白消安誘導(dǎo)雄性高促性腺激素性性腺功能減退癥小鼠模型的構(gòu)建

許紅秀， 王苗苗， 陳耀平

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

雄性高促性腺激素性性腺功能減退癥指因睪丸本身發(fā)育不良或受到各種損傷，導(dǎo)致睪丸分泌睪酮和產(chǎn)生精子能力下降，伴有垂體卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）水平升高[1]。FSH 在誘導(dǎo)和維持精子發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，主要通過與支持細(xì)胞上的卵泡刺激素受體（FSHR）特異性結(jié)合發(fā)揮其功能，F(xiàn)SHR 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是睪丸對(duì)FSH 的正常反應(yīng)所必需的[2]。在睪丸功能異常的男性中，抑制素B 隨著FSH 血漿水平的升高而下降[3]。因此，不育患者中FSH 濃度高被認(rèn)為是生精異常的標(biāo)志。LH 與FSH 同屬于促性腺激素，兩者協(xié)同促進(jìn)精子成熟。LH 通過控制睪酮的分泌，進(jìn)而調(diào)控精子的產(chǎn)生，與FSH 相同，LH 也需要與睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜上存在的特異性受體黃體生成素受體（LHR）結(jié)合，才能促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌雄性激素[4]。高促性腺激素性性腺功能減退癥的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。目前針對(duì)無精子癥發(fā)病機(jī)制研究的動(dòng)物模型比較多見，但對(duì)于雄性高促性腺激素性性腺功能減退癥的動(dòng)物模型鮮有報(bào)道。無精子癥動(dòng)物模型的建立有電離輻射法[5]、化療藥物注射法和激素注射法[6]等，但無精子癥動(dòng)物模型的建立不注重性激素水平的變化，同樣的化療法造模。有研究[7]顯示，無精子癥動(dòng)物模型表現(xiàn)出高促性腺激素水平，也有研究[8]報(bào)道，無精子癥動(dòng)物模型促性腺激素水平正常甚至表現(xiàn)為低促性腺激素水平[9]，因此缺乏穩(wěn)定的雄性高促性腺激素性性腺功能減退癥小鼠模型?；熕幬镎T導(dǎo)無精子癥模型制備時(shí)，給藥方法多為大劑量單次腹腔注射，容易造成動(dòng)物死亡率高、模型不穩(wěn)定等。本研究選擇小劑量持續(xù)刺激法腹腔注射，已有研究[10]顯示，該方法可降低小鼠死亡率，且模型穩(wěn)定。同時(shí)，常見的無精子癥動(dòng)物模型制備成功與否的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)幾乎均為精子數(shù)量、睪丸質(zhì)量[11]、睪丸病理染色等，缺乏系統(tǒng)的評(píng)判方法。因此，本研究選擇ICR 小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過腹腔注射白消安的方法建立雄性高促性腺激素性性腺功能減退癥模型，采用睪丸系數(shù)、睪丸病理評(píng)分、精子數(shù)量及活力、曲細(xì)精管直徑、生精上皮厚度、血清性激素水平、睪丸HE染色等方法評(píng)判造模效果，建立穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的性腺功能低下、促性腺激素水平高的小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20 只SPF 級(jí)雄性ICR 小鼠，體質(zhì)量40～55 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào)：SCXK（寧）2020-0001］，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，光照12 h亮/12 h 暗。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)操作，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IACUCNYLAC-2021-028）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑 白消安（Sigma-Aldrich，美國）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich，美國）；生理鹽水（湖南科倫制藥有限公司，中國）；小鼠睪酮ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，中國）；小鼠FSH ELISA 檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，中國）；小鼠LH ELISA檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，中國）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國）；二甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國）；HE染液套裝（武漢賽維爾生物科技有限公司，中國）；中性樹膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國）。1.1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器 多功能微孔板檢測(cè)儀（BioTek，美國）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司，中國）；脫水機(jī)（Diapath，意大利）；包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，中國）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，中國）；凍臺(tái)（武漢俊杰電子有限公司，中國）；組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，中國）；染色機(jī)（Diapath，意大利）；烤箱（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司，中國）；載玻片（武漢賽維爾生物科技有限公司，中國）；正置光學(xué)顯微鏡（尼康，日本）；成像系統(tǒng)（尼康，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

