Cd在地膚[Kochia scoparia（L.）Schrad.]中的化學(xué)形態(tài)及亞細(xì)胞分布

吳亮，朱姝，張皓，譚菊，王凡，牛鴻宇，譚璐，楊海君*

（1.核工業(yè)二三〇研究所，長(zhǎng)沙 410007；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省伴生放射性礦產(chǎn)資源評(píng)價(jià)與綜合利用工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410007；4.湖南省長(zhǎng)沙生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，長(zhǎng)沙 410001；5.長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004）

《2020 中國生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》顯示，影響農(nóng)用地土壤環(huán)境質(zhì)量的主要污染物是重金屬，其中Cd 為首要污染物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國農(nóng)田土壤Cd 污染面積已超過2.8×105hm2，受到Cd 污染的谷類作物高達(dá)1.46×108kg[1]。耕地Cd污染已嚴(yán)重威脅到農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和人民群眾身體健康，對(duì)耕地Cd 污染的治理迫在眉睫。重金屬在土壤中具有隱蔽性、滯后性、形態(tài)多樣性、累積性、消除難度大等特點(diǎn)，如何采取有效的技術(shù)方法修復(fù)土壤Cd 污染已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。常見的土壤重金屬污染治理方法有土壤置換、電動(dòng)修復(fù)等物理法和化學(xué)固定、化學(xué)淋洗等化學(xué)法，但采用這些方法治理Cd 污染存在可實(shí)施范圍窄、成本高、會(huì)破壞土壤原有結(jié)構(gòu)，且易造成土壤和地下水的二次污染等問題，因此至今未能大規(guī)模推廣應(yīng)用，也不適宜于大面積Cd污染農(nóng)田土壤的修復(fù)治理。而植物修復(fù)技術(shù)具有安全、廉價(jià)等特點(diǎn)，不僅可用于重金屬重度污染區(qū)（如礦山）的復(fù)墾，而且還可用于重金屬中輕度污染土壤的改良，同時(shí)對(duì)修復(fù)后的植物進(jìn)行資源化利用，可能產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益。相比于其他方法，植物修復(fù)技術(shù)引起次生環(huán)境問題的可能性小，且可通過回收與集中處置修復(fù)后的高富集性植物，徹底將重金屬從土壤中移除[2]。植物修復(fù)被認(rèn)為是重金屬污染土壤修復(fù)治理最有效的方法[3-4]，其關(guān)鍵是篩選獲取超富集植物以及對(duì)收獲植物的資源化利用。隨著對(duì)重金屬耐受性植物與超富集植物研究的日漸增多，植物修復(fù)作為一種凈化土壤的生態(tài)技術(shù)被推廣，相關(guān)的工程性試驗(yàn)研究以及實(shí)際應(yīng)用效果也顯示了植物修復(fù)技術(shù)商業(yè)化的可行性[5-6]。目前，國內(nèi)研究者已篩選出Cd 超富集植物80 種，隸屬于29 科69屬[7]。這些超富集植物在修復(fù)土壤Cd 污染的過程中發(fā)揮了較大作用[8-10]，但受自身生物量小、或本身具有入侵性、或栽培成本高、或經(jīng)濟(jì)價(jià)值低而影響到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者收入等諸多問題制約，其中某些超富集植物的推廣應(yīng)用受到限制。因此，探尋高富集、生物量大、易管理、適生性強(qiáng)、資源化利用程度高、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高及有助于改良土壤的先鋒植物是目前植物修復(fù)研究的重點(diǎn)。

地膚[Kochia scoparia（L.）Schrad.]別名掃帚菜，為藜科地膚屬一年生草本植物，成熟期株高50~100 cm，冠幅50~60 cm，花期7—9 月，果期8—10 月。地膚極耐旱、耐鹽堿和貧瘠、適生性強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)快、生物量大。地膚被人們廣泛栽種，其幼嫩部分可入藥或食用，成熟后可用于制作掃帚。目前對(duì)地膚的研究主要集中于其營養(yǎng)成分[11-12]、耐鹽生理特性[13-17]、栽培與園林應(yīng)用等方面，也有研究報(bào)道了地膚對(duì)礦區(qū)土壤重金屬的累積特性[18-20]、耐受和富集能力[21-22]，但尚未見到有關(guān)酸性土壤和Cd脅迫對(duì)地膚生長(zhǎng)及耐性機(jī)制的研究報(bào)道，該方面研究是對(duì)地膚開展實(shí)際應(yīng)用的前提。因此，本研究采用盆栽控制試驗(yàn)，測(cè)定Cd脅迫下地膚生物量及不同器官中的Cd 含量，分析地膚對(duì)Cd 的生長(zhǎng)響應(yīng)、各器官中Cd 的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律以及亞細(xì)胞分布和化學(xué)形態(tài)，揭示地膚對(duì)Cd 的積累和耐性機(jī)制，以期為其在耕地Cd 污染修復(fù)實(shí)踐中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)地位于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地（30°07'N，111°18'E）。試驗(yàn)時(shí)間為2021 年5 月3 日至10 月14日。供試盆栽土壤由自然土和營養(yǎng)土按體積比4∶1混合而成，混合后盆栽土壤pH 6.10，含水量25.88%，總Cd 1.253 mg·kg-1，有效態(tài)Cd 0.942 mg·kg-1。自然土采自試驗(yàn)地附近農(nóng)田表層土（0~20 cm），去除土壤中植物殘?bào)w和石子后，將土樣用竹筒充分碾細(xì)，碾細(xì)后自然土pH 6.23，總Cd 1.005 mg·kg-1，有效態(tài)Cd 0.895 mg·kg-1。營養(yǎng)土購于廈門市花仙谷農(nóng)業(yè)有限公司，pH 5.78，含水量31.15%，有機(jī)質(zhì)43.5%，總Cd 0.246 mg·kg-1，堿解氮337.6 mg·kg-1，有效磷660.6 mg·kg-1，速效鉀8 771 mg·kg-1，陽離子交換量54.6 cmol·kg-1，交換性鈣31.2 cmol·kg-1，交換性鎂10.9 cmol·kg-1，電導(dǎo)率0.262 mS·cm-1（水土比10∶1），銨態(tài)氮85.5 mg·kg-1，硝態(tài)氮306.8 mg·kg-1，通氣孔隙度25.89%，持水孔隙度49.97%。

