全氟丁烷磺酸對(duì)其耐受菌胞外聚合物特征的影響

余果，孫麗娜，唐蕊，韓悅

（沈陽(yáng)大學(xué)環(huán)境學(xué)院區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110044）

全氟化合物（Perfluorinated compounds，PFCs）是指烷基鏈上的氫原子全部被氟原子取代的一類人工合成的新型持久性有機(jī)污染物，由全氟磺酸類（Per?fluoroalkyl sulfonic acids，PFSAs）和全氟羧酸類（Per?fluoroalkyl carboxylic acids，PFCAs）的離子型全氟化合物（Perfluoroalkyl acids，PFAAs）和非離子型全氟化合物（Non-ionic PFCs）組成[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，長(zhǎng)鏈全氟化合物（含有7 個(gè)以上全氟烷基碳的PFCAs 和6 個(gè)以上全氟烷基碳的PFSAs）被廣泛應(yīng)用于紡織、不粘式炊具、食品包裝、泡沫滅火劑及地毯保護(hù)劑等消費(fèi)品的生產(chǎn)過(guò)程[2]，全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）也成為環(huán)境中主要檢出的全氟化合物[3-4]。由于具有環(huán)境持久性、高毒性、生物富集性和污染廣泛等特點(diǎn)，PFOA 和PFOS 分別于2017 年和2009 年被列入《斯德哥爾摩公約》，并對(duì)其生產(chǎn)和使用進(jìn)行了全球限制和嚴(yán)格管控。

全氟丁烷磺酸（Perfluorobutanesulfonic acid，PFBS）是碳原子數(shù)為4 的一種短鏈PFCs，與碳原子數(shù)為8的PFOS具有相似的元素組成及物理結(jié)構(gòu)（圖1），PFBS 無(wú)明顯生物積累性，在人體中的半衰期較短[5]。因此，在2009 年P(guān)FOS 及其衍生物被列入國(guó)際斯德哥爾摩公約的背景下，PFBS被廣泛作為PFOS的替代品而大量使用，導(dǎo)致PFBS 在垃圾填埋場(chǎng)[6]、地下水[7]、河流水[8]和市政污水[9]、污泥[10]、土壤[11]等環(huán)境中被頻繁檢測(cè)到。PFBS 對(duì)人體的臟器[12]、免疫[13]、神經(jīng)[14]、生殖[15]及發(fā)育系統(tǒng)[16]等具有毒害作用，特別是PFBS 的水溶性（42 g·L-1）遠(yuǎn)高于PFOS（591 mg·L-1）[17]，其較高的環(huán)境持久性和流動(dòng)性使其具有比PFOS更高的全球污染潛力[18]，2020 年1 月16 日PFBS 及其鹽類正式被添加到高度關(guān)注物質(zhì)（SVHC）候選物質(zhì)中，因此PFBS的環(huán)境污染問(wèn)題值得我們關(guān)注。

圖1 PFOS和PFBS結(jié)構(gòu)式Figure 1 The structure of PFOS and PFBS

環(huán)境污染微生物修復(fù)以其易操作、成本低和環(huán)境友好的特點(diǎn)而受到廣大研究者的關(guān)注。胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）是在特定生長(zhǎng)條件下由微生物分泌、并附著在細(xì)胞表面或周圍的多聚化合物，主要由蛋白質(zhì)、多糖、核酸和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)組成。EPS 在微生物缺乏營(yíng)養(yǎng)時(shí)即可作為碳源物質(zhì)被利用，為微生物生存活動(dòng)提供能量[19]；也可以幫助微生物抵御外界不良環(huán)境，提高微生物對(duì)有毒環(huán)境的耐受性[20]。污染物的存在可以誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生更多的EPS 來(lái)抵御外界不良環(huán)境[21]，EPS 對(duì)環(huán)境污染物的去除具有重要作用[22]，但PFCs 對(duì)微生物產(chǎn)生EPS的影響具有很大的不確定性。Weathers等[23]研究發(fā)現(xiàn)PFCs 會(huì)誘導(dǎo)微生物分泌更多的EPS，從而抵御有毒物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，保障微生物的生長(zhǎng)和繁殖[23]；而Chen等[24]研究發(fā)現(xiàn)PFOS的添加會(huì)導(dǎo)致EPS中類蛋白質(zhì)和類腐植酸的濃度顯著下降；唐琳欽等[25]研究發(fā)現(xiàn)添加PFOS 和PFOA 會(huì)降低污泥EPS 中色氨酸的含量。Yan等[26]研究發(fā)現(xiàn)EPS中色氨酸和酪氨酸兩種組分的濃度與添加的PFOA 濃度呈負(fù)相關(guān)。目前相關(guān)研究主要集中在長(zhǎng)鏈PFCs 對(duì)EPS 的影響上，而短鏈PFCs對(duì)EPS的影響研究較為鮮見。