選取健康SPF 級(jí)雄性ICR 小鼠20 只，按照隨機(jī)數(shù)表法分為3 組：對(duì)照組（6 只），實(shí)驗(yàn)組分3 mg·kg-1×10 d 組（7 只）、4 mg·kg-1×10 d 組（7 只）。對(duì)照組給予DMSO 與生理鹽水等量混合后腹腔注射，實(shí)驗(yàn)組給予白消安溶于DMSO 與生理鹽水等量混合液后腹腔注射，連續(xù)注射10 d。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中均無脫失，全部進(jìn)入結(jié)果分析。

1.3 雄性高促性腺激素性性腺功能減退癥小鼠模型制備

參考文獻(xiàn)[12-13]，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行。1.3.1 藥物配制 1）對(duì)照組藥物配制：1 mL DMSO 與1 mL 生理鹽水混合制成混合液。2）實(shí)驗(yàn)組藥物配制：先將3 mL DMSO 與3 mL 生理鹽水混合制成混合液，之后向此混合液內(nèi)加入0.003 g白消安，搖勻后制成白消安注射液，使其終濃度為0.5 mg·mL-1。

1.3.2 腹腔注射 對(duì)小鼠下腹用酒精棉球擦拭消毒，用1 mL 一次性注射器吸取造模藥物，待小鼠下腹部晾干后進(jìn)針回抽確認(rèn)，無其他液體及雜質(zhì)吸出時(shí)進(jìn)行腹腔注射。連續(xù)腹腔注射10 d，1次/d，每次在同時(shí)間（上午9 點(diǎn)左右）注射。對(duì)照組每日給藥劑量為0.2 mL。3 mg·kg-1×10 d組每日給藥劑量為3 mg·kg-1，注射總劑量為30 mg·kg-1；4 mg·kg-1×10 d 組每日給藥劑量為4 mg·kg-1，注射總劑量為40 mg·kg-1。

1.4 主要觀察指標(biāo)

給藥40 d 后，乙醚麻醉處死小鼠，摘眼球取血，手術(shù)剝?nèi)‰p側(cè)睪丸及附睪，右側(cè)睪丸及附睪用于觀察精子數(shù)量及活力，左側(cè)睪丸用于HE 染色。

1.4.1 小鼠體質(zhì)量變化 將電子秤除皮調(diào)零，將小鼠放置于電子秤中稱重記錄。給藥當(dāng)天第1 次稱重，此后每4 d 稱重1 次，直至取材當(dāng)天。

1.4.2 睪丸系數(shù) 小鼠乙醚吸入麻醉后，剪開腹腔，分離睪丸，電子秤調(diào)零后稱重并記錄睪丸濕重，睪丸系數(shù)（%）=睪丸濕重/小鼠體質(zhì)量×100%。

1.4.3 小鼠睪丸Johnson 評(píng)分 將小鼠睪丸組織切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)生精小管進(jìn)行Johnson 評(píng)分[14]。

1.4.4 精子數(shù)量及活力 取右側(cè)附睪于1 mL 37 ℃生理鹽水中剪碎，繼續(xù)37 ℃水浴5 min，吸管吹打30 次制成精子懸液，用擦鏡紙過濾組織碎片后取適量濾液滴入血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)[15]。每個(gè)樣本觀察3 個(gè)視野，評(píng)估每只小鼠附睪的精子活力。參照文獻(xiàn)[16]的方法將精子活動(dòng)力分為4 級(jí)：Ⅰ級(jí)快速直線向前運(yùn)動(dòng)，精子活動(dòng)能力極好；Ⅱ級(jí)直線向前運(yùn)動(dòng)，精子活動(dòng)能力較好；Ⅲ級(jí)向前曲線運(yùn)動(dòng)，精子活動(dòng)能力一般；Ⅳ級(jí)原地蠕動(dòng)，精子活動(dòng)能力差。