本試驗(yàn)所用地膚苗來自湖南省長(zhǎng)沙縣黃花鎮(zhèn)長(zhǎng)湖村科研合作基地。地膚在移栽培植期間僅發(fā)生少量蚜蟲危害（為保障試驗(yàn)結(jié)果不受干擾未噴施任何殺蟲劑產(chǎn)品）。在地膚移栽培植期，每間隔7~10 d 澆水1次，待植株生長(zhǎng)至25~30 cm，追施有機(jī)肥水溶液（N+P2O5+K2O≥5%，總Cd 0.07 mg·kg-1），第一次追肥后，每間隔35 d追肥一次。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)盆栽土為混合土，土壤總Cd 含量1.253 mg·kg-1，設(shè)定每盆土壤質(zhì)量為10 kg（約占盆體積的4/5），Cd2+添加量（CdSO4溶液制備）依次為0、0.3、0.9、1.5、3.0、9.0 mg·kg-1，盆栽土壤中最終實(shí)測(cè)Cd 含量分別 為1.253、1.553、2.153、2.753、4.253、10.253 mg·kg-1。結(jié)合長(zhǎng)株潭地區(qū)耕地土壤pH 特征（pH 在4.5~6.5 之間的土壤占比89.34%），本試驗(yàn)盆栽土壤初始pH分別設(shè)定為6.1（T處理）和5.0（TS處理），試驗(yàn)各處理設(shè)計(jì)見表1。每盆土壤平衡14 d 后，于2021 年5 月17 日統(tǒng)一移栽株高、長(zhǎng)勢(shì)、生物量等均較一致的地膚幼苗。每盆移栽3 株地膚，株距均勻分布，盆下墊一淺托盤，植苗后統(tǒng)一移入活動(dòng)式塑料大棚內(nèi)，移栽當(dāng)日澆足水。移栽后1 周左右根據(jù)盆中土壤干濕情況進(jìn)行適量補(bǔ)水，借助便攜式土壤水分含量測(cè)定儀，使土壤含水量保持在70%左右。當(dāng)氣溫升至35 ℃及以上時(shí)，定期補(bǔ)水使土壤濕潤(rùn)，并保證光照充分，在強(qiáng)光照射和高溫天氣對(duì)地膚采取遮陽網(wǎng)防護(hù)。成熟期地膚樣品采集時(shí)間為2021年10月14日。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

在T1~T6 和TS1~TS6 處理中，每處理選取3 盆株高、長(zhǎng)勢(shì)、冠幅等均較一致的地膚進(jìn)行采樣，并在選取的3盆中各拔出1株完整地膚植株，用陶瓷剪刀剪下其根系和莖（上、中、下部混合剪取約5 g）鮮樣用于Cd的亞細(xì)胞及化學(xué)形態(tài)分析。將每盆中剩余的2株地膚用陶瓷剪刀分離植株根系和地上部，分裝于密封袋中并編號(hào)，進(jìn)行地膚的根系和莖Cd含量測(cè)定（因在采集成熟期地膚時(shí)，大部分葉已凋落，加之地膚葉生物量小，故未對(duì)地膚葉單獨(dú)進(jìn)行Cd含量檢測(cè)與分析）。

1.3.1 樣品Cd的測(cè)定

采用濕式消解法[23]，分別稱取一定量干燥后的根系、莖樣品粉末置于硬質(zhì)消解管中，加入10 mL 濃硝酸（14.5 mol·L-1），蓋上彎頸漏斗浸泡過夜，用管式消解爐消解，升溫程序?yàn)?0 ℃保持30 min，90 ℃保持30 min，120 ℃保持120 min，140 ℃保持120 min，然后趕酸至1 mL左右定容過濾，保存待測(cè)。

1.3.2 亞細(xì)胞組分的測(cè)定

亞細(xì)胞組分的分離采用差速離心法[24]。剪碎稱取地膚鮮樣（根系、莖）0.2 g，加入10 mL 預(yù)冷的提取液進(jìn)行研磨，提取液組成如下：0.25 mol·L-1蔗糖溶液，50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液，1 mmol·L-1二硫蘇糖醇溶液。提取液少量多次加入，在4 ℃低溫下用研缽將樣品研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)移到50 mL 離心管中，使用高速冷凍離心機(jī)（4 ℃）以4 000 r·min-1離心10 min，下部沉淀為細(xì)胞壁組分（Fcw），將上清液繼續(xù)在10 000 r·min-1下離心分離45 min，得到的下部沉淀為細(xì)胞器組分（For），上清液則為可溶性組分（Fs）。

