枸杞葉多糖調(diào)節(jié)T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞緩解過敏性哮喘小鼠氣道炎癥

白 敏， 吳建文， 張 穎， 張文靜， 王 琦， 趙嘉慶，2，3

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，銀川 750004； 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究中心，銀川 750004； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

過敏性哮喘是一種由IgE 介導(dǎo)的過敏性疾病，Th1/Th2 免疫失衡是導(dǎo)致過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]。哮喘患者會(huì)伴隨咳嗽、喘息、呼吸困難和胸悶等癥狀[2-3]。氣道炎癥主要是由遺傳易感個(gè)體在環(huán)境中過敏原暴露引起的[4]。蒿屬花粉（Artemisia pollen）變應(yīng)原是我國常見的花粉變應(yīng)原之一，在我國各地區(qū)都有分布，約11.3% 的呼吸道過敏患者對(duì)蒿屬花粉敏感[5]。其飄散期一般發(fā)生在春秋兩季，秋季最為嚴(yán)重[6]。在我國分布最廣的蒿屬花粉有三種：黃花蒿花粉（Artemisia annuapollen）、艾蒿花粉（Aretemisia Argyi levl.etvant）、大籽蒿花粉（Artemisia sieversianawilld）[7]。目前國內(nèi)外對(duì)于蒿屬花粉引起的過敏性哮喘研究較少，有待探究其致病機(jī)制并研究出具有針對(duì)性療效的藥物。

枸杞葉是茄科枸杞屬植物枸杞（lycium ChineseMill）及寧夏枸杞的干燥嫩葉[8]。枸杞葉多糖（lycium barbarum leaves polysaccharide，LBP）是枸杞葉中的一個(gè)主要藥用成分[9]，表現(xiàn)出廣泛的生物活性，如抗氧化劑[10]、神經(jīng)保護(hù)[11]、輻射防護(hù)[12]、肝保護(hù)[13]、抗骨質(zhì)疏松[14]和免疫調(diào)節(jié)活性[15]。本實(shí)驗(yàn)旨在探究LBP 對(duì)黃花蒿花粉引起的過敏性哮喘的影響，通過檢測炎性細(xì)胞浸潤水平，以及小鼠體內(nèi)Th1、Th2 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞占比的變化，為LBP 功效及治療過敏性哮喘新藥物的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用6～8 周齡的雌性BABL/c 小鼠40 只［合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006；倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：2019-121］，體質(zhì)量為18～25 g，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按照隨機(jī)抽樣的原則分為對(duì)照組、LBP 組、模型組、模型+LBP 組，每組10 只。對(duì)照組：正常小鼠灌胃等體積磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered aline，PBS）；LBP 組：正常小鼠灌胃等體積LBP；模型組：黃花蒿花粉引起的過敏性哮喘模型小鼠，灌服等體積PBS；模型+LBP 組：黃花蒿花粉引起的過敏性哮喘模型小鼠，灌服等體積LBP。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求，飼養(yǎng)在溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度45%～75% 的無特定病原體的動(dòng)物房內(nèi)。