基于此，本文從阜新某氟化工污水處理廠污泥中分離出兩種PFBS 耐受菌株，通過(guò)實(shí)驗(yàn)和三維熒光光譜（Three-dimensional fluorescence spectrum，3D-EEM）分析，研究了100 μg·L-1PFBS 脅迫下兩種菌株的生長(zhǎng)量與代謝活性和EPS 產(chǎn)量、組成特征及其對(duì)PFBS的去除作用，并運(yùn)用傅里葉紅外光譜（Fourier trans?form infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）進(jìn)一步分析了EPS官能團(tuán)的變化，以期為PFBS 污染的微生物EPS 去除機(jī)理提供新的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 耐受菌篩選所用污泥

篩選菌種所用的污泥采自遼寧省阜新市某氟化工污水處理廠的濃縮污泥，采集時(shí)間為2020年9月28日。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和主要試劑

HITACHI F-4600 熒光光度計(jì)、Thermo NICOLET 380 傅里葉紅外光譜儀、Elementar Liqui TOC 總有機(jī)碳分析儀、SUPELCO Visiprep?SPE 真空固相萃取裝置、Thermo TSQ ENDUR 三重四極桿質(zhì)譜儀、Dionex UltiMate 3000 高 效液相色譜 儀。PFBS（2 000 ng·mL-1，≥99%）與內(nèi)標(biāo)（MPFAC-MXA，2000 ng·mL-1，≥99%）均 購(gòu) 自Wellington Laboratories 公 司，甲 醇（HPLC）和乙酸銨（HPLC）購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司，WAX-SPE 固相萃取柱購(gòu)自Suplco 公司。本試驗(yàn)采用富集培養(yǎng)基：NH4NO35 g·L-1、NaCl 2 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、K2HPO41 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.05 g·L-1、酵母粉1 g·L-1，分別加入10、20、30、40 mg·L-1和50 mg·L-1的PFBS，pH 7.0。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：NH4NO35 g·L-1、NaCl 2 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、K2HPO41 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.05 g·L-1，pH 7.0。LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、酵母粉5 g·L-1，調(diào)節(jié)pH 至7.0，固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH后再加入5 g·L-1瓊脂粉。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離和純化

取10 g 污泥接種于200 mL 富集培養(yǎng)基中，在30 ℃和130 r·min-1的振蕩條件下培養(yǎng)。每隔7 d，將5%的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的富集培養(yǎng)基中，逐漸升高PFBS 的濃度至50 mg·L-1，馴化結(jié)束。將10 mL 馴化后的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到90 mL以50 mg·L-1PFBS為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中。通過(guò)連續(xù)4次轉(zhuǎn)接進(jìn)行富集和篩選。取1 mL最終培養(yǎng)液用無(wú)菌水梯度稀釋后，分別涂布于含50 mg·L-1PFBS的瓊脂平板上，放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待平板上長(zhǎng)出明顯菌落時(shí)，挑選生長(zhǎng)狀態(tài)較好的菌落進(jìn)行劃線純化為單一菌落（共純化4 次），純化后的菌株在-20 ℃的15%甘油中保存[27]。

1.2.2 生長(zhǎng)量

將單株菌按2%接種量接種到濃度為100 μg·L-1PFBS 的50 mL 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下以130 r·min-1振蕩培養(yǎng)，第1天分別在0、4、8 h和12 h各取樣1 次，從第2 天開始每天取樣1 次，凈培養(yǎng)（不包括取樣時(shí)間）7 d 結(jié)束培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置CK 對(duì)照組（PFBS 濃度為0 μg·L-1的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基）及3 組平行（包括CK 組），選用2 mL 比色皿取1.5 mL 培養(yǎng)液，以蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定生長(zhǎng)量（OD600）[28]。