1.3.3 Cd化學(xué)結(jié)合形態(tài)測(cè)定

參照Lu 等[25]的方法，利用化學(xué)試劑對(duì)地膚根系、莖細(xì)胞中不同化學(xué)形態(tài)的Cd進(jìn)行逐步提取。稱取地膚冰凍樣品0.5 g，少量多次加入20 mL 提取劑，用研缽將樣品研磨成勻漿后轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱振蕩24 h 后，以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min，將上清液分離，向離心管內(nèi)的沉淀物中再加入10 mL同種提取劑，25 ℃恒溫振蕩1 h后，于4 000 r·min-1離心15 min，將兩次離心后的上清液合并，形成以下由5 種提取劑依次逐步提取得到的Cd形態(tài)：FE，由80%乙醇提取后的硝酸鹽、氯化物為主的無機(jī)鹽及氨基酸等；Fw，由去離子水提取后的水溶性有機(jī)酸鹽、重金屬的一代磷酸鹽[M（H2PO4）2]等；FNaCl，由1 mol·L-1NaCl 溶液提取后的果膠酸鹽、與蛋白質(zhì)呈結(jié)合態(tài)或吸著態(tài)的重金屬Cd 等；FHAc，由2%HAc 提取后的難溶的金屬Cd 磷酸鹽等；FHCl，由0.6 mol·L-1HCl 提取后的草酸鹽等；FR，殘?jiān)鼞B(tài)。將上述分離的上清液和沉淀組分裝入三角瓶中，并置于電熱板（70 ℃）上蒸發(fā)至近干后，用HNO3-HClO4消解定容，采用ICP-MS測(cè)定Cd含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用3 個(gè)重復(fù)樣的算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。采用SPSS 25.0 軟件中的單因素方差（ANOVA），及最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）。采用LSD 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，用重復(fù)度量法分析不同pH 值、不同添加量Cd處理及二者交互效應(yīng)對(duì)地膚根系、莖中亞細(xì)胞Cd含量的影響，采用GraphPad Prime 8.3制圖。

富集系數(shù)（BCF）為地膚植株體內(nèi)（根系、莖）Cd含量（mg·kg-1）與土壤Cd含量（mg·kg-1）的比值。

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）為地膚植株地上部分（莖）Cd 含量（mg·kg-1）與地膚植株地下部分（根系）Cd 含量（mg·kg-1）的比值。

Cd 積累量（mg）為地膚植株各部位Cd 含量（mg·kg-1）與植株各部位干質(zhì)量（kg）的乘積。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)成熟期地膚生物量的影響

表2 為土壤Cd 脅迫對(duì)地膚生物量的影響。在T3~T6 處理下，地膚總生物量和莖生物量均逐漸升高，而根系生物量在T1~T5 處理下逐漸升高。T5 和T6 處理下的地膚總生物量相比T1 處理顯著增加（P<0.05），且T6 處理地膚莖生物量達(dá)到最高，比T1 處理增加了51.79%。地膚根系生物量在T5處理下達(dá)到最高，為T1 處理的2.22 倍。在TS 處理組中，隨著Cd 添加量的升高，地膚總生物量、根系生物量均呈先降低后升高的趨勢(shì)。在TS3 和TS4 處理下，地膚莖生物量相比TS1處理顯著降低（P<0.05），分別下降了42.73%和38.84%。在TS4、TS5及TS6處理下，地膚根系生物量相比TS1 處理顯著降低，分別下降了47.19%、61.82%和51.22%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，T4和T5處理下的地膚總生物量分別高于對(duì)應(yīng)的TS4 和TS5 處理，且TS1 處理的地膚莖和根系生物量在所有Cd 處理中均最高，顯著高于對(duì)應(yīng)的T1 處理（P<0.05），說明地膚在設(shè)定的酸性土壤環(huán)境中均能正常生長(zhǎng)，進(jìn)一步證實(shí)了地膚對(duì)酸性土壤的適應(yīng)性強(qiáng)。

表2 不同處理地膚的生物量（g，以干質(zhì)量計(jì)）Table 2 Biomass of Kochia scoparia（L.）Schrad.in different treatments（g，calculated by dry weight）

2.2 地膚植株對(duì)Cd的積累及其富集與轉(zhuǎn)移特性

圖1（a）為Cd 脅迫下地膚根系、莖中Cd 含量及根系與莖混合樣品Cd含量。T處理組地膚根系Cd含量變化范圍為3.27~13.36 mg·kg-1，莖部Cd 含量變化范圍為3.66~21.4 mg·kg-1，約為根系的1.12~1.60倍。隨著Cd添加量增加，地膚根系中Cd含量呈降低-升高-降低-升高的變化趨勢(shì)，莖中Cd含量呈升高-降低-升高-降低-升高的變化趨勢(shì)，且相同Cd 添加量處理下莖中Cd 含量均高于根系。TS 處理組地膚根系中Cd含量呈升高-降低-升高-降低-升高的變化趨勢(shì)，莖中Cd 含量呈先降低后升高的趨勢(shì)，除TS2 處理外，其余相同Cd 添加量處理下莖中Cd 含量均高于根系。從圖1 還可知，T4 和T6 處理的地膚莖中Cd 含量均顯著高于T1 處理（P<0.05），且T6 處理下地膚根系與莖中Cd 含量均達(dá)到最高值，分別為13.36 mg·kg-1和21.40 mg·kg-1，分別為T1 處理下的3.23 倍和4.91 倍；TS6處理下地膚根系與莖中Cd含量均顯著高于TS1處理（P<0.05），且TS6處理時(shí)地膚根系與莖中Cd含量均達(dá)到最高值，為15.67 mg·kg-1和16.08 mg·kg-1，分別是TS1 處理下的4.65 倍和4.12 倍。對(duì)比不同pH 值、相同Cd 添加量處理得知，除Cd 添加量為0.9 mg·kg-1時(shí)TS 處理地膚莖部Cd 含量高于T 處理外，在其余Cd添加量下，T處理地膚莖部Cd含量均高于TS處理。

