兩種不同方法提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體的比較

徐 彧， 徐海瑾， 李家瑞， 孔 斌， 李 卉， 陸 宏， 宋 輝

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)系，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，銀川 750004； 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，銀川 750004）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞[1]，源于機(jī)體發(fā)育不同階段的多個(gè)組織和器官中，如骨髓、脂肪、臍帶、胎盤(pán)、牙髓等[2]?；诘兔庖咴浴⒔M織來(lái)源多樣化、易于在體外分離并快速擴(kuò)增等優(yōu)勢(shì)[2-4]，MSCs 的研究和治療取得了一定進(jìn)展。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是較早發(fā)現(xiàn)并研究較為深入的一種MSCs[5]。研究[6]表明，MSCs 主要通過(guò)其所衍生的外泌體來(lái)發(fā)揮旁分泌修復(fù)作用。外泌體粒徑為30～150 nm，普遍存在于各種體液中，并攜帶親代細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、RNA 等重要物質(zhì)[7-8]，可以進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，并與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，MSCs 外泌體不僅具有與親代MSCs 相似的生物學(xué)作用，且免疫原性更低，更容易量化，并能在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中保持生物活性，克服了MSCs 的很多缺陷，有望替代MSCs 成為新型的無(wú)細(xì)胞療法。如何有效地制備外泌體，并保留其生物學(xué)特性，是進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用的重要前提。目前，提取外泌體的主要方法有超速差速離心法、ExoQuick-TCTM法、密度梯度離心法、色譜法等[11-13]，但均未形成規(guī)范化體系。本研究對(duì)大鼠BMMSCs 外泌體兩種提取方法（超速差速離心法與ExoQuick-TCTM法）進(jìn)行比較，以期篩選適合大鼠BMMSCs 外泌體的有效提取方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

超高速離心管、超速高速離心機(jī)（Thermo MTX150）購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；透射電子顯微鏡（HITACHI H-7650）購(gòu)于日本日立公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基（10565-018）購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；無(wú)外泌體血清（C3801-0100）購(gòu)于德國(guó)BI 公司；RIPA 裂解液（P0013B）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；油紅O 及茜素紅均購(gòu)于賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；CD63（PA5-92370）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；CD81（ab109201）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；β-actin（AP0060）購(gòu)自Bioworld 公司；Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（ab6721）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ExoQuick-TCTMExosome Precipitation Solution購(gòu)于System Biosciences 公司。

1.2 方法

1.2.1 原代BMMSCs 的分離及培養(yǎng) 取6 只SPF級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為100～150 g，麻醉處死后，乙醇浸泡5 min，轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，在無(wú)菌條件下，去除大鼠雙下肢腿部的皮膚和肌肉，分離出完整股骨和脛骨，置于無(wú)菌PBS 中。然后轉(zhuǎn)入裝有75%乙醇的無(wú)菌皿中30 s 后取出，PBS 液沖洗3次。剪掉股骨和脛骨的兩端，用注射器吸取完全培養(yǎng)基，少量多次沖洗髓腔，將沖洗液收集于離心管中，600×g離心5 min，將沉淀重懸于DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中，根據(jù)細(xì)胞密度用移液槍接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱。24 h 后半量換液，之后每隔2 d 換液，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%后，按1∶3 傳代，取3 代BMMSCs 用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMMSCs 的表面標(biāo)記物 用胰酶消化6 孔板中的3 代BMMSCs，4 ℃、600×g離心5 min，收集沉淀細(xì)胞，PBS 液洗滌2 次后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取3×105個(gè)BMMSCs 置于1.5 mL 離心管中（6 管），600×g離心5 min，去上清液，吸取200 μL，PBS 重懸細(xì)胞，其中4 管分別加入CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-PE 和CD90-PE 抗體各2 μL，剩余2 管分別加入IgG-FITC 和IgG-PE 同型對(duì)照抗體2 μL，渦旋數(shù)秒，避光孵育30 min，PBS 液沖洗2 次，最后用300 μL PBS 重懸細(xì)胞，30 min 內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果用FlowJo（Ver10.0）進(jìn)行分析。

