H2O2 誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)TM3 細(xì)胞鐵死亡模型的構(gòu)建

王 佳， 馬麗媛， 母春蘭， 劉春蓮， 焦海燕

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)教育部生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)系，銀川 750004； 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖中心，銀川 750004）

近年來，不育已成為世界范圍內(nèi)的重要健康問題之一。近50%的不育與男性因素有關(guān)[1]，而活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的睪丸組織損傷是其主要原因[2]。睪丸組織細(xì)胞質(zhì)膜中豐富的多不飽和脂肪酸易受ROS 攻擊[3-4]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)過量的ROS 打破氧化-抗氧化平衡時(shí)，則會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）。目前研究[5]發(fā)現(xiàn)，由ROS 導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxide，LPO）積累是引發(fā)鐵死亡的關(guān)鍵因素。鐵死亡是一種鐵依賴的LPO 積累引起的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡。不同于其他的細(xì)胞死亡形式，當(dāng)發(fā)生鐵死亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Fe2+濃度升高，LPO 水平增加，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性降低[6]，線粒體萎縮，膜密度增大，嵴減少或消失[7]。有研究[8-9]顯示，男性不育患者精子中ROS 積累、GPX4 活性降低，推測(cè)OS 導(dǎo)致的生殖損傷與鐵死亡有關(guān)，但目前尚缺乏直接證據(jù)，且缺乏用于相關(guān)研究的細(xì)胞模型。因H2O2極易透過細(xì)胞膜，可與細(xì)胞內(nèi)的Fe2+通過Fenton 反應(yīng)使細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS 和丙二醛（malondialdehyde，MDA）[10]，常被用于誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生OS。本研究擬用H2O2誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)TM3 細(xì)胞建立鐵死亡細(xì)胞模型，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究鐵死亡對(duì)生殖細(xì)胞的影響及抗氧化藥物對(duì)雄性生殖細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠睪丸間質(zhì)TM3 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)（北納公司代理）；全蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、MDA 試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒與ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；LPO 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；DMSO 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；50%H2O2購(gòu)自四川金山制藥有限公司；青鏈霉素購(gòu)自Solarbio 公司；FBS 胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone 公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；GSH 過氧化物酶4 抑制劑（RSL3）與鐵死亡蛋白抑制劑（iFSP1）購(gòu)自MCE 公司；Phen-Green-SK（25393）熒光探針購(gòu)自Cayman 公司；MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) TM3 細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，棄原液，用PBS 緩沖液沖洗，加入0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化，后加入培養(yǎng)基終止消化，以1∶3 進(jìn)行傳代處理，補(bǔ)足培養(yǎng)液，混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 H2O2處理及細(xì)胞活力檢測(cè) 將細(xì)胞按5×105個(gè)/mL 濃度接種于96 孔板，100 μL/孔，復(fù)孔3 個(gè)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞密度長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，向96 孔板中加入含不同H2O2濃度（0、1、2 mmol·L-1）的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)1 h。按上述方法進(jìn)行鋪板及培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，向96 孔板中分別加入MTS 20 μL /孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h；取出96 孔板，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度（OD）值。

1.2.3 OS 特征指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分組為TM3 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)組（T 組）和2 mmol·L-1H2O2處理TM3 細(xì)胞1 h 組（H2O2-T 組）。各組細(xì)胞去上清液，分別加入DCFH-DA 稀釋液（按1∶500 用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋），洗滌，消化收集細(xì)胞，500 μL PBS 重懸細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 生成情況。將細(xì)胞用PBS 重懸，加入全蛋白裂解液，在冰浴條件下超聲破碎，離心取上清液，獲得蛋白原液。使用BCA 法檢測(cè)并計(jì)算待測(cè)樣本蛋白濃度。按照MDA 試劑盒說明書分別設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管與對(duì)照管，并按要求分別進(jìn)行加樣，95 ℃水浴40 min 后冷卻并離心取上清液，在532 nm 處檢測(cè)OD 值并按照公式計(jì)算MDA 含量。組織中MDA 含量（nmol·mgprot-1）=（OD測(cè)定-OD對(duì)照）/（OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol·mL-1）÷待測(cè)樣本蛋白濃度（mgprot·mL-1）。使用SOD 測(cè)定試劑盒，分別設(shè)置對(duì)照孔、對(duì)照空白孔、測(cè)定孔和測(cè)定空白孔。按一定比例稀釋待測(cè)蛋白原液，并根據(jù)說明書進(jìn)行加樣，37 ℃孵育20 min，在波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)OD 值，并根據(jù)公式計(jì)算SOD 抑制率，按照定義，在該反應(yīng)體系中SOD 抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD 活力單位。最后得出SOD 活性。SOD 抑制率（%）=［（A對(duì)照-A對(duì)照空白）-（A測(cè)定-A測(cè)定空白）］/（A對(duì)照-A對(duì)照空白）×100%；SOD 活性（U·mgprot-1）=SOD 抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（0.24 mL/0.02 mL）÷待測(cè)樣本蛋白濃度（mgprot·mL-1）。

