臭氧污染和EDU噴施對小麥葉際細(xì)菌群落的影響

蘇熠，程誠，王琪，劉園園，徐彥森，馮兆忠

（南京信息工程大學(xué)應(yīng)用氣象學(xué)院，南京 210044）

植物的地上部分被大量微生物定殖，Partida-Martínez 等[1]認(rèn)為不存在沒有微生物的植物。據(jù)Vorholt[2]估計(jì)，全球葉表面積約6.4×108km2，能定殖1×1026個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，每平方米約1×1016~1×1018個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，數(shù)量遠(yuǎn)超植物本身細(xì)胞數(shù)量。已有的研究表明，植物葉際細(xì)菌群落對植物生長與健康及生態(tài)系統(tǒng)功能有重要作用。這些細(xì)菌能通過產(chǎn)生吲哚乙酸、鐵載體等促生物質(zhì)來促進(jìn)植物對養(yǎng)分的吸收，提高植物生物量；通過產(chǎn)生抗氧化酶、抗生素等物質(zhì)來抑制病原菌對植物的侵襲，提高植物對多種環(huán)境脅迫的適應(yīng)性；甚至部分細(xì)菌還具有降解污染物的功能[3-5]。

臭氧（O3）作為最具植物毒性的空氣污染物之一，其環(huán)境效應(yīng)已經(jīng)成為公眾密切關(guān)注的問題。盡管1995—2014 年間歐洲和北美洲的大部分地區(qū)地表O3濃度有所下降，但是近年來東亞地區(qū)地表O3濃度仍呈現(xiàn)出普遍上升趨勢，尤其是中國和印度[6-7]。O3濃度升高會(huì)對植物造成一系列損害，包括葉片肉眼可見受損、光合作用受抑制、產(chǎn)量和品質(zhì)下降等[8-9]，O3已成為全球作物生產(chǎn)和食品安全的主要威脅之一[10]。小麥較其他農(nóng)作物對O3濃度升高更為敏感[11]。2010—2012 年間O3污染對印度和中國的小麥產(chǎn)量影響最嚴(yán)重，印度北部和中國西北部的大片地區(qū)產(chǎn)量損失超過15%[12]。Feng等[11]基于最新的O3劑量反應(yīng)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)O3污染使中國小麥產(chǎn)量下降了28.2%~36.9%。長三角作為農(nóng)作物主產(chǎn)區(qū)之一，也是我國O3主要污染區(qū)之一。2014—2019 年間O3濃度升高致使該區(qū)域冬小麥年減產(chǎn)20.4%，年經(jīng)濟(jì)損失約7億美元[13]。

O3主要通過引起氧化應(yīng)激反應(yīng)對農(nóng)作物產(chǎn)生損害[14]；植物通過氣孔將O3吸收到質(zhì)外體內(nèi)后，O3迅速降解并產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而干擾各種生理和酶促過程[15]。迄今，科研工作者已從生理、產(chǎn)量與品質(zhì)等方面系統(tǒng)研究了O3濃度升高對小麥的影響[16]，但是鮮有研究關(guān)注O3濃度升高對小麥葉際微生物群落的影響。

亞乙基二脲（N-[2-（2-氧代-1-咪唑烷基）乙基]-N'-苯基脲，EDU）作為一種抗O3劑被廣泛用于評價(jià)O3濃度升高對植被的影響[17]和篩選O3抗性品種[18-19]。EDU 常以葉面噴施、莖稈注射或土壤淋濕的方式施用于植物，其能有效增加植物光合色素含量、提高光合能力、改變抗氧化酶活性和抗氧化劑的濃度[20-24]?；贛eta 分析，F(xiàn)eng 等[25]發(fā)現(xiàn)，與對照相比，EDU 使O3引起的小麥葉片可見損傷降低76%，光合速率提高8%，地上生物量和小麥產(chǎn)量分別提高7%和15%。盡管大量研究表明EDU 可以保護(hù)植物免受O3傷害并抑制植物過早衰老，但其保護(hù)機(jī)制尚不清楚[26]。目前關(guān)于EDU 的作用機(jī)制主要包括：（1）可能通過降低氣孔導(dǎo)度來降低O3氣孔吸收通量[27]；（2）通過增加酶促或非酶促抗氧化劑去除葉片活性氧[20]；（3）作為氮肥[28]；（4）作為異生物質(zhì)，破壞激素穩(wěn)態(tài)[26]。然而EDU 對農(nóng)作物葉際微生物群落的調(diào)控研究尚未見報(bào)道。