1.2.3 代謝活性（ETSA）

取0.5 mL 培養(yǎng)液與1 mL 0.2%的INT（氯化碘硝基四氮唑）溶液混合，避光反應(yīng)20 min 后加入50 μL甲醛終止反應(yīng)，1 000 r·min-1離心5 min，去上清。沉淀用1 mL 96%的甲醇重懸，混勻使之完全溶解。1 000 r·min-1離心5 min，去除菌體對(duì)吸光度的干擾。測(cè)定495 nm 處的吸光值，以7 mL 96%甲醇加2 mL 0.2%INT作為空白[28]。

ETSA（A，μg·g-1·d-1，以O(shè)2計(jì)）的計(jì)算公式：

式中：S為樣品體積；t為反應(yīng)時(shí)間；Ab為吸光度；V為用來(lái)重懸的甲醇體積；32/2 為常數(shù)；15.9 為摩爾吸光度。

1.2.4 菌種鑒定

將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到LB 培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rDNA 鑒定。通過(guò)NCBI 基因庫(kù)中（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）Blast 已知菌株的16S rDNA 序列與16S rDNA 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，選取相似性較高的序列，利用CLUSTAL-X 軟件將選取的序列與菌株序列進(jìn)行多序列比對(duì)，對(duì)齊所得序列，基于鄰接法（Neighbor-joining）通過(guò)MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[29]。

1.2.5 EPS提取與分析

取生長(zhǎng)到穩(wěn)定期的菌體培養(yǎng)液，8 000 r·min-1離心4 min，除去上清液后補(bǔ)充無(wú)菌水至原體積，再8 000 r·min-1離心4 min，除去上清液，補(bǔ)充適量無(wú)菌水制備成菌懸液。將上述菌懸液放入60 ℃的水浴鍋中加熱30 min，然后樣品于12 000 r·min-1離心5 min，上清液經(jīng)過(guò)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后，得到的無(wú)色透明溶液即為EPS溶液[30]。

用總有機(jī)碳分析儀測(cè)定EPS 中有機(jī)碳（TOC）濃度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出EPS 中TOC 的濃度，EPS 產(chǎn)生量用TOC 濃度作為量化指標(biāo)，采用硫酸-苯酚法測(cè)定多糖的濃度，采用改良的Lowry 法測(cè)定EPS 中蛋白質(zhì)的濃度[31]。

將提取的EPS 溶液進(jìn)行三維熒光測(cè)定。熒光光度計(jì)參數(shù)設(shè)定：發(fā)射掃描波長(zhǎng)（Em）250~650 nm，激發(fā)掃描波長(zhǎng)（Ex）200~550 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm，掃描速度為12 000 nm·mL-1，響應(yīng)時(shí)間為自動(dòng)方式，掃描光譜進(jìn)行儀器自動(dòng)校正[30]。

將提取好的EPS經(jīng)真空干燥（-60 ℃，24 h），取適量的粉末用NICOLET 380 傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32 次·min-1，測(cè)定范圍4 000~500 cm-1[30]。

1.2.6 PFBS提取與分析

將單株菌按2%接種量接種到PFBS 濃度為100 μg·L-1的30 mL 液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下以130 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d 后，取樣分析。將固相萃取柱安裝于固相萃取裝置后，分別使用2 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氨水/甲醇溶液，2 mL 甲醇溶液，2 mL Milli-Q水進(jìn)行活化。