圖1 Cd脅迫下地膚根系和莖中Cd含量及其積累量Figure 1 Cd content and accumulation in the root and stem of Kochia scoparia（L.）Schrad.under Cd stress

圖1（b）為Cd脅迫下地膚根系、莖中Cd積累量及根系與莖混合樣品Cd 積累量。所有處理下莖部Cd積累量均大于根系，說明Cd主要積累在地膚莖部。T處理組，隨著Cd 添加量升高，地膚根系中Cd 積累量呈現(xiàn)升高-降低-升高-降低-升高的變化趨勢(shì)，在莖中則呈現(xiàn)升高-降低-升高的變化趨勢(shì)，且莖中的增幅尤為明顯。T6 處理下根系和莖的Cd 積累量均達(dá)到最高值，為175.15 μg·pot-1和1 009.22 μg·pot-1。T 處理組中地膚莖的Cd 積累量為根系的4.01~6.50倍。TS處理組地膚根系的Cd積累量變化趨勢(shì)與T處理組大體相同，而莖的Cd 積累量則呈先降低后升高的趨勢(shì)，TS6 處理下根系和莖的Cd 積累量均達(dá)到最高值，分別為178.24 μg·pot-1和789.75 μg·pot-1。TS處理組中莖的Cd 積累量為根系的1.39~8.40 倍。此外，對(duì)比不同pH 值、相同Cd 添加量處理可知，T4~T6處理地膚莖部Cd積累量均高于TS4~TS6處理。

表3 為Cd 脅迫下地膚根系、莖及其混合樣品Cd含量和Cd 積累量的相關(guān)性分析結(jié)果。可以看出，地膚根系Cd 含量、根系與莖Cd 含量在T 處理與TS 處理組間相關(guān)系數(shù)均高于0.98，達(dá)極顯著相關(guān)水平（P<0.01），莖Cd 含量、莖Cd 累積量和根系與莖Cd 累積量組間相關(guān)系數(shù)均高于0.96，達(dá)顯著相關(guān)水平（P<0.05），但根系Cd累積量組間相關(guān)系數(shù)僅為0.76，相關(guān)性不顯著（P>0.05），表明地膚莖是積累Cd 的主要器官，地膚在不同土壤pH條件下，其莖部對(duì)Cd的富集能力不同。

表3 地膚根系、莖、根系與莖的Cd含量和Cd積累量的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of Cd content and accumulation in roots,stems,roots and stems of Kochia scoparia（L.）Schrad.

圖2 為地膚根系和莖在Cd 脅迫下的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)。T和TS處理組中地膚根系和莖Cd富集能力均為莖>根。T 處理組中地膚根系和莖的富集系數(shù)均大于1，均值分別為2.09 和2.84；TS 處理組地膚根系和莖的富集系數(shù)也大于1，均值分別為2.06和2.34。從圖2 還可知，隨著土壤Cd 添加量增加，T 處理組地膚莖部對(duì)Cd的富集能力呈現(xiàn)降低-升高-降低的變化趨勢(shì)，莖富集系數(shù)在T3 處理時(shí)最低，為1.70，而在T4處理時(shí)最高，是T3 處理的2.48 倍。TS 處理組的變化趨勢(shì)與T 處理組大致相同，莖富集系數(shù)在TS6 處理時(shí)最低，為1.57，在TS1 處理時(shí)最高，其次是TS4 處理。除TS2處理外，所有處理地膚的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均大于1，且在T4~T6 和TS3~TS5 處理時(shí)，地膚對(duì)Cd 的轉(zhuǎn)運(yùn)能力較強(qiáng)。對(duì)比不同pH 處理和相同土壤Cd 添加量下地膚莖部富集系數(shù)發(fā)現(xiàn)，除T6處理外，其余Cd處理下T處理組地膚莖部富集系數(shù)均高于對(duì)應(yīng)的TS 處理組，且T4~T6 處理組地膚的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)高于TS4~TS6 處理組。結(jié)合前文分析可知，地膚對(duì)pH 6.1 和Cd 含量范圍在2.0~10.0 mg·kg-1下的土壤富集能力較好，尤其對(duì)Cd含量為2.753 mg·kg-1（T4處理）下的土壤富集能力更佳。

圖2 Cd脅迫下地膚根系、莖的富集系數(shù)及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)Figure 2 BCF and TF in the roots and stems of Kochia scoparia（L.）Schrad.under Cd stress