植物根系微生物組相關(guān)研究表明植物會(huì)召集“脅迫微生物”來應(yīng)對各種生物和非生物脅迫，且這種選擇性的富集受植物代謝和免疫相關(guān)性狀的差異驅(qū)動(dòng)[29-30]。以上發(fā)現(xiàn)表明小麥也可能通過召集葉際“脅迫微生物”來應(yīng)對O3脅迫。本研究利用完全開放式O3熏蒸系統(tǒng)（O3-FACE）對長三角地區(qū)廣泛種植的小麥品種（農(nóng)麥88）進(jìn)行O3熏蒸，同時(shí)配以EDU 葉面噴施處理，于灌漿后期采集小麥葉片樣品，利用細(xì)菌16S rRNA 基因高通量測序技術(shù)解析O3濃度升高和EDU 噴施處理對小麥葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響。本研究假設(shè)：（1）O3熏蒸會(huì)改變小麥葉際細(xì)菌群落alpha和beta多樣性；（2）葉面噴施EDU也改變了葉際細(xì)菌群落alpha 和beta 多樣性，且提高葉際有益菌群豐度可能是其增強(qiáng)小麥O3耐受性的作用方式。預(yù)期結(jié)果能進(jìn)一步豐富小麥適應(yīng)O3濃度升高及EDU緩解小麥O3脅迫的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

本試驗(yàn)于2020年11月至2021年5月在江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)的南京信息工程大學(xué)揚(yáng)州綠色農(nóng)業(yè)研究與示范基地（32°44'N，119°25'E）開展，該試驗(yàn)區(qū)地處長江中下游平原，屬于典型的亞熱帶濕潤氣候。2020 年，該地區(qū)年均氣溫和年均降水總量分別為16.6 ℃和1 337.8 mm，年日照時(shí)數(shù)為1 455.4 h。該地區(qū)長期實(shí)行稻麥輪作，屬于典型的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)[31]。0~15 cm 根層土壤的基本理化性質(zhì)為pH 6.8、有機(jī)質(zhì)2.06%、總氮1.1 g·kg-1、速效鉀61 mg·kg-1、有效態(tài)磷30 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以農(nóng)麥88 作為供試植物，于2020 年11 月播種，2021年3月1日開始利用O3-FACE 進(jìn)行兩個(gè)O3濃度的熏蒸處理，包括環(huán)境O3濃度（濃度約為40.9 mg·L-1·h-1，A 處理）和1.5 倍環(huán)境O3濃度[濃度為（59.9±2.5）mg·L-1·h-1，E 處理]，每個(gè)O3濃度設(shè)置4 個(gè)FACE圈重復(fù)，每個(gè)FACE 圈為直徑14 m 的正八邊形，各圈之間間隔大于50 m，以避免相互干擾。O3發(fā)生器（HY003，濟(jì)南創(chuàng)成科技有限公司）產(chǎn)生的O3與空氣混合后通過置于冠層上方的布?xì)夤茚尫诺紽ACE 圈內(nèi)，并利用自動(dòng)化控制中心對FACE 圈內(nèi)O3濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，確保FACE 圈內(nèi)O3濃度維持在正常范圍內(nèi)。晴朗天氣每日熏蒸10 h（8：00—18：00），陰雨天則停止熏蒸，實(shí)際熏蒸49 d，O3濃度控制偏差率基本在15%以內(nèi)（圖1）。每個(gè)FACE圈設(shè)有3 m×3 m的亞區(qū)，熏蒸10 d 后開始對小麥進(jìn)行葉面噴施450 mg·L-1EDU[32]，以澆等量的水作為對照（水）處理，在噴施時(shí)，每株小麥的葉片能掛住溶液即可。每隔10 d 葉面噴施EDU溶液一次，如果噴施后的第二天遇上雨天則需要進(jìn)行補(bǔ)噴，試驗(yàn)期間共噴施EDU 6次。