1.2 材料與試劑

1.2.1 材料 本項(xiàng)目使用的LBP 從枸杞葉植物中提取，含量為60%，由寧夏森淼科技集團(tuán)股份有限公司提供；黃花蒿抗原提取液，濃度為0.712 mg·mL-1，購自北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2.2 試劑 氫氧化鋁凝膠，濃度為40 mg·mL-1，購自美國Thermo Fisher 公司；Ⅰ型膠原酶、RPMI 1640 培養(yǎng)基、紅細(xì)胞裂解液均購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞因子刺激劑，小鼠熒光抗體FITC 標(biāo)記的CD4、CD11c、MHC class Ⅱ（I-A/IE），APC 標(biāo) 記 的CD3、CD170（SiglecF）、CD206，PE 標(biāo)記的白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、F4/80，PerCP-Cy5.5 標(biāo)記的γ 干擾素（IFN-γ），PE-Cy7 標(biāo)記的CD11b，破膜液均購自美國BioLegend 公司。PE-Cy5.5 標(biāo)記的CD45 購自美國Invitrogen 公司。蘇木精-伊紅染色（hematoxylineosin staining，HE）試劑盒、過碘酸-雪夫染色（periodic acid-schiff stain，PAS）試劑盒、馬松染色試劑盒、磷酸鹽緩沖液均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；胎牛血清購自上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 構(gòu)造黃花蒿花粉引起的過敏性哮喘小鼠模型 在過敏性哮喘模型構(gòu)建前1 個(gè)月先給小鼠每天灌胃LBP 0.3 mL［100 mg·（kg·d）-1］直至造模結(jié)束小鼠被處以安樂死，對(duì)照組和模型組小鼠則以PBS 代替LBP。模型組、LBP 組在第31、38、45 天腹腔注射100 μL 的黃花蒿抗原（2 μg 黃花蒿過敏原蛋白與1 mg 氫氧化鋁溶劑）進(jìn)行致敏，第52～58 天每天進(jìn)行滴鼻激發(fā)，黃花蒿花粉抗原提取液調(diào)整為0.2 mg·mL-1雙側(cè)滴鼻，每側(cè)滴鼻10 μL；對(duì)照組、LBP 組采取同樣的方法和劑量用PBS 進(jìn)行致敏和滴鼻。第58 天滴鼻結(jié)束后由黃花蒿花粉引起的過敏性哮喘模型結(jié)束造模（圖1）。第59 天安樂處死小鼠，留取樣本。

圖1 黃花蒿花粉引起的過敏性哮喘小鼠造模方案

1.3.2 小鼠肺組織處理 處死小鼠后，打開小鼠胸腔，分離肺臟，右肺放入10 倍體積的4%多聚甲醛組織固定液中制作石蠟切片，隨后進(jìn)行HE染色、PAS 染色、馬松染色，染色后觀察肺組織結(jié)構(gòu)，炎性細(xì)胞浸潤水平，杯狀細(xì)胞黏液分泌情況及肺纖維化程度。左肺放入5 mL EP 管中，加入1 mL 提前配制好的Ⅰ型膠原酶，濃度為1 mg·mL-1，剪碎肺組織，放入氣浴恒溫振蕩器消化1 h，加入10 μL EDTA 終止消化。將消化后的肺組織倒入兩層300 目尼龍網(wǎng)膜中間。用300 目尼龍網(wǎng)膜過濾研磨，將細(xì)胞懸液收集到15 mL 離心管內(nèi)，4 ℃、350×g、離心5 min，棄上清，留沉淀。向沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液，混勻重懸，為保持細(xì)胞活性，放在冰上裂解5 min。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL。制備好的肺細(xì)胞懸液準(zhǔn)備進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)染色。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)染色方法 1）嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil granulocyte，EOS）染色：取100 μL 肺細(xì)胞懸液，加入表面抗體CD45、CD11c、CD170 混勻，冰上避光孵育30 min，經(jīng)預(yù)冷的染色緩沖液洗滌后，加入300 μL 固定液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測并分析EOS 細(xì)胞（CD45+CD11c-CD170+）。2）巨噬細(xì)胞染色：取100 μL 肺細(xì)胞懸液，先加入表面流式抗體F4/80、CD11b、MHC Ⅱ，冰上避光孵育30 min 后，加入1 mL 破膜液，離心棄上清，再加入100 μL 破膜液。隨后加入胞內(nèi)抗體CD206，室溫孵育30 min，經(jīng)預(yù)冷的染色緩沖液洗滌后，300 μL 固定液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測并分析M1 細(xì)胞（F4/80+CD11b+MHCⅡ+）、M2（F4/80+CD11b+CD206+）細(xì)胞占比。3）Th細(xì)胞染色：取300 μL 處理好的肺細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到48 孔板中，加入胞內(nèi)因子刺激劑離子霉素和佛波酯（PMA）37 ℃、5%CO2培養(yǎng)5 h。取100 μL 細(xì)胞懸液加入表面抗體，冰上避光孵育30 min，染色緩沖液洗滌后用100 μL 破膜液重懸，加入胞內(nèi)抗體，邊破膜邊染色，室溫孵育30 min，經(jīng)預(yù)冷的染色緩沖液洗滌后，300 μL 固定液重懸細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀分析Th1 細(xì)胞（CD3+CD4+IFN-γ+）、Th2 細(xì)胞（CD3+CD4+IL-4+）百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，不服從正態(tài)分布的資料采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺部病理學(xué)改變