1.2.4 LPO 水平測(cè)定 設(shè)置分組為T 組；H2O2-T組；1 μmol·L-1RSL3 處 理TM3 細(xì) 胞1 h 組（RSL3-T 組）；3 μmol·L-1iFSP1 處理TM3 細(xì)胞24 h 組（iFSP1-T 組）。按1.2.3 中方法提取細(xì)胞蛋白原液，并采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。使用LPO檢測(cè)試劑盒，分別設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管，按照說明書加樣，混勻后于45 ℃孵育60 min，離心后取上清，在586 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值，并根據(jù)公式計(jì)算LPO 含量。LPO 含量（μmol·gprot-1）=（A測(cè)定-A測(cè)定空白）/（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 μmol·L-1）÷待測(cè)樣本蛋白濃度（gprot·mL-1）。1.2.5 細(xì)胞鐵含量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)按照1.2.4 進(jìn)行分組。PBS 重懸細(xì)胞后，加入Phen-Green-SK 10 μmol·L-1，37 ℃避光孵育10 min，PBS 洗滌后重懸細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，使用Hoechst 33342 孵育細(xì)胞5 min，棄去染液，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。激光共聚焦觀察時(shí)選擇波長(zhǎng)488 nm，觀察到綠色熒光。

1.2.6 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 實(shí)驗(yàn)按照1.2.4進(jìn)行分組。將細(xì)胞離心去上清后加固定液。用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗3 次，2%鋨酸固定后再次用磷酸緩沖液沖洗。沖洗后的樣本經(jīng)過脫水、滲透、包埋，通過超薄切片機(jī)定位切片，使用2%醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色后，通過透射電鏡觀察、拍片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖及統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2 對(duì)TM3 細(xì)胞活力的影響

用0、1、2 mmol·L-1的H2O2分別處理TM3 細(xì)胞1 h，與0 mmol·L-1相比，用1、2 mmol·L-1H2O2處理后的細(xì)胞活力均降低（P均＜0.01），通過計(jì)算，IC50為2 mmol·L-1，見圖1。因此，本研究選擇2 mmol·L-1H2O2作用1 h 構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)TM3 細(xì)胞鐵死亡細(xì)胞模型。

圖1 不同H2O2 濃度對(duì)TM3 細(xì)胞活力的影響

2.2 H2O2 對(duì)TM3 細(xì)胞氧化水平的影響

與T 組相比，H2O2-T 組ROS 水平、MDA 含量均上升（P均＜0.001），SOD 活性下降（P＜0.001），見圖2。

圖2 H2O2 對(duì)TM3 細(xì)胞ROS、MDA 及SOD 水平的影響

2.3 H2O2 對(duì)TM3 細(xì)胞LPO 含量的影響

與T 組相比，H2O2-T 組、RSL3-T 組與iFSP1-T組LPO 含量均升高（P均＜0.001），見圖3。

圖3 H2O2 對(duì)TM3 細(xì)胞LPO 含量的影響

2.4 H2O2 對(duì)TM3 細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量的影響

與T 組相比，H2O2-T 組、RSL3-T 組與iFSP1-T組熒光強(qiáng)度均減弱（P均＜0.001），見圖4。同RSL3-T 組與iFSP1-T 組相比，H2O2-T 組熒光強(qiáng)度變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