圖1 O3-FACE平臺10 h（8：00—18：00）O3濃度平均值的動(dòng)態(tài)變化Figure 1 Variations of mean O3 concentrations in 10 h（8：00—18：00）

各圈播種時(shí)間、種植密度和日常管理均與周圍大田相同。其中，肥料按氮肥220 kg·hm-2，磷肥（P2O5）和鉀肥（K2O）均75 kg·hm-2的標(biāo)準(zhǔn)分別施入各圈，氮肥為尿素，磷肥和鉀肥均為復(fù)合肥。

1.3 葉片樣品收集與葉際微生物提取

于2021 年5 月13 日（即小麥灌漿期）采集葉片樣品，用卷尺測定株高。雙手用75%酒精消毒后，用表面消毒過的剪刀取各FACE 圈內(nèi)小麥倒二葉（每個(gè)FACE 圈內(nèi)每個(gè)小麥品種各取兩穴，20 株左右），每穴葉片樣品混合后放入無菌的牛皮紙袋帶回實(shí)驗(yàn)室備用。參考Wang等[33]的方法收集葉際微生物，取5片小麥葉片，浸入裝有300 mL無菌PBS緩沖液（0.02 mmol·L-1，pH 7.0，0.1%Tween 80）的1 L 三角瓶中，搖床28 ℃振蕩1 h后，再超聲振蕩20 min。利用孔徑為0.22 μm的濾膜抽真空富集葉際微生物，然后置于-80 ℃?zhèn)溆?。按Fast DNA spin 試劑盒（MP Biomedicals LLC，美國）的使用說明書提取葉際微生物基因組總DNA，DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，采用NanoDrop?2000分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國）測定其濃度。

1.4 PCR擴(kuò)增及高通量測序

利用引物799R/1993F 對葉際細(xì)菌16S rRNA 基因序列進(jìn)行擴(kuò)增[34]。每個(gè)引物上都連接了12 bp的獨(dú)特的barcode 以區(qū)分不同樣品。PCR 在50 μL 擴(kuò)增體系中進(jìn)行，包括25 μL PrimeSTAR Max Premix（2×）（TAKARA，大連）、正反向引物（Invitrogen，上海）各0.5 μL、1 μL DNA 模板（含DNA 10 ng）和23 μL 雙蒸水。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min 后，擴(kuò)增20 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸3 min[35]。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，使用AxyPre PCR 清潔系統(tǒng)（Axygen，杭州）對其進(jìn)行純化。將純化后的PCR 產(chǎn)物等摩爾質(zhì)量混合后，利用Illumina MiSeq 測序儀進(jìn)行高通量測序。原始數(shù)據(jù)已于NCBI數(shù)據(jù)庫獲得登錄號（SRP375487）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

參照Wang等[36]的方法，利用i-Sanger（http：//www.i-sanger.com）云數(shù)據(jù)分析平臺處理高通量測序獲得的細(xì)菌16S rRNA 基因序列。原始數(shù)據(jù)質(zhì)控處理后，利用UCLST 將高質(zhì)量序列聚類成OTU（相似性不低于97%）[37]。利用RDP 數(shù)據(jù)對每個(gè)OTU 進(jìn)行鑒定，置信閾值為0.80[38]。為避免不同測序深度對結(jié)果分析產(chǎn)生干擾，從每份樣本中隨機(jī)抽取15 000條序列進(jìn)行后續(xù)alpha和beta多樣性分析。

以香農(nóng)指數(shù)（Shannon）[39]和辛普森指數(shù)（Simp?son）[40]來表征細(xì)菌群落的alpha 多樣性?；贐ray-Curtis 距離計(jì)算方法，采用非度量多維尺度（NMDS）和主坐標(biāo)分析（PCoA）對不同處理樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類分析。利用Shapiro-Wilk 和Levene 檢驗(yàn)檢查數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性后，用JMP 10.0軟件中的雙因素方差分析（ANOVA）來解析O3、EDU 及其相互作用對株高、葉際細(xì)菌群落alpha 多樣性及優(yōu)勢種群相對豐度的影響。利用Tukey-Kramer HSD 檢驗(yàn)不同處理間的顯著差異性[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小麥生長的影響