2.1.1 肺組織HE 染色 肺組織HE 染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠比較，LBP 組無明顯變化，模型組小鼠肺組織支氣管管腔狹窄，肺泡腔及支氣管內(nèi)有大量的淋巴細(xì)胞及EOS 細(xì)胞浸潤；但模型+LBP 組干預(yù)的小鼠肺組織炎癥明顯減輕，支氣管周圍炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖2。

圖2 肺組織HE 染色（bar=200 μm）

2.1.2 肺組織PAS 染色 PAS 染色結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠比較，LBP 組小鼠肺組織無明顯變化，模型組小鼠肺終末細(xì)支氣管壁有大量紫紅色顆粒，支氣管腔內(nèi)可見黏液分泌增多。而模型+LBP 組干預(yù)的小鼠支氣管內(nèi)雖有杯狀細(xì)胞化生，但程度明顯減輕，見圖3。

圖3 肺組織PAS 染色（bar=100 μm，↑：糖原顆粒）

2.1.3 肺組織馬松染色 馬松染色結(jié)果表明，LBP 組小鼠肺組織無明顯變化，模型組小鼠相對(duì)于對(duì)照組小鼠，支氣管周圍藍(lán)染區(qū)域明顯增多，肺組織纖維化明顯，氣道上皮下膠原沉積明顯增加，可見較厚的致密層，而模型+LBP 組干預(yù)的小鼠肺組織纖維化程度明顯改善，見圖4。

圖4 肺組織馬松染色（bar=100 μm）

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺部的EOS 細(xì)胞占比

模型組小鼠肺部EOS 細(xì)胞占比高于對(duì)照組（P＜0.01），而模型+LBP 組小鼠肺組織中EOS 細(xì)胞數(shù)量低于模型組（P＜0.01）。結(jié)合肺部病理學(xué)改變可知，模型組小鼠肺部炎性細(xì)胞浸潤程度顯著高于對(duì)照組小鼠，表明過敏性哮喘模型構(gòu)造成功，見圖5。

圖5 肺組織EOS 細(xì)胞占比

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺組織中Th 細(xì)胞的變化

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織的單細(xì)胞懸液，結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織Th1 細(xì)胞占比較對(duì)照組降低，Th2 細(xì)胞占比升高（P均＜0.05）。而模型+LBP 組小鼠Th1 細(xì)胞占比較模型組升高，Th2 細(xì)胞占比降低（P均＜0.01），見圖6、圖7。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺組織中Th1 細(xì)胞占比

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺組織中Th2 細(xì)胞占比

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺組織中巨噬細(xì)胞極化

模型組小鼠較對(duì)照組相比，M1 型細(xì)胞數(shù)量減少，M2 型細(xì)胞數(shù)量增多（P均＜0.05）。模型+LBP 組小鼠與模型組相比M1 型和M2 型細(xì)胞均得到了糾正（P均＜0.05），見圖8、圖9。

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺組織中M1 型細(xì)胞占比

圖9 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺組織中M2 型細(xì)胞占比

3 討論

近年來，過敏性疾病發(fā)病率的不斷上升不僅降低了患者的生活質(zhì)量，還給患者及其家庭乃至社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。不同過敏原存在抗原交叉反應(yīng)。有研究報(bào)道，蒿屬花粉與鼠尾草[16]、豚草花粉[17]、棗花粉[18]等均存在抗原交叉反應(yīng)。同時(shí)，食物過敏和呼吸道過敏這兩種常見過敏性疾病的患病率均上升[19]。許多植物源性食物，如榛子[20]、芥末[21]與花粉過敏原中的同源蛋白存在交叉反應(yīng)[22]，導(dǎo)致由IgE 介導(dǎo)的花粉食物過敏綜合征。因此，LBP 對(duì)多種過敏性疾病具有廣泛的緩解作用，可能對(duì)與蒿屬花粉存在交叉反應(yīng)的過敏性疾病同樣具有緩解作用。本研究以黃花蒿花粉為過敏原，證明LBP 對(duì)黃花蒿花粉引起的過敏性哮喘有緩解作用。