取2 mL待測(cè)菌液和250 μLρ=20 ng·mL-1的PFCs內(nèi)標(biāo)液（n=5 ng）置于WAX-SPE 中，流速控制在約1滴·s-1。待全部樣品通過(guò)WAX-SPE 后，加入4 mLρ=25 mmol·L-1醋酸銨緩沖液進(jìn)行洗雜。之后用2 mL甲醇溶液和2 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氨水/甲醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液收集于15 mL 康寧離心管內(nèi)。洗脫液于40 ℃水浴加熱，氮?dú)馑俣日{(diào)節(jié)至洗脫液表面有微小旋渦，濃縮至0.5 mL，再加入0.5 mL甲醇溶液，定容至1 mL。提取液通過(guò)0.22 μm 濾膜后置于2 mL 棕色進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，4 ℃保存。用Thermo TSQ ENDUR 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS-MS）測(cè)定PFBS 濃度[32]。UPLC 系統(tǒng)色譜條件為進(jìn)樣量10 μL；流速0.3 mL·min-1；流動(dòng)相：5 mmol·L-195%甲醇-乙酸銨（A），5 mmol·L-1乙酸銨（B）；梯度洗脫條件：0 min，20%B；1.5 min，40% B；1.5~9 min，95% B；9~12 min，80% B，將柱平衡3 min。質(zhì)譜條件：SRM 負(fù)離子模式；噴霧電壓3 000 V；護(hù)套氣體壓力50 Arb；輔助氣體壓力10 Arb；霧化器溫度350 ℃；離子傳遞管溫度度350 ℃。Q1 分 辨 率0.7；Q3 分 辨 率0.7；CID 碰 撞 能 量2.0 mTorr?；厥章史秶鸀?2.2~94.41%，檢出限為1.12 ng·L-1，定量限為3.74 ng·L-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。通過(guò)Excel 2021和Origin pro 2020對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 PFBS耐受菌株的篩選與鑒定

2.1.1 PFBS耐受菌株的篩選

（1）菌株的培養(yǎng)特征

將從污泥中經(jīng)過(guò)梯度壓力馴化和富集培養(yǎng)后的菌液按不同濃度梯度涂布在含PFBS的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h 后，用接種環(huán)挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落進(jìn)行畫線，挑取單菌落，重復(fù)上述步驟4 次后，分離出兩株菌落形態(tài)一致且以PFBS 為唯一碳源的耐受菌（圖2），分別命名為H1菌和B2菌。H1菌在培養(yǎng)基上呈淡黃色，是邊緣規(guī)則、表面光滑、隆起的半透明圓形菌落；B2 菌在培養(yǎng)基上呈乳白色，是邊緣規(guī)則、表面光滑、隆起的不透明圓形菌落。

圖2 菌株的形態(tài)Figure 2 Morphology of the strain

（2）菌株的生長(zhǎng)量

H1菌和B2菌的OD600曲線如圖3所示，OD600的值可以指示菌株的生長(zhǎng)量。從圖3 可以看出，H1 菌在0~8 h內(nèi)處于快速增長(zhǎng)期，1 d后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。與H1菌對(duì)比，B2菌不但快速生長(zhǎng)期更長(zhǎng)（0~2 d）而且在第二天生長(zhǎng)量達(dá)到最大后明顯下降，再緩慢上升。與CK 對(duì)比，添加100 μg·L-1PFBS 雖然沒有改變兩種菌的生長(zhǎng)周期，但兩種菌的生長(zhǎng)量均有不同程度的提高，H1 菌平均提高了19.97%，B2 菌提高了7.94%，表明PFBS 對(duì)H1 菌的促進(jìn)作用更明顯。該結(jié)果與有些研究的結(jié)果不同：Li 等[33]研究了添加PFOS 為5、10 mg·L-1和20 mg·L-1時(shí)對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明添加PFOS 后OD600值下降，PFOS 添加對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用；Zheng 等[34]的研究也表明，PFOS 為10、20 mg·L-1和40 mg·L-1時(shí)對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用，枯草芽孢桿菌的OD600值隨PFOS 濃度的增加而降低。這可能與實(shí)驗(yàn)中添加的PFOS濃度差異較大有關(guān)，或與菌種不同有關(guān)，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖3 H1菌和B2菌生長(zhǎng)量曲線Figure 3 The growth curves of H1 and B2 strain

（3）菌株的代謝活性

H1 和B2 菌的ETSA 曲線如圖4 所示，ETSA 的值可以指示菌株的代謝活性。由圖4 可知，H1 菌的ET?SA 的變化趨勢(shì)基本與OD600一致，ETSA 在0~8 h 快速增長(zhǎng)，在8 h 達(dá)到最大值后迅速下降，之后趨于穩(wěn)定。與CK 處理對(duì)比，在100 μg·L-1PFBS 脅迫下H1 菌的代謝活性受到明顯的促進(jìn)，平均提高了59.69%。但與H1 菌相反（圖4b），PFBS 的添加會(huì)抑制B2 菌的代謝活性，其ETSA比CK處理平均降低了4.71%。