如圖2所示，在對照處理?xiàng)l件下，E處理顯著降低了小麥株高（較A處理降低了9.4%）。A處理?xiàng)l件下，噴施EDU對小麥株高沒有產(chǎn)生顯著影響。E處理?xiàng)l件下，噴施EDU 使小麥株高提高了11.0%（P<0.05）。O3和EDU的交互作用對小麥株高沒有產(chǎn)生顯著影響。

圖2 O3濃度升高和EDU葉面噴施對灌漿期小麥株高的影響Figure 2 Effects of O3 and EDU leaf spraying on plant height

2.2 對小麥葉際細(xì)菌群落alpha多樣性的影響

如表1 所示，不同處理樣品細(xì)菌群落的覆蓋度（在序列97%的相似度的水平上）均高于0.97，表明本試驗(yàn)的測序深度包含了大多數(shù)細(xì)菌群落，能滿足后續(xù)序列分析的需要。不同處理?xiàng)l件下Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)沒有發(fā)生顯著變化，說明O3濃度升高、EDU 噴施及其交互作用均對小麥葉際細(xì)菌群落alpha多樣性沒有顯著影響。

表1 不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下小麥葉際細(xì)菌群落alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha-diversity indices of phyllosphere bacterial community of NM88 under different treatments

2.3 對小麥葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

基于不同樣品間的Braye-Curtis 相似距離計(jì)算，采用NMDS和PCoA 對不同樣品葉際細(xì)菌群落進(jìn)行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在NMDS圖和PCoA圖上A-水、AEDU、E-水、E-EDU 4 種處理的試驗(yàn)樣品分別聚成了不同的圈（圖3），這表明O3濃度升高和EDU噴施均改變了小麥葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖3 不同處理?xiàng)l件下細(xì)菌群落的非度量多維尺度分析（NMDS）和主坐標(biāo)分析（PCoA）Figure 3 Nonmetric multidimensional scaling（NMDS）analysis and principal coordinates analysis（PCoA）plot depicts the Bray–Curtis distance of bacterial communities in different treatments

2.4 對小麥葉際細(xì)菌優(yōu)勢菌門的影響

門水平上，小麥葉際細(xì)菌優(yōu)勢菌門為Proteobac?teria（84.7%~94.8%）、Bacteroidota（1.3%~13.1%）、Fir?micutes（1.6%~5.4%）。其中，Proteobacteria 中最優(yōu)勢綱為Gammaproteobacteria，占總細(xì)菌群落的75.2%~94.3%。如圖4所示，水處理?xiàng)l件下，O3濃度升高提高了Gammaproteobacteria 和Alphaproteobacteria 的相對豐度，但是未達(dá)到顯著水平。EDU 處理?xiàng)l件下，O3濃度升高使葉際Gammaproteobacteria 的相對豐度降低了14.3%（P<0.05），同時(shí)顯著提高了Alphaproteobacte?ria 和Bacteroidetes 的相對豐度（與對照相比分別提高了1.4倍和8.7倍）。

圖4 O3濃度升高、EDU噴施及其交互作用對小麥葉際優(yōu)勢細(xì)菌門相對豐度的影響Figure 4 Effects of O3，EDU and their interaction on the relative abundance of dominant bacterial phyla inhabiting phyllosphere and endosphere of rice leaves

A 處理中，EDU 噴施使Gammaproteobacteria 的相對豐度增加了9.7%（P<0.05），并使Bacteroidetes 的相對豐度降低了65.8%（P<0.05）。E 處理中，EDU 噴施卻使Gammaproteobacteria 的相對豐度降低了12.3%，使Bacteroidetes 的相對豐度增加了1.9 倍。O3和EDU的交互作用對Gammaproteobacteria 和Bacteroidetes 的相對豐度產(chǎn)生了顯著影響（P<0.001）。