1.2.3 BMMSCs 的分化功能鑒定 成骨誘導(dǎo)：使用適量0.1%明膠處理6 孔板，1 h 后吸掉明膠，待6 孔板底面晾干后按一定密度接種3 代BMMSCs，當(dāng)細(xì)胞匯合度至60%～70%時(shí)，吸棄原培養(yǎng)基，更換為成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每2 d 換液1 次，密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化，誘導(dǎo)27 d 后進(jìn)行茜素紅染色。成脂誘導(dǎo)：將3 代BMMSCs 按一定密度接種于6 孔板中，每隔2 d換液1 次，直至細(xì)胞過(guò)融合，吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入2 mL 大鼠BMMSCs 成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液。3 d 后吸棄A 液，加入相同量的誘導(dǎo)分化B液。24 h 后吸棄B 液，換回A 液進(jìn)行誘導(dǎo)。A 液和B 液交互作用，每天觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，鏡下可觀察到脂滴時(shí)，停止誘導(dǎo)，進(jìn)行油紅O染色。

1.2.4 BMMSCs 外泌體的分離提取 取3 代BMMSCs接種于T-75 培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞匯合度至80%時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)基，更換為不含外泌體血清的培養(yǎng)基，進(jìn)一步培養(yǎng)48 h，于預(yù)冷的離心管中收集細(xì)胞上清液。將上清液分為兩份，每份45 mL，分別進(jìn)行兩種方法BMMSCs 外泌體的提取。超速差速離心法：將BMMSCs 上清液置于4 ℃條件下差速離心，依次經(jīng)過(guò)300×g離心10 min，2 000×g離心20 min，12 000×g離心30 min 去除殘留細(xì)胞和細(xì)胞碎片；收集上清，經(jīng)0.22 μm 濾篩過(guò)濾，除去微生物及大囊泡；最后用超高速離心機(jī)120 000×g離心90 min，棄上清液，將外泌體沉淀重懸于PBS中。ExoQuick-TCTM法：將BMMSCs 上清液3 000 ×g離心15 min，去除殘留細(xì)胞和細(xì)胞碎片。參考說(shuō)明書(shū)，按樣本量∶外泌體試劑盒=5∶1 的比例，向上清液中加入適量提取試劑，并顛倒試管混勻，置于4 ℃下過(guò)夜。離心生物液混合物，1 500×g30 min。棄上清液，將外泌體沉淀重懸于PBS液中。

1.2.5 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）鑒定BMMSCs 外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu) 取20 μL 外泌體懸液滴于銅網(wǎng)上，在室溫下孵育5 min，然后將銅網(wǎng)轉(zhuǎn)至2.5%戊二醛中固定5 min，并用去離子水洗滌。在室溫下用4%醋酸鈾負(fù)染外泌體1 min，用PBS 洗滌網(wǎng)格3 次，風(fēng)干5 min。在TEM 下觀察獲取圖片。

1.2.6 BMMSCs 外泌體蛋白濃度提取及濃度測(cè)定 加等量RIPA 裂解液于兩種方法提取的BMMSCs 外泌體中，置于冰上30 min，每隔4 min劇烈振蕩30 s。30 min 后12 000×g4 ℃離心5 min，提取外泌體蛋白懸液，隨后按BCA 試劑盒的操作步驟，測(cè)定外泌體蛋白的濃度。

1.2.7 Western blot 測(cè)定BMMSCs 外泌體表面標(biāo)記物 本研究采用外泌體中常見(jiàn)的兩種標(biāo)志蛋白CD63 和CD81，對(duì)兩種方法提取的BMMSCs外泌體進(jìn)行Western blot 鑒定。將兩種方法提取的BMMSCs 外泌體總蛋白按30 μg 定量并進(jìn)行變性處理。變性后的蛋白樣品按20 μL/孔上樣，經(jīng)SDS-PAGE 分離凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂乳封閉膜1 h 后加入特異性一抗CD63（1∶1 000）、CD81（1∶1 000）孵育過(guò)夜。再用TBST 緩沖液洗滌3 次后，將膜與二抗在室溫下孵育1 h。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光免疫反應(yīng)條帶。

1.2.8 納米顆粒跟蹤分析儀（nanoparticle tracking analysis，NTA）測(cè)定BMMSCs 外泌體顆粒濃度和粒徑分布 將分離后的BMMSCs 外泌體按1∶100 比例重懸到1 mL 無(wú)菌水中，應(yīng)用NTA 分析記錄BMMSCs 外泌體的直徑和大小分布。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMMSCs 的細(xì)胞形態(tài)觀察

在倒置顯微鏡下，原代BMMSCs 大小不一，呈梭形貼壁生長(zhǎng)，分布不均（圖1A）；3 代BMMSCs呈梭形、魚(yú)排狀旋渦排列，分布較均勻（圖1B）。

圖1 BMMSCs 細(xì)胞形態(tài)（×40）

2.2 BMMSCs 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，BMMSCs 高表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)記物CD44 和CD90，而造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34 和CD45 表達(dá)較低，見(jiàn)圖2。