1.4.5 曲細(xì)精管直徑及生精上皮厚度 將HE染色的睪丸組織切片用掃描儀掃描后，用Case-Viewer 軟件統(tǒng)計(jì)視野下曲細(xì)精管直徑及生精上皮厚度，每張組織切片至少選取50 個(gè)曲細(xì)精管進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4.6 小鼠血清性激素水平 小鼠所采血液樣本于3 000 r·min-1離心20 min，離心后取血清置于新的離心管中，于-80 ℃冰箱中低溫保存。檢測(cè)時(shí)取出，于冰上緩慢溶解，按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測(cè)血清FSH、LH 及睪酮水平。

1.4.7 小鼠睪丸HE 染色：取左側(cè)睪丸組織固定于動(dòng)物睪丸組織固定液內(nèi)。之后將組織目的部位修切平整，脫水，包埋，切片。蘇木精-伊紅染色，顯微鏡鏡檢，分別采集200×（50 μm）、400×（20 μm）視野圖像分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化

前10 d 為給藥期間體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)組小鼠開始給藥后體質(zhì)量略有下降，隨著時(shí)間的推移，3組小鼠體質(zhì)量均呈上升趨勢(shì)，各組小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化

2.2 小鼠睪丸系數(shù)比較

與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠的睪丸系數(shù)隨著給藥劑量增加呈下降趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見圖2。

圖2 小鼠睪丸系數(shù)比較

2.3 小鼠睪丸Johnson 評(píng)分比較

結(jié)果表明，3 mg·kg-1×10 d 組小鼠睪丸Johnson 評(píng)分低于對(duì)照組，4 mg·kg-1×10 d 組小鼠睪丸Johnson 評(píng)分低于對(duì)照組和3 mg·kg-1×10 d 組（P均＜0.05），見圖3。

圖3 小鼠睪丸Johnson 評(píng)分比較

2.4 小鼠精子數(shù)量及活力等級(jí)比較

給藥后，3 組小鼠精子數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=882.5，P＜0.001）。3 mg·kg-1×10 d 組和4 mg·kg-1×10 d 組精子數(shù)量均低于對(duì)照組，且4 mg·kg-1×10 d 組低于3 mg·kg-1×10 d 組（P均＜0.05）。3 mg·kg-1×10 d 組精子多為直線向前運(yùn)動(dòng)精子，而4 mg·kg-1×10 d 組多為Ⅳ級(jí)精子，活動(dòng)能力極差，見表1。

表1 小鼠精子數(shù)量及活力等級(jí)比較

2.5 小鼠曲細(xì)精管直徑比較

給藥后，3 組小鼠曲細(xì)精管直徑比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=412.50，P＜0.001）。與對(duì)照組比較，3 mg·kg-1×10 d 組和4 mg·kg-1×10 d 組小鼠的曲細(xì)精管直徑均變細(xì)，且4 mg·kg-1×10 d 組小于3 mg·kg-1×10 d 組（P均＜0.05），見表2。

表2 小鼠曲細(xì)精管直徑比較（ ±s，μm）

表2 小鼠曲細(xì)精管直徑比較（ ±s，μm）

與對(duì)照組比較*P<0.05；與3 mg·kg-1×10 d 組比較#P<0.05。

組別 n 曲細(xì)精管直徑對(duì)照組 6 227.98±9.80 3 mg·kg-1×10 d 組 7 136.39±7.88*4 mg·kg-1×10 d 組 7 104.33±6.28*#F 值 412.50 P 值 <0.001

2.6 小鼠生精上皮厚度比較

給藥后，3 組小鼠生精上皮厚度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=781.50，P＜0.001）。對(duì)照組小鼠生精上皮較厚，主要有完整生精細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子；3 mg·kg-1×10 d 組小鼠生精上皮較薄，存在各級(jí)完整的生精細(xì)胞；4 mg·kg-1×10 d 組小鼠生精上皮處于完全損傷狀態(tài)，生精上皮厚度低于對(duì)照組和3 mg·kg-1×10 d 組（P均＜0.05），見表3。