以往研究[23]表明，Th1 和Th2 細(xì)胞比例失衡是哮喘發(fā)展的關(guān)鍵因素。哮喘患者的氣道活檢和支氣管肺泡灌洗液中存在大量活化的Th2 細(xì)胞，Th2 細(xì)胞分泌IL-4、IL-5 等細(xì)胞因子，Th2 細(xì)胞的相對(duì)增多抑制Th1 細(xì)胞分泌炎性抑制分子IFN-γ[24]。本研究中蒿屬花粉引起的過敏性哮喘模型組，同樣出現(xiàn)Th2 細(xì)胞顯著增多、Th1/Th2 細(xì)胞失衡的現(xiàn)象，而服用LBP 后模型小鼠肺部Th2細(xì)胞減少，Th1 細(xì)胞增加，Th1/Th2 失衡有所緩解。巨噬細(xì)胞是一種與眾不同的免疫細(xì)胞，能夠同時(shí)表現(xiàn)出促炎和抗炎的功能[25]。暴露于局部微環(huán)境后，巨噬細(xì)胞功能的兩個(gè)表現(xiàn)為經(jīng)典激活（M1）和交替激活（M2）表型[26]。這兩種巨噬細(xì)胞狀態(tài)影響了T 細(xì)胞Th1、Th2 的平衡，巨噬細(xì)胞極化已被證明影響氣道炎癥發(fā)病機(jī)制，來自M2 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子和趨化因子可能促進(jìn)Th2 細(xì)胞分化、募集和EOS 細(xì)胞浸潤[27]。本研究結(jié)果表明，黃花蒿花粉引起的過敏性哮喘小鼠肺部M1細(xì)胞減少、M2 細(xì)胞增多，而灌胃LBP 的小鼠可以改變巨噬細(xì)胞的極化，使小鼠肺部M1 細(xì)胞增多、M2 細(xì)胞減少。

Iwasaki 等[28]構(gòu)建了巨噬細(xì)胞-Th2 細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型和抗原特異性Th2 細(xì)胞轉(zhuǎn)移小鼠模型，揭示M2 巨噬細(xì)胞與氣道炎癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，M2 與Th2 細(xì)胞在體內(nèi)通過組胺信號(hào)傳導(dǎo)協(xié)同誘導(dǎo)過敏性炎癥。研究[29]表明，LBP 對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖、極化功能有影響。LBP 具有抗炎作用[30]，可以通過改變糖酵解和巨噬細(xì)胞向M1分化來抑制炎癥[31]。本研究中，灌胃LBP 小鼠體內(nèi)M1 巨噬細(xì)胞增多，Th2 細(xì)胞減少，因此認(rèn)為LBP 緩解過敏性哮喘可能是由于LBP 促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 分化，同時(shí)巨噬細(xì)胞與T 細(xì)胞通過信號(hào)傳導(dǎo)協(xié)同，以減輕氣道損傷程度，與上述研究相吻合，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究中LBP 對(duì)由黃花蒿花粉引起的過敏性哮喘小鼠起到一定的預(yù)防緩解作用，減輕了黃花蒿過敏性哮喘小鼠肺部炎性細(xì)胞浸潤，使得Th1、M1 細(xì)胞占比減少，表明LBP 可以在一定程度上糾正過敏性哮喘引起的體內(nèi)Th1/Th2 和M1/M2 的失衡。LBP 能為黃花蒿花粉引起的過敏性哮喘提供新的治療方向，為與蒿屬花粉存在同源蛋白的食物或花粉引起的過敏性疾病的治療提供新的治療途徑和理論基礎(chǔ)。