2.3 地膚根系與莖中Cd的亞細(xì)胞分布

圖3 （a）為Cd在地膚根系亞細(xì)胞組分中的分布情況。Cd 脅迫下，細(xì)胞壁組分中Cd 的占比顯著高于可溶性組分和細(xì)胞器組分。T處理組地膚細(xì)胞壁組分占比為56.65%~84.33%，TS處理組地膚細(xì)胞壁組分占比為68.76%~84.51%；其次是可溶性組分，T處理組地膚可溶性組分占比為11.54%~31.89%，TS 處理組為11.02%~23.47%；T 處理組地膚細(xì)胞器組分占比為2.40%~6.67%，TS 處理組為2.12%~4.26%。從細(xì)胞內(nèi)Cd的分布比例來看，隨著Cd添加量增加，T處理組地膚根系細(xì)胞器組分和可溶性組分中Cd占比均呈現(xiàn)增加-減少-增加-減少的變化趨勢(shì)，并在T3處理時(shí)達(dá)到最高，分別占比6.67%和31.89%，而細(xì)胞壁組分中的Cd占比隨Cd添加量的增加呈減少-增加-減少-增加的變化趨勢(shì)。TS處理組中，地膚根系細(xì)胞器組分和可溶性組分中Cd占比呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì)，其中TS1處理時(shí)占比最高，分別占比4.26%和23.47%，而細(xì)胞壁組分中Cd的占比隨Cd添加量增加呈先增后減的趨勢(shì)。

圖3 Cd在地膚根系和莖的亞細(xì)胞組分中的分布比例Figure 3 Distribution ratio of Cd in subcellular fractions of the roots and stems of Kochia scoparia（L.）Schrad.

圖3（b）為Cd在地膚莖部亞細(xì)胞組分中的分布情況。T和TS處理組地膚莖部亞細(xì)胞中的Cd含量分布與根部一致，為細(xì)胞壁組分>可溶性組分>細(xì)胞器組分。各組分中的分布比例隨Cd添加量的增加變化幅度較小，莖Cd主要貯存于細(xì)胞壁組分和可溶性組分，其分布比例分別為T 處理53.35%~72.12%、TS 處理46.26%~60.06% 和T 處 理19.23%~35.73%、TS 處 理29.12%~39.68%，而TS處理組細(xì)胞器組分占比比根系中略高，為4.73%~10.84%?？梢钥闯?，地膚根部細(xì)胞壁的固持作用和液泡的區(qū)隔化作用較強(qiáng)，使得根系中細(xì)胞器Cd含量較少，基本維持在2%~3%，而地膚莖部是主要受Cd 脅迫的器官，其細(xì)胞器組分Cd 含量在4%~11%之間。對(duì)比不同pH、相同Cd 添加量處理下莖部亞細(xì)胞Cd含量發(fā)現(xiàn)，T1~T5處理組莖部細(xì)胞壁組分和可溶性組分中Cd含量之和高于TS1~TS5處理組，可見在pH 6.1的土壤中，地膚對(duì)Cd的抵御能力更強(qiáng)。

2.4 地膚根系與莖中Cd的化學(xué)形態(tài)特征

圖4 （a）為地膚根中不同提取態(tài)Cd 含量分布特征，其中以移動(dòng)性和毒性相對(duì)較低的醋酸提取態(tài)（FHAc）Cd 分配比例最大，T 處理為37.31%~56.24%，TS處理為40.98%~52.32%。隨著Cd 添加量增加，各處理組地膚根系中不同提取態(tài)Cd占比無明顯變化。地膚根系中Cd主要以醋酸提取態(tài)、氯化鈉提取態(tài)（FNaCl）和乙醇提取態(tài)（FE）為主，T 處理組三者占總提取態(tài)的82.96%~88.17%，其中醋酸提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)Cd分別占總提取態(tài)的37.31%~56.24% 和15.80%~27.68%，乙醇提取態(tài)、鹽酸提取態(tài)（FHCl）、去離子水提取態(tài)（FW）所占比例分別為13.47%~24.01%、4.08%~5.53%和0.41%~1.89%，殘?jiān)鼞B(tài)（FR）占比最小，僅占總提取態(tài)的0.81%~1.39%，且各處理間變化不明顯；TS處理組三者占總提取態(tài)的83.70%~89.70%，其中醋酸提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)分別占總提取態(tài)的40.98%~52.32%和14.59%~21.04%，乙醇提取態(tài)、鹽酸提取態(tài)、去離子水提取態(tài)所占比例分別為17.94%~25.89%、3.88%~7.97%和0.96%~1.22%，殘?jiān)鼞B(tài)占比最小，為0.63%~1.13%。

圖4 成熟期地膚根系與莖中各化學(xué)形態(tài)Cd分配比例Figure 4 Distribution ratios of Cd with different chemical forms in the roots and stems of Kochia scoparia（L.）Schrad.