表3 小鼠生精上皮厚度比較（ ±s，μm）

表3 小鼠生精上皮厚度比較（ ±s，μm）

與對(duì)照組比較*P<0.05；與3 mg·kg-1×10 d 組比較#P<0.05。

組別 n 生精上皮厚度對(duì)照組 6 66.27±2.66 3 mg·kg-1×10 d 組 7 41.96±2.34*4 mg·kg-1×10 d 組 7 13.79±2.21*#F 值 781.50 P 值 <0.001

2.7 小鼠血清激素水平比較

4 mg·kg-1×10 d 組小鼠血清FSH 水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；4 mg·kg-1×10 d 組小鼠血清LH水平高于對(duì)照組和3 mg·kg-1×10 d 組（P均＜0.05），4 mg·kg-1×10 d 組和3 mg·kg-1×10 d 組血清睪酮水平均低于對(duì)照組（P均＜0.05）。說明在激素水平上此模型構(gòu)建成功，見圖4。

圖4 小鼠血清激素水平比較

2.8 小鼠睪丸HE 染色結(jié)果

對(duì)照組小鼠生精功能正常，睪丸生精小管間隙正常，管腔內(nèi)生精細(xì)胞排列緊密、層次分明，從基底膜向管腔內(nèi)依次為精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子，管腔內(nèi)可見大量成熟精子。3 mg·kg-1×10 d 組小鼠生精功能障礙，睪丸生精小管間隙較大，管腔內(nèi)可見精原細(xì)胞、精母細(xì)胞，精子細(xì)胞較少，管腔內(nèi)精子極少。4 mg·kg-1×10 d 組小鼠生精功能嚴(yán)重障礙，生精小管散在分布于間質(zhì)中，生精小管上皮內(nèi)細(xì)胞層數(shù)較少，各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量較少，管腔空洞，無成熟精子，見圖5。

圖5 小鼠睪丸HE 染色結(jié)果

3 討論

雄性高促性腺激素性性腺功能減退狀態(tài)，一方面是由于睪丸功能異常，F(xiàn)SHR、LHR 的消耗下降，使得FSH、LH 水平升高，另一方面是缺乏來自睪丸的雌二醇、睪酮、抑制素B 的負(fù)反饋，促性腺激素分泌升高，主要由睪丸先天發(fā)育不良或后天損傷所致[1]。Foresta 等[17]在使用促性腺激素釋放素激素類似物（GnRHa）降低高FSH 血漿濃度后，睪丸內(nèi)嚴(yán)重?fù)p傷的支持細(xì)胞功能有所改善。在高促性腺激素條件下，后續(xù)給予人絨毛膜促性腺激素可以刺激間質(zhì)細(xì)胞，也能恢復(fù)其功能[18-19]。由此可見，雄性高促性腺激素性性腺功能減退狀態(tài)是可逆的，因此，模型構(gòu)建所選用的造模劑或造模方法不可對(duì)睪丸造成永久性損害。

白消安為細(xì)胞周期非特異性藥物，主要與細(xì)胞DNA 內(nèi)的鳥嘌呤起烷化作用而破壞DNA 的結(jié)構(gòu)與功能[20-21]。白消安能有效減輕粒細(xì)胞總負(fù)荷，緩解癥狀，從而改善患者狀態(tài)[22-23]。白消安腹腔注射會(huì)引起睪丸炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等增加[24]，小劑量持續(xù)刺激會(huì)導(dǎo)致長時(shí)間的炎性反應(yīng)，可能對(duì)睪丸的生精功能、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等造成損傷，進(jìn)而導(dǎo)致性腺功能減退、促性腺激素水平升高。褪黑素和維生素通過抗氧化作用能夠有效降低白消安作用后產(chǎn)生的活性氧分子，改善受損的生精功能[25-26]。白消安在損傷生精細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致骨髓抑制[27]，使患者出現(xiàn)營養(yǎng)不良、體質(zhì)量下降、乏力、反應(yīng)遲鈍等癥狀[10]。但是采用本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)探索出的小劑量持續(xù)刺激法注射白消安后，小鼠并無上述表現(xiàn)，各組小鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明此造模方法不會(huì)影響小鼠的正常發(fā)育，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸系數(shù)下降，說明此雄性高促性腺激素性性腺功能減退癥小鼠模型不是通過全身消耗作用而來，而是白消安作用于睪丸周圍所得，符合臨床高促性腺激素性性腺功能減退癥的病因，證明了此造模方法的有效性。