2.5 對小麥葉際細(xì)菌優(yōu)勢種屬的影響

將總的葉際細(xì)菌群落中相對豐度高于1%的屬定義為優(yōu)勢屬，發(fā)現(xiàn)所有樣品中農(nóng)麥88 的優(yōu)勢屬相對豐度由高到低依次為Pseudomonas（21.8%）、Pan?toea（17.1%）、Duganella（9.7%）、Serratia（7.2%）、Er?winia（5.0%）、Sphingomonas（3.5%）、Paenibacillus（3.0%）、Massilia（2.6%）。

如 表2 所示，O3濃 度升高 對Massilia、Pantoea、Pseudomonas和Serratia的相對豐度產(chǎn)生了顯著影響。水和EDU 處理?xiàng)l件下，O3濃度升高使Pseudomonas和Serratia相對豐度均較A 處理分別顯著下降了50.6%~57.2%和41.4%~65.5%。EDU 處理?xiàng)l件下，O3濃度升高使Massilia相對豐度顯著下降了25.8%，而水處理下O3濃度升高對其相對豐度則無顯著影響。O3濃度升高僅在水處理?xiàng)l件下使Pantoea相對豐度顯著提高了5.7倍。

表2 O3濃度升高、EDU葉片噴施及其相互作用對葉際優(yōu)勢屬（占比1%以上）相對豐度的影響Table 2 Main effects of elevated O3，EDU leaf spraying，and their interaction on the relative abundance of abundant genus（more than 1%）

EDU噴施對Erwinia、Massilia和Pseudomonas的相對豐度產(chǎn)生了顯著影響。如表2 所示，E 處理下EDU使Erwinia相對豐度顯著下降了73.0%，而A 處理下EDU 對其相對豐度則無顯著影響。EDU 在A 處理?xiàng)l件下使Massilia和Pantoea相對豐度分別顯著提高了46.7%和274.0%。A 和E 處理下EDU 均降低了Pseu?domonas的相對豐度，但未達(dá)到顯著水平。O3和EDU的 交 互 作 用 對Duganella、Paenibacillus、Pantoea和Sphingomonas的相對豐度產(chǎn)生了顯著影響。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境O3濃度由40.9 mg·L-1·h-1升高至（59.9±2.5）mg·L-1·h-1對小麥的生長有抑制作用，具體表現(xiàn)為降低了小麥的株高（圖2）。之前的研究通過盆栽和田間試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)O3濃度升高顯著降低了小麥的生物量[41-42]。其主要作用機(jī)制為具有強(qiáng)氧化性的O3通過氣孔進(jìn)入植物體內(nèi)后經(jīng)一系列生化反應(yīng)產(chǎn)生活性氧自由基（ROS），ROS 進(jìn)一步破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成植物生理代謝混亂，進(jìn)而減弱光合作用并抑制生長[43]。而EDU 處理能使小麥保持較高的抗氧化酶活性和較高濃度的抗氧化劑，以保護(hù)細(xì)胞免受O3誘導(dǎo)的ROS 的傷害，維持葉片中較高的光合色素和蛋白質(zhì)水平[27]，并將更多的光合作用物質(zhì)轉(zhuǎn)移到生殖部位，從而提高產(chǎn)量。Tiwari 等[44]發(fā)現(xiàn)葉面噴施300 mg·L-1EDU 顯著提高了印度小麥（品種M533）的株高；本研究也發(fā)現(xiàn)在環(huán)境O3濃度和1.5 倍環(huán)境O3濃度條件下噴施EDU 均提高了小麥株高，尤其是1.5 倍環(huán)境O3濃度條件下噴施EDU 對小麥的促生作用更明顯（圖2）。Shang 等[45]利用開頂箱式O3熏蒸系統(tǒng)（OTC）通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在環(huán)境O3濃度[（39.6±1.9）mg·L-1·h-1]下葉面噴施EDU 能完全緩解水稻的O3脅迫，而在高濃度O3[（87.3±0.9）mg·L-1·h-1]下葉面噴施EDU 則部分緩解了O3脅迫。由此可知，葉面噴施EDU 對O3脅迫的緩解效果可能因品種和試驗(yàn)條件的不同而異。