圖2 BMMSCs 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

2.3 BMMSCs 分化能力檢測(cè)

BMMSCs 經(jīng)成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)27 d 后，茜素紅染色見(jiàn)大量礦鹽沉積及鈣化結(jié)節(jié)被染成棕色（圖3A）。BMMSCs 經(jīng)成脂分化培養(yǎng)基培養(yǎng)26 d后，經(jīng)過(guò)紅油O 染色可觀察到細(xì)胞集落群中充滿脂滴的脂肪細(xì)胞（圖3B）。

圖3 3 代BMMSCs 定向誘導(dǎo)分化（×200）

2.4 TEM 檢測(cè)外泌體的形態(tài)特征

TEM 鏡下可見(jiàn)，兩種方法均能獲得具有雙層膜、茶托樣結(jié)構(gòu)的外泌體，內(nèi)部含有低電子密度物質(zhì)，直徑為30～150 nm。超速差速離心法提取的外泌體背景清晰，ExoQuick-TCTM法提取的外泌體背景雜亂，可見(jiàn)大量無(wú)立體結(jié)構(gòu)特征的白色顆粒，見(jiàn)圖4。鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)，超速差速離心法提取的外泌體數(shù)量高于ExoQuick-TCTM法（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩種方法提取BMMSCs 外泌體的濃度比較（ ±s）

表1 兩種方法提取BMMSCs 外泌體的濃度比較（ ±s）

與超速差速離心法相比*P<0.05。

方法 n 電鏡下數(shù)量/個(gè) 蛋白濃度/（mg·mL-1）超速差速離心法 3 13.53±2.55 12.43±0.98 ExoQuick-TCTM 法 3 1.60±0.20* 4.30±0.48*

圖4 TEM 下觀察兩種方法提取的BMMSCs 外泌體的形態(tài)特征（bar=100 nm）

2.5 BMMSCs 外泌體蛋白檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=18.844x（x為樣品吸光值，y為樣品蛋白濃度），r2=0.999 5。超速差速離心法提取的外泌體的蛋白濃度高于ExoQuick-TCTM法（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.6 Western blot 鑒定

Western blot 結(jié)果顯示，超速差速離心法提取的外泌體高表達(dá)標(biāo)志蛋白CD63 和CD81，結(jié)果與外泌體的生物學(xué)特性相符。ExoQuick-TCTM法提取的外泌體不表達(dá)標(biāo)志蛋白CD63 和CD81，見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot 檢測(cè)兩種方法提取的BMMSCs 外泌體表面標(biāo)記物

2.7 NTA 分析外泌體的顆粒濃度及粒徑大小

NTA 分析超速差速離心法和ExoQuick-TCTM法所得外泌體顆粒濃度分別為（399.00±55.56）×108particles·mL-1和（7.94±0.50）×108particles·mL-1，均為單峰，峰值分別為（109.53±6.45）nm 和（139.27±1.45）nm，呈正態(tài)分布特征，見(jiàn)圖6。兩種方法提取的外泌體都符合外泌體的正常粒徑大小。超速差速離心法提取的外泌體粒徑較ExoQuick-TCTM法偏小，顆粒濃度較ExoQuick-TCTM法高（P均＜0.05）。

圖6 NTA 分析檢測(cè)兩方法提取的BMMSCs 外泌體

3 討論

50 多年前，研究人員首次在小鼠骨髓中發(fā)現(xiàn)了成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞（后被Arnold L. Caplan命名為MSCs），并證明其能夠形成集落樣結(jié)構(gòu)，并分化為骨組織、軟骨和脂肪[1，14]。隨著研究深入，研究人員在機(jī)體不同的組織來(lái)源中發(fā)現(xiàn)MSCs，如脂肪組織、臍帶、牙髓等[2]。由于MSCs 具有多向分化潛能，同時(shí)具有易獲取、抗炎、可分泌營(yíng)養(yǎng)因子等優(yōu)點(diǎn)[15]，且在臨床中應(yīng)用胚胎干細(xì)胞（embryonal stem cells，ESCs）不存在引起倫理問(wèn)題和致癌風(fēng)險(xiǎn)。因此，MSCs 為再生醫(yī)學(xué)研究帶來(lái)了新的希望。BMMSCs 是較早發(fā)現(xiàn)并研究較為深入的一種MSCs[16]。為滿足研究需求，本研究采用全骨髓貼壁細(xì)胞分離法分離培養(yǎng)原代大鼠BMMSCs[17-18]，建立BMMSCs 的原代和傳代培養(yǎng)方法，并進(jìn)行鑒定。在本實(shí)驗(yàn)中，鏡下形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，原代分離的BMMSCs 細(xì)胞呈貼壁、集落趨化性生長(zhǎng)，符合MSCs 的特性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)3 代BMMSCs 標(biāo)志蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，BMMSCs 高表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)記物CD44、CD90，而低表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34、CD45。此外，對(duì)MSCs 多向分化潛能進(jìn)行鑒定，茜素紅染色和油紅O 染色結(jié)果表明，BMMSCs 具有向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化的潛能。綜上可知，本研究成功地建立了BMMSCs 原代分離和傳代培養(yǎng)方法，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了保障。