臨床上無精子癥患者通常依靠睪丸活檢確診，病理結(jié)果通常使用國際通用的Johnson 評(píng)分判斷，評(píng)分從高到低代表著生精功能從好到差[14]。睪丸Johnson 評(píng)分是根據(jù)生精小管中精子的發(fā)生及精子發(fā)生障礙程度做出定量判斷的評(píng)分表。共分為10 級(jí)，積分越高，表明精子發(fā)生越好，反之，精子發(fā)生障礙越嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明，給藥劑量越大，小鼠精子發(fā)生障礙越嚴(yán)重。白消安作用于睪丸后，不僅使睪丸體積減小，也使精子數(shù)量降低、精子活力受損；睪丸健康狀況、大小、曲細(xì)精管直徑和生精上皮厚度與精子發(fā)生過程中精子的數(shù)量和活力密切相關(guān)[28]。通過睪丸病理切片HE 染色后使用Case-Viewer 軟件測(cè)量發(fā)現(xiàn)，隨著給藥劑量的增加，睪丸質(zhì)量降低，體積減小，曲細(xì)精管變細(xì)，生精上皮厚度變薄，管腔增大，生精能力減弱。

睪丸在受到白消安的刺激后發(fā)生損傷，睪酮水平降低，通過下丘腦-垂體-睪丸軸的負(fù)反饋?zhàn)饔?，?dǎo)致血清FSH 和LH 水平升高。在高促性腺激素狀態(tài)加速睪丸早衰的理論中，一種認(rèn)為是受體脫敏，當(dāng)受體長時(shí)間暴露于配體時(shí)，大多數(shù)受體會(huì)失去反應(yīng)性，即產(chǎn)生脫敏現(xiàn)象。另一種是受體下調(diào)，當(dāng)體內(nèi)配體持續(xù)升高時(shí)，配體-受體復(fù)合物可被細(xì)胞內(nèi)化，內(nèi)化后配體及部分受體被降解，部分受體返回細(xì)胞膜重新利用，可導(dǎo)致受體數(shù)量減少，稱為受體下調(diào)。支持細(xì)胞長期暴露于FSH 可誘導(dǎo)FSH 信號(hào)的脫敏和下調(diào)，從而防止這些性腺細(xì)胞的過度刺激[29]。因此白消安可能會(huì)直接作用于FSH 和LH 受體，使其受損，進(jìn)而導(dǎo)致促性腺激素水平升高，此機(jī)制有待進(jìn)一步研究。睪丸HE 染色可見小鼠睪丸損傷嚴(yán)重，但全身未受較大影響，表明白消安小劑量持續(xù)刺激是一種較為可靠的性腺功能減退造模方法。

因此，建立雄性小鼠睪丸功能低下、高促性腺激素水平模型，對(duì)于探索其發(fā)病機(jī)制，揭示相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)、信號(hào)通路、治療靶點(diǎn)等仍具有重要作用。進(jìn)一步研究高促性腺激素狀態(tài)下睪丸早衰的分子機(jī)制可為臨床治療提供理論依據(jù)，也為睪丸功能低下的少精子癥和無精子癥患者的臨床治療方案的設(shè)計(jì)，及早期識(shí)別睪丸早衰、防止生精功能衰竭和預(yù)防男性不育提供重要的理論證據(jù)。