生態(tài)系統(tǒng)多樣性越豐富，其對環(huán)境變化的耐受性也越高[46]。Wang 等[47]利用OTC 熏蒸系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，較之于炭過濾大氣，環(huán)境O3濃度升高40 mg·L-1·h-1時(shí)顯著提高了雜交稻南粳5055 葉際細(xì)菌生物多樣性，這可能是南粳5055對O3脅迫的一種積極應(yīng)對策略。本研究中1.5 倍環(huán)境O3濃度與葉片EDU 噴施處理及其相互作用，均沒有顯著影響葉際細(xì)菌群落的alpha 多樣性（表1）。研究結(jié)論的不一致可能與作物品種、O3熏蒸濃度及熏蒸方式相關(guān)。

本研究中葉際細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌門按相對豐度由高到低排列依次是Proteobacteria、Bacteroidota 和Firmicutes，根據(jù)已有的報(bào)道可知這3個(gè)菌門為植物葉際優(yōu)勢菌門[2，8，48]，與韓筱璇[49]和Xu等[50]的研究結(jié)果一致，本研究也發(fā)現(xiàn)Gammaproteobacteria 是小麥葉際最優(yōu)勢的種群。基于宏基因組研究，Sessitsch 等[51]發(fā)現(xiàn)在植物葉際占絕對優(yōu)勢的Gammaproteobacteria 參與了氮循環(huán)。氮是所有活細(xì)胞中尿素、氨基酸（蛋白質(zhì)）、核酸（DNA和RNA）、三磷酸腺苷（ATP）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的基本成分[52]，另外氮也是植物光合作用所必需的葉綠素的重要成分[53]。由微生物介導(dǎo)的氨化作用、硝化作用等氮循環(huán)過程能為植物提供速效和豐富的氮源，因此對植物生長與產(chǎn)量具有重要意義。由此可知Gammaproteobacteria 可能在維持植物生長與健康中起重要作用。另外Gammapro?teobacteria 也被報(bào)道能幫助植物抵御外部生物、非生物因子的干擾[54]。

PCoA 結(jié)果表明O3濃度升高和葉面噴施EDU 均顯著改變了小麥葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（圖3）。本研究發(fā)現(xiàn)水處理?xiàng)l件下O3濃度升高對Gammaproteobacte?ria 沒有顯著影響（圖4），這表明Gammaproteobacteria在維持小麥葉際細(xì)菌群落穩(wěn)定性中扮演了重要角色。另外在環(huán)境O3濃度條件下EDU 的噴施顯著提高了Gammaproteobacteria 的相對豐度，這可能是由于EDU為葉際細(xì)菌提供了豐富的氮源，而Gammaproteobacte?ria 是葉際氮循環(huán)的重要參與者。另外在本研究中，在O3濃度升高條件下葉面噴施EDU 顯著提高了Bac?teroidetes 的相對豐度，而在環(huán)境O3濃度下EDU 反而降低了Bacteroidetes的相對豐度（圖4）。Bacteroidetes從人類腸道到海洋水環(huán)境等各種環(huán)境都有著較高的豐度，盡管數(shù)據(jù)庫中儲存的屬于Bacteroidetes 的菌株序列并不多[55]。長期以來，滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為是Bacte?roidetes 的一個(gè)標(biāo)志性特征，它允許菌株主動(dòng)運(yùn)動(dòng)到葉片表面具有更多水分和養(yǎng)分的有利位置，并可能通過對養(yǎng)分或植物信號分子的趨化作用來輔助完成該過程[56]。Bacteroidetes 在進(jìn)化過程中還保留了高效節(jié)能的ACIIIcaa3COX 呼吸超復(fù)合體，這提高了它們競爭高分子量碳水化合物的適應(yīng)性[56]。另外，Bacte?roidetes 可以利用柔紅素家族色素作為紫外線保護(hù)劑[57]。綜上說明Bacteroidetes 對脅迫環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。因此，環(huán)境O3濃度下噴施EDU 為葉際細(xì)菌提供了豐富的氮源，從而降低了Bacteroidetes 的相對豐度；而1.5 倍環(huán)境O3濃度下小麥生長受到脅迫，葉面噴施EDU 可能通過提高Bacteroidetes 的相對豐度來增強(qiáng)小麥對O3脅迫的適應(yīng)性；但該結(jié)論仍需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