雖然MSCs 免疫原性低，但靜脈輸注后絕大部分都?xì)w巢至肺[19]，能成功遷移并定向分化修補(bǔ)受損組織的比例非常有限，而且細(xì)胞存活時(shí)間短，所以推測(cè)MSCs 主要通過(guò)旁分泌某種生物因子，從而發(fā)揮修復(fù)作用[17-19]。外泌體是由大多數(shù)細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，直徑為30～150 nm，其內(nèi)包含microRNA、mRNA、膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)[20]，所以外泌體可通過(guò)表面抗原與靶細(xì)胞受體的相互作用或外泌體中RNA 和蛋白質(zhì)向靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，從而在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮作用[21-23]。研究[24]發(fā)現(xiàn)，外泌體表面分布著一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，如抗原結(jié)合蛋白、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶等。外泌體還可將其攜帶的生物分子運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞，進(jìn)而觸發(fā)相關(guān)生物因子的釋放，維持機(jī)體內(nèi)正常生理功能。因此，外泌體為許多疾病的治療提供了新的可能性[25]。研究[10]證明，MSCs 來(lái)源的外泌體可發(fā)揮MSCs 相似的功能，且與MSCs 相比，MSCs 外泌體具有穩(wěn)定性好、易量化和保存、能通過(guò)血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)。如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需選擇有效的外泌體提取方法是進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)。本研究收集BMMSCs 培養(yǎng)上清液，采用超速差速離心與ExoQuick-TCTM兩種方法提取外泌體。超速差速離心法主要是利用細(xì)胞分泌囊泡的沉降率不同，梯度離心，分別去除殘留細(xì)胞和細(xì)胞碎片，并經(jīng)0.22 μm 濾篩純化，進(jìn)一步去除上清液中的微生物及大囊泡，再超速離心提取外泌體。ExoQuick-TCTM法主要是加入一種聚合物，該聚合物具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可將上清液中一定直徑的囊泡捕獲，從而提取外泌體。本研究結(jié)果表明，超速差速離心法和ExoQuick-TCTM法均可成功提取出一定量的BMMSCs 外泌體。但兩種提取方法相比，超速差速離心法提取的BMMSCs外泌體顆粒數(shù)量更多、濃度及純度更高。TEM 及NTA 檢測(cè)分析表明，ExoQuick-TCTM法提取的外泌體粒徑較超速差速離心法提取的外泌體粒徑大，可能因ExoQuick-TCTM法加入的聚合物與外泌體結(jié)合形成復(fù)合物，致其粒徑增大。采用外泌體中常見(jiàn)的兩種標(biāo)志蛋白CD63 和CD81 對(duì)兩種方法提取的BMMSCs 外泌體進(jìn)行Western blot檢測(cè)[12，26-28]，結(jié)果表明，ExoQuick-TCTM法提取的外泌體不表達(dá)標(biāo)志蛋白CD63 及CD81。其原因可能為：1）雖然BCA 測(cè)得的ExoQuick-TCTM法提取的外泌體蛋白濃度為（4.30±0.48）mg·mL-1，但其純度較低，正如TEM 鏡下所見(jiàn)，ExoQuick-TCTM法提取的外泌體存在大量無(wú)立體結(jié)構(gòu)的白色顆粒，考慮為細(xì)胞碎片或其他囊泡等雜質(zhì)；2）Exo-Quick-TCTM法提取外泌體時(shí)加入的聚合物包裹在外泌體外部，且此聚合物較難去除，可能會(huì)影響外泌體的表征的鑒定。

綜上所述，超速差速離心法提取的BMMSCs外泌體，雖然程序繁雜、用時(shí)長(zhǎng)，但在提取過(guò)程中無(wú)須額外添加化學(xué)物質(zhì)，不存在潛在未知的雜質(zhì)污染等因素影響外泌體質(zhì)量的不穩(wěn)定，而且相較于ExoQuick-TCTM提取法，超速差速離心法提取的外泌體含量和純度相對(duì)較高、成本較低，在實(shí)際研究中更具有可重復(fù)性，可作為一種合理的分離方法。