圖4（b）為地膚莖中不同提取態(tài)Cd 含量分布特征，與根部情況一致，Cd 主要以醋酸提取態(tài)、氯化鈉提取態(tài)和乙醇提取態(tài)為主。氯化鈉提取態(tài)和乙醇提取態(tài)占比接近，殘?jiān)鼞B(tài)Cd含量最低。整體上看，莖中各化學(xué)形態(tài)Cd 含量比根部低。從所占比例來看，醋酸提取態(tài)所占比例最高（T 處理為33.20%~43.70%，TS 處理為30.39%~45.81%），氯化鈉提取態(tài)和乙醇提取態(tài)占比較為接近，T 處理組分別為23.25%~29.32%和21.99%~33.20%，TS 處理組分別為19.13%~32.00%和19.35%~45.02%，其次為鹽酸提取態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)和去離子水提取態(tài)，T處理組中占比分別為2.66%~5.99%、0.46%~1.16%和0.35%~0.83%，TS 處理組中分別為1.69%~5.20%、0.44%~1.16%和0.41%~0.92%?？梢姡啬w植株體內(nèi)的Cd 主要以醋酸提取態(tài)為主，說明Cd在地膚植株體內(nèi)主要以難溶于水的重金屬磷酸鹽形式存在。此外通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，TS1~TS4處理組的乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)所占比例高于T1~T4處理組，該兩種提取態(tài)的Cd 對(duì)植物細(xì)胞毒害最大，說明本研究地膚在pH 6.1、Cd添加量小于2.153 mg·kg-1的土壤中對(duì)Cd污染的抵御能力較好。

3 討論

3.1 Cd脅迫對(duì)地膚生長(zhǎng)及其Cd含量的影響

重金屬脅迫直接反映在植物生長(zhǎng)狀況和生物量的變化程度上。不同重金屬元素對(duì)植物生長(zhǎng)影響有不同的閾值[26]，當(dāng)環(huán)境中重金屬濃度超過閾值時(shí)，植物的生長(zhǎng)發(fā)育就會(huì)受到抑制，表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、植株矮小甚至死亡，進(jìn)而影響到植物的生物量[27]。本試驗(yàn)表明，在地膚成活率方面，所有處理組地膚在移植初期均能正常生長(zhǎng)，到移植中期，48 盆供試材料中僅有T5和TS6處理各有1株死亡，成活率為98.6%；在病蟲害方面，除少部分地膚在移栽中期發(fā)生輕微蚜蟲危害外，未見其他病蟲害發(fā)生；在Cd 毒害癥狀方面，未發(fā)現(xiàn)明顯的外觀反應(yīng)癥狀，如葉片斑點(diǎn)或枯黃、植株矮小等生長(zhǎng)異?，F(xiàn)象。綜合表明，當(dāng)重金屬Cd 進(jìn)入地膚體內(nèi)之后，植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)能力，生長(zhǎng)過程未受到顯著抑制，未發(fā)生如其他植物受到重金屬毒害時(shí)所表現(xiàn)出的葉片褪綠、生長(zhǎng)遲緩、植株矮小、產(chǎn)量下降甚至死亡等癥狀。由表2可知，Cd脅迫對(duì)地膚植株生物量產(chǎn)生了一定影響，說明地膚對(duì)不同程度Cd污染土壤具有不同的耐受性。在T處理組中，T6處理的地膚莖部生物量達(dá)到最高，比T1處理增加了51.79%；根系生物量在T5 處理時(shí)達(dá)到最高，為T1 處理的2.22 倍。這進(jìn)一步說明在pH 6.1 和Cd 添加量為0~9.0 mg·kg-1的土壤中，地膚生長(zhǎng)受Cd脅迫影響較小。在TS1、TS2及TS3處理下，地膚根系生物量分別與對(duì)應(yīng)的T1、T2、T3處理相比均更大，但在TS4、TS5及TS6處理下，地膚根系生物量分別與對(duì)應(yīng)的T4、T5 及T6 處理相比顯著降低，從而反映了在pH 5.0下低Cd含量處理（1.2~2.1 mg·kg-1）一定程度刺激了地膚根系的生長(zhǎng)發(fā)育，但在高Cd 含量?（2.7~9.0 mg·kg-1）脅迫下，地膚根系作為主要的Cd 積累部位受到了顯著影響，說明高含量的Cd 在弱酸性土壤中對(duì)地膚根系具有抑制作用，該研究結(jié)果與張楊楊等[28]的結(jié)論一致。就此來看，同一植株不同器官對(duì)Cd脅迫響應(yīng)結(jié)果不同的現(xiàn)象有待進(jìn)一步研究。