相對于棲息在植物地下部的微生物，葉際微生物在更開放的生境中面臨更多環(huán)境壓力[2]，葉際微生物勢必需要采取不同的策略應(yīng)對環(huán)境壓力以便在小麥葉片定殖。研究表明，Pantoea作為葉際細(xì)菌群落的優(yōu)勢屬，在固氮、促進(jìn)植物生長和抵御病原菌侵害中起重要作用[5]。本研究中水處理?xiàng)l件下O3濃度升高顯著提高了葉際Pantoea的相對豐度（表2），這可能是小麥自主適應(yīng)O3脅迫而提高葉際細(xì)菌氮素利用效率的一種適應(yīng)性策略。另外，葉際的優(yōu)勢菌屬Pseu?domonas和Sphingomonas也具有通過色素沉著來避免紫外線輻射的功能。優(yōu)勢屬M(fèi)assilia在植物表面的定殖能力很強(qiáng)，能通過產(chǎn)生吲哚乙酸、鐵載體有效促進(jìn)植物的生長，且其對微生境中養(yǎng)分的可用性與競爭也非常敏感，能通過產(chǎn)鐵載體和纖維素酶等途徑有效抵御包括Pythium等在內(nèi)的植物病原菌的侵襲[58]。綜上可知，葉際細(xì)菌從葉片表面獲得穩(wěn)定的微生境的同時(shí)也對植物生長有利。

了解葉際微生物的驅(qū)動(dòng)因素是制定植物管理策略的第一步，能促進(jìn)形成健康的葉際微生物群落結(jié)構(gòu)，從而有利于植物的健康和生態(tài)功能[59]。一般來說，植物微生物群落結(jié)構(gòu)由植物基因型、土壤、植物發(fā)育階段、植物組織、氣候和人類活動(dòng)等因素決定[60-61]。作為一個(gè)開放的生境，葉際微生物比內(nèi)生菌對非生物因素（包括輻射、干旱、風(fēng)速等）更為敏感[2]。Ueda等[62]認(rèn)為O3脅迫下不同程度的碳源有效性（如揮發(fā)性有機(jī)物VOCs 利用率）可能會(huì)影響水稻葉際微生物養(yǎng)分的有效性，從而影響微生物群落的組成。植物VOCs 排放對植物表面微生物群落的形成起重要作用[63]，然而這一觀點(diǎn)仍需通過進(jìn)一步的試驗(yàn)來驗(yàn)證。Yan 等[64]發(fā)現(xiàn)葉片的形貌特征在葉際細(xì)菌群落的形成過程中發(fā)揮了重要作用。此外，電解質(zhì)滲漏、葉片表面脂質(zhì)轉(zhuǎn)化和蠟質(zhì)也可能對葉際微生物產(chǎn)生影響。這些生理參數(shù)將在今后的研究中進(jìn)一步探討。

另外，盡管本試驗(yàn)為O3濃度升高、EDU 噴施及其交互作用對小麥葉際微生物群落的影響提供了新的見解和重要視角，但還需要更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)來闡明O3濃度升高和EDU 噴施對不同小麥品種的不同生長階段葉際微生物菌群的持續(xù)影響與重演性。特別是葉際微生物群落alpha多樣性和群落結(jié)構(gòu)與小麥產(chǎn)量之間的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）O3濃度升高降低了農(nóng)麥88 的株高，葉面噴施EDU能有效緩解O3脅迫對小麥生長的抑制。

（2）O3濃度升高、EDU葉面噴施顯著改變了農(nóng)麥88葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，但對alpha多樣性沒有顯著影響。

（3）農(nóng)麥88 葉際優(yōu)勢細(xì)菌門相對豐度由高到低依次為Proteobacteria、Bacteroidotes 和Firmicutes，其中Gammaproteobacteria 為最優(yōu)勢綱；O3濃度升高條件下EDU 顯著降低了Gammaproteobacteria 的相對豐度，同時(shí)提高了Bacteroidetes 的相對豐度；EDU 可能通過提高逆境適應(yīng)性強(qiáng)的Bacteroidetes 的相對豐度來增強(qiáng)小麥對O3脅迫的適應(yīng)性。