圖4 H1菌和B2菌代謝活性曲線Figure 4 Metabolic activity curves of H1 and B2 strain

2.1.2 菌株的鑒定

委托生工生物工程（上海）股份有限公司分別對(duì)H1菌和B2菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，并將所得測(cè)序結(jié)果與NCBI 基因庫(kù)中（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）序列進(jìn)行比對(duì)，選擇相似性不小于98%的序列，使用MEGA7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Neighbor-Joining 法），結(jié)果如圖5所示。菌株H1的堿基對(duì)個(gè)數(shù)為1 429 bp，菌株B2 的堿基對(duì)個(gè)數(shù)為1 364 bp。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，H1 菌與假單胞菌親緣性較高，與Pseudomonas aeruginosaNCTC 13628（ON359917）的16S rDNA 基因序列有100%的相似性，判定其為Pseudomonas（假單胞菌屬），推測(cè)為Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌）；B2菌與沙雷氏菌親緣性較高，與Serratiasp.BZL（KT001067）的16S rDNA 基因序列有99.93%的相似性，判定其為Serratia（沙雷氏菌屬），推測(cè)為Serratia nematodiphila（嗜線蟲沙雷氏菌）[35-38]。

圖5 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree of strains

2.2 PFBS脅迫下耐受菌株EPS產(chǎn)量及其對(duì)PFBS的去除作用

從圖6 可以看出，加入PFBS 后H1 菌和B2 菌的EPS 產(chǎn)量減少，與CK 組相比，H1 菌從21.13 mg·L-1降低為14.76 mg·L-1（下降了30.17%），B2 菌從35.29 mg·L-1變?yōu)?8.44 mg·L-1（下降了19.41%），表明在100 μg·L-1PFBS脅迫下這兩種菌分泌EPS受到抑制。H1 菌和B2 菌在接種量為2%時(shí)，4 d 后對(duì)100 μg·L-1PFBS 的去除率分別為33.18%和19.95%，與B2 菌對(duì)比，H1 菌的去除效果更好，這可能與H1 的生長(zhǎng)周期短、以及100 μg·L-1PFBS 處理對(duì)H1 菌生長(zhǎng)量和代謝活性的促進(jìn)作用更明顯有關(guān)。Yi 等[27]將從全氟化合物生產(chǎn)廠附近土壤中分離到的Pseudomonas parafulva（副黃假單胞菌）YAB1，在30 ℃、pH 7.0、2%接種量下培養(yǎng)96 h，發(fā)現(xiàn)其對(duì)500 mg·L-1PFOA 的降解率為32.4%。趙淑艷等[29]研究發(fā)現(xiàn)在溫度為30 ℃、pH 為7.0~7.2 條件下，生絲微菌（Hyphomicrobium）PF1 對(duì)PFOSA 和N-EtFOSA 的降解率分別為14.6%和8.2%。對(duì)比前人的研究結(jié)果，本研究的H1 菌能在中性條件下有效去除短鏈全氟化合物PFBS，在短鏈全氟類化合物污染修復(fù)應(yīng)用中具有一定的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

圖6 H1菌和B2菌的EPS產(chǎn)生量及去除率Figure 6 EPS production and removal rate of H1 and B2 strain

2.3 PFBS脅迫下耐受菌株EPS組成特征

從H1 菌和B2 菌的EPS 組分變化（圖7）可以看出，兩種菌的EPS 主要成分為蛋白質(zhì)。與CK 處理相比，在100 μg·L-1PFBS 脅迫下，兩種菌EPS 中蛋白質(zhì)和多糖的濃度均降低，H1 菌的EPS 中蛋白質(zhì)濃度從20.42 mg·L-1降低到17.08 mg·L-1（下降了16.37%），多糖濃度從2.73 mg·L-1降低到1.78 mg·L-1（下降了34.80%）；B2 菌的EPS 中蛋白質(zhì)濃度從30.21 mg·L-1降低到26.67 mg·L-1（下降了11.72%），多糖濃度由13.81 mg·L-1降低到9.35 mg·L-1（下降了32.30%）。與B2菌對(duì)比，H1菌EPS中的蛋白質(zhì)、多糖降低更多。添加PFBS后，H1菌的EPS中蛋白質(zhì)/多糖的比值從7.48升高到9.58，B2 菌的比值由2.19 升高到2.85，分別升高了28.07%和30.14%。這可能是因?yàn)镋PS是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況下，為了維持代謝活動(dòng)，微生物會(huì)消耗存儲(chǔ)在EPS中的多糖并分泌酶蛋白，使EPS 中蛋白質(zhì)濃度增加進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)/多糖的比值增大[39]。但Lu 等[40]的研究表明，在PFOS 濃度為10 μg·L-1時(shí)，蛋白質(zhì)濃度升高，多糖濃度降低，而在PFOS 濃度為1 000 μg·L-1時(shí)，EPS 中蛋白質(zhì)的濃度比對(duì)照組降低了35.34%，多糖濃度提高了18.29%。由此可見，PFCs 的濃度會(huì)對(duì)EPS 的組成產(chǎn)生相反的影響。

