)答，不僅可以揭示更多參與不同生物學(xué)功能調(diào)控的sRNA，擴(kuò)展sRNA的多樣性，也將為其實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

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Biological Characteristics and Regulation Mechanisms

of Bacterial Non-coding Small RNAWANG Haiyan，HE Tingting，LI Haoyang（College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064， Sichuan）

ＡｂｓｔｒａｃｔBacterial non-coding small RNAs （sRNA） exist as relatively short transcripts （50-500 nt） that are transcribed but do not encode proteins. sRNA plays a post-transcriptional regulatory role on target genes mostly by imperfect base-pairing with target mRNA， and rarely by binding target protein. sRNA is involved in the regulation of many important physiological processes， such as amino acid metabolism and transport， stress response and virulence， etc.， forming a multi-level regulatory network with traditional transcription factors to enable bacteria responding quickly to environmental stress. Due to the important role of sRNA in bacterial regulatory network， the discovery of new sRNAs and revealing their regulatory mechanisms have become a hotspot in prokaryotic gene expression regulation research. This review summarizes the advance in screening， identification， regulatory mechanism and biological function of bacterial sRNA， hoping to provide a more comprehensive perspective for researchers of related fields.

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：bacteria; noncoding sRNA; post-transcriptional regulation

（編輯 鄭月蓉）