圖4 H2O2 對(duì)TM3 細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量的影響

2.5 H2O2 對(duì)TM3 細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示，T 組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)飽滿，線粒體嵴清晰明顯；而H2O2-T 組、RSL3-T 組與iFSP1-T 組細(xì)胞線粒體均出現(xiàn)類似的形態(tài)變化。H2O2-T 組細(xì)胞線粒體發(fā)生皺縮變小、嵴減少、外膜破裂的現(xiàn)象。RSL3-T 組與iFSP1-T 組細(xì)胞線粒體也明顯變小，嵴減少或消失，部分線粒體外膜破裂，見圖5。

圖5 透射電鏡觀察不同藥物處理下TM3 細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化（bar=1 μm）

3 討論

鐵死亡是一種鐵依賴的LPO 積累引起的非凋亡形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡[5]。鐵死亡的發(fā)生是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)ROS 生成與降解的平衡失調(diào)所致。H2O2是一種分子質(zhì)量較小的ROS，極易通過細(xì)胞膜，可與細(xì)胞中不穩(wěn)定鐵池中游離的Fe2+發(fā)生Fenton 反應(yīng)，產(chǎn)生高活性的羥基自由基，促使ROS 積累及膜脂過氧化[11-13]，導(dǎo)致LPO 積累。MDA是脂質(zhì)過氧化最豐富的副產(chǎn)品之一，也是OS 的常用生物標(biāo)記物。MDA 可通過傳播和放大氧化損傷，加速細(xì)胞死亡[14]。SOD 是生物體內(nèi)的一種抗氧化金屬酶，可清除氧自由基，被用于評(píng)估機(jī)體抗氧化能力。當(dāng)羥基自由基過多，就會(huì)導(dǎo)致磷脂的過度氧化，MDA 含量上升，SOD 活性下降[15]。LPO 濃度的增加引起膜不穩(wěn)定性，甚至破裂，產(chǎn)生其他有毒性衍生物，最終導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡[16]。本研究使用H2O2處理TM3 細(xì)胞后，ROS、MDA和LPO 水平均升高，SOD 活性降低。表明細(xì)胞在高水平ROS 作用下，脂質(zhì)過氧化水平升高，抗氧化能力降低，可能引發(fā)鐵死亡。

鐵死亡是鐵離子依賴的細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果顯示，用H2O2、RSL3 與iFSP1 分別處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量較對(duì)照組均升高。RSL3 是一種靶向GPX4 的鐵死亡誘導(dǎo)劑[17-18]，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS 升高、LPO 增加而發(fā)生鐵死亡。鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1）具有脂質(zhì)抗氧化劑的作用，對(duì)GPX4 缺失引起的鐵死亡有保護(hù)作用，iFSP1 可誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生[19]。本研究中，H2O2處理組同RSL3 與iFSP1 分別誘導(dǎo)的鐵死亡陽(yáng)性細(xì)胞組相比，F(xiàn)e2+含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明H2O2干預(yù)組細(xì)胞Fe2+含量升高趨勢(shì)同鐵死亡誘導(dǎo)劑組一致，提示H2O2干預(yù)組細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。鐵死亡的主要形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞中線粒體變小，線粒體膜密度增高，線粒體嵴減少或消失，外膜破裂[7]。本研究結(jié)果顯示，用H2O2、RSL3 與iFSP1 分別處理細(xì)胞后，線粒體均明顯變小，嵴減少或消失，部分線粒體外膜破裂，提示H2O2誘導(dǎo)了鐵死亡。

綜上所述，本研究利用H2O2干預(yù)小鼠睪丸間質(zhì)TM3 細(xì)胞成功誘導(dǎo)OS 后，細(xì)胞呈現(xiàn)ROS、MDA、LPO 及Fe2+含量升高、線粒體變小皺縮、嵴減少或消失、外膜破裂等鐵死亡特征。提示H2O2誘導(dǎo)小鼠TM3 細(xì)胞鐵死亡模型構(gòu)建成功。