植物應(yīng)對(duì)重金屬脅迫通常采用排斥和積累兩種策略。就積累策略而言，一些植物大量富集Cd 離子后，將少量的Cd 儲(chǔ)存在根部，其余轉(zhuǎn)移到地上部分[29]。本研究發(fā)現(xiàn)地膚植株中的Cd 含量及積累量均表現(xiàn)為莖>根系，T和TS處理組的地膚莖部Cd積累量分別占植株總積累量的80.03%~86.67%和58.09%~89.35%，這與洋野黍、粗毛牛膝菊、珊瑚樹等植物對(duì)重金屬的積累分布規(guī)律[30-31]一致，可見地膚適用于南方酸性土壤的Cd 污染修復(fù)。劉歡[32]的研究結(jié)果表明，低濃度的低分子量有機(jī)酸能促進(jìn)植物體內(nèi)的Cd從地下部向地上部轉(zhuǎn)移，因此地膚地上部Cd 含量大于地下部的原因可能與試驗(yàn)土壤均呈弱酸性有關(guān)。Baker 等[33]將地上部Cd 富集量達(dá)到100 μg·g-1以上的植物稱為Cd 超積累植物。在已報(bào)道的超積累植物中[34]，天藍(lán)遏藍(lán)菜地上部Cd 含量為213 mg·kg-1，商陸地上部Cd 的最高富集量達(dá)482.25 mg·kg-1，寶山堇菜地上部Cd 含量高達(dá)1 168 mg·kg-1。與之相比，本研究對(duì)象地膚的Cd富集量最高未達(dá)到50 mg·kg-1，原因之一是本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Cd脅迫量顯著低于上述報(bào)道的土壤背景值。富集系數(shù)可衡量植物從土壤/基質(zhì)中富集重金屬的能力，也可以間接反映植物對(duì)重金屬的耐性[35]。富集系數(shù)越大，富集能力越強(qiáng)，越有利于植物修復(fù)。同時(shí)，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)是用來指示重金屬從植物根系轉(zhuǎn)移到其他器官的能力的值，轉(zhuǎn)移系數(shù)越大表示重金屬運(yùn)送能力越強(qiáng)，植物對(duì)重金屬的耐性也越強(qiáng)[36]。本研究中，T 和TS處理組（除TS2外）地膚的根和莖在不同添加量Cd脅迫下的富集系數(shù)均大于1，且根莖轉(zhuǎn)移系數(shù)也大于1，表明地膚在酸性土壤中對(duì)Cd有較強(qiáng)的富集能力。由此可見，地膚是一種較具潛力的土壤Cd污染修復(fù)植物。T6處理地膚根系和莖的富集系數(shù)相較T1 處理分別下降了60.96%和39.94%，TS6 處理地膚根系和莖的富集系數(shù)相較TS1 處理分別下降了43.12%和49.37%。Sun等[37]的研究也表明，低污染土壤中植物對(duì)重金屬的富集系數(shù)要高于嚴(yán)重污染的土壤，這可能是因?yàn)楦邼舛戎亟饘傥廴緦?dǎo)致植物的生命活動(dòng)受到抑制，造成植物富集能力降低。

需要說明的是，本研究為盆栽控制試驗(yàn)，這在一定程度上與大田生產(chǎn)實(shí)際存在差異。盆栽過程限制了地膚根部的生長(zhǎng)和拓展，相同種植條件下對(duì)比測(cè)定結(jié)果顯示，地膚盆栽植株根部生物量相比大田降低17%~22%，根部生物量的降低直接減少了植株對(duì)土壤Cd的積累和修復(fù)效果；從生長(zhǎng)基質(zhì)來看，本研究采用混合土壤作為栽培基質(zhì)，與大田的全自然土壤存在差別，Cd在其中的賦存形態(tài)、生物有效性等均有一定差異，這些都是可導(dǎo)致地膚對(duì)Cd富集效率、修復(fù)效果等方面的不確定性的因素；此外，盆栽環(huán)境在一定程度上縮短了地膚的生長(zhǎng)周期，據(jù)觀測(cè)，盆栽地膚的花果期相比田間開敞環(huán)境下提前了8~12 d，這直接造成了成熟期植株整株生物量和分蘗數(shù)量的下降，從而進(jìn)一步影響了其修復(fù)效果。彭云霄等[38]比較了大田與盆栽條件下重金屬Cd賦存形態(tài)的差異，通過數(shù)據(jù)對(duì)比驗(yàn)證了盆栽試驗(yàn)的可行性。本研究采用人工模擬和人工控制方式完成，對(duì)地膚的生長(zhǎng)習(xí)性、Cd 富集效率及土壤修復(fù)潛力均進(jìn)行了較深入完備的探索，為后續(xù)研究奠定了較好的基礎(chǔ)。如何更精準(zhǔn)地闡明地膚在不同生長(zhǎng)環(huán)境中的修復(fù)表現(xiàn)并將本成果更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際，是開展下一步工作的方向。

3.2 Cd在地膚亞細(xì)胞中的分布

重金屬被植物吸收后，會(huì)選擇性地分布在植物細(xì)胞的不同區(qū)域，以減輕重金屬的毒害作用。例如，植物對(duì)重金屬的耐受性表現(xiàn)在細(xì)胞壁的區(qū)室化固定作用，或以低毒、無毒的形式將其儲(chǔ)存在液泡中[39]。Cd在細(xì)胞中的區(qū)室化效應(yīng)可極大地影響細(xì)胞中游離Cd的水平，從而影響Cd在植物中的活動(dòng)[40]。因此，Cd在植物中的亞細(xì)胞分布被認(rèn)為是影響其遷移、積累和植物耐受程度的重要因素，不同植物在Cd的吸收、積累和分布方面存在顯著差異[41]。本研究對(duì)象地膚根和莖細(xì)胞中Cd的分布均表現(xiàn)為細(xì)胞壁>可溶性組分>細(xì)胞器，表明細(xì)胞壁和可溶性組分是貯存Cd 的主要位點(diǎn)，這與唐敏等[42]的研究結(jié)果相一致。但也有研究認(rèn)為植物體內(nèi)大部分Cd 儲(chǔ)存在細(xì)胞的可溶性組分（53.7%~68.3%）[43]，這種差異可能由土壤Cd含量不同以及植物對(duì)Cd的耐受機(jī)制不同所致。細(xì)胞壁可沉淀Cd2+，并可抑制其跨膜運(yùn)輸以降低細(xì)胞器中的Cd并維持正常生理功能，從而保護(hù)原生質(zhì)體免受Cd 毒害[44]。從細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組成看，其主要由多糖（包括纖維素、半纖維素和果膠）和蛋白質(zhì)組成，可提供大量官能團(tuán)，包括羧基、羥基、氨基和醛基等[45]，這些基團(tuán)可與Cd2+以配位鍵的方式結(jié)合，從而有效阻止Cd2+進(jìn)入細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞壁中的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和時(shí)，Cd 即被轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中，液泡中的細(xì)胞液是植物細(xì)胞重要的可溶性組分[46]。已有研究表明，細(xì)胞液中存在多種氨基酸、無機(jī)鹽、有機(jī)酸和有機(jī)堿[47]，Cd2+一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，大部分即被轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中，植物便可通過形成金屬螯合物來減少細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中游離Cd 的濃度以避免Cd脅迫[48]，從而極大地降低Cd 對(duì)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能的損傷。由此可見，細(xì)胞壁固定和液泡區(qū)室化作用均是植物提高重金屬解毒和耐受性的重要機(jī)制[49]。