圖7 H1菌和B2菌的EPS組分含量Figure 7 Contents of EPS components of H1 and B2 strain

2.4 菌株EPS三維熒光光譜分析

圖8 為H1菌和B2菌的EPS三維熒光光譜。由圖8可知，圖譜中主要有4個(gè)熒光峰，PeakA位于Ex/Em=225 nm/330~340 nm，PeakB 位于Ex/Em=275~280 nm/330~340 nm，為類蛋白質(zhì)物質(zhì)，其中PeakA 為酪氨酸物質(zhì)，PeakB 為色氨酸物質(zhì)；PeakC 位于Ex/Em=385~405 nm/465 nm，為類腐植酸物質(zhì)；PeakD 位于Ex/Em=240~270 nm/445~455 nm，為類富里酸物質(zhì)[41]。

圖8 H1菌和B2菌的EPS三維熒光光譜圖Figure 8 Three-dimensional fluorescence spectra of H1 and B2 strain EPS

從三維熒光光譜強(qiáng)度（表1）可以看出，與CK 處理對(duì)比，添加100 μg·L-1PFBS 使兩種菌的類蛋白峰（酪氨酸和色氨酸）強(qiáng)度均明顯下降，與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的EPS 中蛋白質(zhì)濃度降低的結(jié)果相一致。其中H1 菌的PeakA 強(qiáng)度從129.10 a.u 下降到75.81 a.u（降低 了41.28%），PeakB 強(qiáng)度從96.48 a.u 下降到65.98 a.u（降低了31.61%）；B2菌的PeakA強(qiáng)度從161.70 a.u下降到126.60 a.u（降低了21.71%），PeakB 強(qiáng)度從157.40 a.u下降到101.40 a.u（降低了35.58%），這與前人的相關(guān)研究結(jié)果類似。Lu 等[40]的研究結(jié)果表明，添加1 000 μg·L-1PFOS 后，EPS 中的酪氨酸和色氨酸分別比CK 處理降低了10.90%和9.38%；色氨酸熒光峰強(qiáng)度的降低是由PFCs 與EPS 中色氨酸發(fā)生疏水作用所導(dǎo)致[25]。色氨酸和酪氨酸的熒光依賴于苯環(huán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，PFCs 中的C—F 鏈能夠與EPS 蛋白質(zhì)中的芳香基團(tuán)形成疏水作用，導(dǎo)致苯環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[26]，從而導(dǎo)致PeakA 和PeakB 的熒光強(qiáng)度下降。

表1 H1菌和B2菌的EPS三維熒光光譜分析結(jié)果Table 1 Three-dimensional fluorescence spectrum analysis results of H1 and B2 strain EPS

如圖8a和圖8b所示，在H1菌的熒光譜圖中還檢測(cè)到了PeakC（類腐植酸）和PeakD（類富里酸），說(shuō)明在H1 菌EPS 中不僅有蛋白質(zhì)，還含有腐殖質(zhì)。與CK處理對(duì)比（圖8a），添加PFBS使H1菌的EPS中類腐植酸峰和類富里酸峰強(qiáng)度也有所下降，PeakC（類腐植酸）強(qiáng)度從112.70 a.u 下降到18.58 a.u（降低了83.51%），PeakD（類富里酸）強(qiáng)度從115.80 a.u 下降到46.31 a.u，（降低了60.00%），可能與腐殖質(zhì)含有芳香基團(tuán)和PFCs 中的C-F 鏈形成的疏水作用有關(guān)[26]。腐殖質(zhì)含有更多的芳香族位點(diǎn)，腐殖質(zhì)含量的增加可以在一定程度上阻止PFOS 進(jìn)入細(xì)胞[40]。熒光峰C 的強(qiáng)度與腐殖酸結(jié)構(gòu)中的羧基有關(guān)[42]，因此推測(cè)PeakC（類腐植酸）和PeakD（類富里酸）的熒光強(qiáng)度下降的原因可能是其中的芳香基團(tuán)和羧基與PFBS 發(fā)生反應(yīng)所導(dǎo)致。