3.3 Cd在地膚植株體內(nèi)的化學(xué)形態(tài)特征

除亞細(xì)胞分布外，Cd 在植物體內(nèi)的毒性和遷移能力也與其化學(xué)形態(tài)緊密相關(guān)[50]。在Wang 等[51]的研究中，重金屬的生物有效性隨著提取劑極性的增加而下降，對(duì)植物的毒害作用也逐漸減弱，6 種化學(xué)形態(tài)的Cd 毒性大小順序?yàn)镕E>FW>FNaCl>FHAc>FHCl>FR，以無機(jī)鹽態(tài)（FE，80%乙醇提?。┖退軕B(tài)（FW，去離子水提?。┵x存的金屬離子對(duì)植物細(xì)胞毒害最大；其次是果膠酸鹽態(tài)、蛋白結(jié)合態(tài)（FNaCl，NaCl 提?。┖碗y溶性磷酸鹽態(tài)（FHAc，2%醋酸提?。?；草酸鹽態(tài)（FHCl，HCl 提?。┑亩拘宰畹汀１狙芯恐?，地膚植物體內(nèi)Cd的主要賦存形態(tài)為醋酸提取態(tài)、氯化鈉提取態(tài)和乙醇提取態(tài)，氯化鈉提取態(tài)和乙醇提取態(tài)Cd 含量相近，這與Wang等[52]的研究結(jié)果一致。而在有些研究中[53-54]，植物體內(nèi)Cd 的主要賦存形態(tài)為1 mol·L-1NaCl、2%HAc和0.6 mol·L-1HCl 作為提取劑的提取態(tài)，這表明不同化學(xué)形態(tài)的Cd 在不同植物中的作用差異很大。目前，人們認(rèn)識(shí)到難溶于水的重金屬磷酸鹽主要存在于細(xì)胞壁和液泡中[55]，而果膠酸鹽態(tài)、蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)或吸附態(tài)的重金屬主要存在于液泡內(nèi)[56]。由此可知，Cd化學(xué)形態(tài)的分析結(jié)果與Cd 的亞細(xì)胞分布相關(guān)性顯著，即Cd 主要存在于地膚的細(xì)胞壁組分和可溶性組分中。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，地膚根部80%乙醇和去離子水的提取態(tài)Cd 在大部分處理中高于莖部，這兩種提取態(tài)的Cd 主要與細(xì)胞中硝酸鹽、氯化物為主的無機(jī)鹽、氨基酸鹽以及水溶性有機(jī)酸鹽相結(jié)合，具有較強(qiáng)流動(dòng)性[57]。流動(dòng)性強(qiáng)的Cd 在植物根和莖中分布比例較高將有利于Cd 通過共質(zhì)體途徑運(yùn)輸至地上部，這可能是地膚將更多的Cd 富集在莖中的一個(gè)重要原因。綜上所述，地膚根和莖中大量的Cd 以毒性較弱的醋酸提取態(tài)和氯化鈉提取態(tài)賦存是其降低Cd生物有效性、減少Cd毒害的一種重要防御機(jī)制。

4 結(jié)論

（1）地膚具有對(duì)不同Cd脅迫水平的耐性，且對(duì)酸性土壤有較強(qiáng)的適生性，適合用于南方酸性農(nóng)田土壤的修復(fù)治理。

（2）地膚根系和莖在不同水平Cd 脅迫下的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均大于1，莖部是積累Cd 的主要器官。本試驗(yàn)在1.5~9.0 mg·kg-1的Cd 添加量下，pH 6.1土壤中地膚的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)高于pH 5.0的土壤，說明土壤基質(zhì)的酸堿度直接影響地膚的修復(fù)效果。

（3）亞細(xì)胞水平上Cd 含量分布規(guī)律表現(xiàn)為細(xì)胞壁>可溶性組分>細(xì)胞器。地膚根部細(xì)胞器Cd所占比例比莖部低。在0~3.0 mg·kg-1的Cd 脅迫下，pH 6.1的土壤中，Cd 在地膚莖部細(xì)胞壁和可溶性組分中的占比高于pH 5.0的土壤。

（4）地膚植株中Cd 的主要賦存形態(tài)為醋酸提取態(tài)（FHAc）、氯化鈉提取態(tài)（FNaCl）和乙醇提取態(tài)（FE），表明地膚體內(nèi)的Cd 主要與磷酸鹽、果膠酸鹽、蛋白質(zhì)及以硝酸鹽、氯化物為主的無機(jī)鹽等物質(zhì)相結(jié)合，Cd 的這種賦存形態(tài)是地膚植株耐受Cd 污染的重要機(jī)制之一。