2.5 菌株EPS傅里葉紅外光譜分析

100 μg·L-1PFBS 脅迫下H1 菌和B2 菌EPS 的傅里葉紅外光譜如圖9所示。從圖9可以看出，在3 427 cm-1處的強(qiáng)寬帶吸收峰為多糖和腐植酸中的羥基和蛋白質(zhì)中酰胺基團(tuán)產(chǎn)生的O H 和NH 的混合物伸縮振動(dòng)[26，43]，在2 929 cm-1處出現(xiàn)的尖銳式不對(duì)稱吸收峰為芳香族氨基酸（色氨酸）中CH2反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，2 500~2 250 cm-1處的吸收峰為空氣中CO2引起的干擾峰，可能與樣品中的CO2沒有排干凈有關(guān)。1 644 cm-1處為蛋白質(zhì)中酰胺的吸收帶Ⅰ，1 530 cm-1和1 526 cm-1為蛋白質(zhì)中酰胺的吸收帶Ⅱ，1 061 cm-1處的紅外吸收峰為多糖和類多糖中C O 伸縮振動(dòng)，小于1 000 cm-1的吸收峰為樣品中不飽和鍵所形成，屬于指紋區(qū)域[44-45]。

圖9 H1菌和B2菌的EPS傅里葉紅外光譜圖Figure 9 EPS infrared spectra of H1 and B2 strain

與CK 處理對(duì)比，添加PFBS 后，沒有引起EPS 的紅外光譜譜峰位置的移動(dòng)，表明EPS中的主要官能團(tuán)類型沒有發(fā)生改變。但譜峰強(qiáng)度有所改變，有研究表明，紅外光譜圖中峰強(qiáng)度與樣品中所含官能團(tuán)的濃度存在著密切關(guān)系，峰值強(qiáng)度的大小能夠反映相應(yīng)官能團(tuán)的相對(duì)濃度[46]。與CK 相比，H1 菌紅外光譜圖在3 427 cm-1處O H 和N H 伸縮振動(dòng)峰強(qiáng)度減弱，B2菌的紅外光譜圖峰的強(qiáng)度都變?nèi)?，尤其? 427 cm-1和1 061 cm-1處，3 427 cm-1處O H和NH伸縮振動(dòng)峰消失，1 061cm-1處CO 伸縮振動(dòng)峰強(qiáng)度減弱，推測(cè)EPS 中蛋白質(zhì)、多糖和腐植酸組分為PFBS 的吸附提供了大量的活性結(jié)合位點(diǎn)[26，39]。

3 結(jié)論

（1）H1 菌和B2 菌分別被鑒定為Pseudomonas（假單胞菌屬）和Serratia（沙雷氏菌屬），全氟丁烷磺酸（PFBS）對(duì)H1 菌的生長(zhǎng)量和代謝活性均有促進(jìn)作用，對(duì)B2 菌的生長(zhǎng)量有促進(jìn)作用，而對(duì)其代謝活性有抑制作用。H1 菌和B2 菌在接種量為2%時(shí)，4 d 后對(duì)100 μg·L-1PFBS的去除率分別為33.18%和19.95%。

（2）H1 菌和B2 菌的胞外聚合物（EPS）主要成分為蛋白質(zhì)。100 μg·L-1PFBS 對(duì)這兩種菌分泌EPS 有抑制作用，EPS 中的蛋白質(zhì)、多糖濃度均降低，而蛋白質(zhì)/多糖比值增加，其中相比于B2 菌，H1 菌EPS 中蛋白質(zhì)、多糖濃度降低更多，蛋白質(zhì)/多糖的比值增加更少。

（3）三維熒光光譜結(jié)果表明，100 μg·L-1PFBS 脅迫下EPS中類蛋白質(zhì)、類腐植酸和類富里酸的熒光強(qiáng)度均降低；傅里葉紅外光譜結(jié)果表明，C—O、O—H 和N—H等官能團(tuán)峰強(qiáng)度降低。