葉面噴施2，3-二巰基丁二酸降低水稻幼苗莖葉鎘含量的機制

王曉麗，王常榮，劉仲齊，黃益宗，孔維勇，黃永春*，劉斌

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南寧 537000）

鎘（Cd）是一種有較強致癌風(fēng)險[1]的高毒非必需重金屬元素。環(huán)境中的鎘主要來自于礦山開采[2]、污水灌溉[3]、施用有機肥[4]以及大氣沉降[5]等多種途徑。當(dāng)前，鎘已經(jīng)成為我國耕地中最主要的重金屬污染元素，其點位超標(biāo)率高達7.0%[6]。在我國南方部分水稻主產(chǎn)區(qū)，土壤鎘污染問題尤為突出，這給水稻安全生產(chǎn)帶來潛在威脅。目前水稻已成為我國第一大糧食作物，同時水稻也是一種對鎘富集能力較強的大宗農(nóng)作物[7]，即使土壤鎘濃度在較低水平下也可能會出現(xiàn)稻米鎘含量超標(biāo)現(xiàn)象。我國大部分人口以稻米為主糧，有研究表明我國人口攝入的鎘約56.0%來源于食用鎘污染稻米[8]。由此可見，鎘被水稻吸收后不僅會影響水稻的生長發(fā)育[9]，而且還會對人體健康造成潛在威脅。由稻田土壤鎘污染導(dǎo)致的稻米鎘超標(biāo)問題已經(jīng)引起全球環(huán)境科學(xué)家的廣泛關(guān)注。

為實現(xiàn)水稻的安全生產(chǎn)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已研發(fā)出多種有效的降鎘措施，如土壤重金屬鈍化技術(shù)[10-11]、水份調(diào)控技術(shù)[12]、植物修復(fù)技術(shù)[13]、篩選種植低鎘累積品種[14]等。近年來，隨著我國無人機產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，無人機噴施技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用，這極大提高了田間生產(chǎn)效率，顯著降低了生產(chǎn)成本，同時也助推了重金屬葉面阻控技術(shù)的快速發(fā)展。有研究表明，水稻籽粒中的鎘主要來源于營養(yǎng)生長階段累積在莖葉中的鎘[15]，以及灌漿期由根部吸收轉(zhuǎn)運的鎘[16]。在水稻灌漿期提高水稻營養(yǎng)器官對鎘的攔阻能力，大幅阻斷鎘從營養(yǎng)器官向籽粒中轉(zhuǎn)運可顯著降低稻米中鎘含量。已有研究表明，于水稻灌漿期噴施硅元素[17]、鋅元素[18-19]、硒元素[20]、小分子酸[21]等都具有顯著降低水稻籽粒中鎘含量的作用。這些技術(shù)主要通過增加莖稈細(xì)胞壁攔阻能力[22]或通過離子拮抗作用以及生理調(diào)控等機制達到降低水稻籽粒鎘含量的目的。目前開發(fā)出的重金屬葉面阻控劑產(chǎn)品大部分用于水稻開花灌漿期，但是在實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)適宜噴施時間窗口較短，因此存在在窗口期內(nèi)較難完成大面積推廣應(yīng)用的問題，而且在水稻開花期常遇到降雨等不適宜噴施的氣象條件，這就更加縮短了施工窗口期。因此生產(chǎn)上更希望開發(fā)出在苗期至抽穗期噴施也可降低水稻鎘含量的葉面阻控劑產(chǎn)品。

前期本課題組已研究發(fā)現(xiàn)，在田間條件下于水稻開花期噴施2，3-二巰基丁二酸（DMSA）可顯著降低水稻籽粒中的鎘含量[23]。水培試驗也表明，噴施DMSA 可顯著減少鎘由根部向莖葉轉(zhuǎn)運，降低水稻幼苗莖葉鎘含量[24]。DMSA 是一種含有雙巰基的重金屬螯合劑，在人和動物體內(nèi)其可與重金屬形成螯合物，進而通過排泄系統(tǒng)排出體外實現(xiàn)解毒功能[25]，醫(yī)療上可以作為人和動物的重金屬解毒劑。但是到目前為止，尚不清楚葉面噴施DMSA 降低水稻幼苗莖葉鎘含量的潛在機制。本研究擬借助水培試驗，系統(tǒng)研究葉面噴施DMSA 對鎘在水稻幼苗根、莖基、莖葉等不同器官中分布的影響以及對水稻幼苗營養(yǎng)器官鎘脅迫的緩解作用。利用分步提取技術(shù)研究噴施DMSA 對水稻幼苗不同營養(yǎng)器官中鎘化學(xué)形態(tài)的影響，采用差速離心技術(shù)研究鎘在幼苗莖基中的亞細(xì)胞分布情況，借助高效液相色譜分析莖基中總植物螯合素（PCs）和谷胱甘肽（GSH）含量。并在此基礎(chǔ)上，進一步探究鎘在水稻莖基細(xì)胞壁不同組分（包括果膠、半纖維素、纖維素）中的分布情況，以揭示噴施DMSA 降低水稻幼苗莖葉鎘含量的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)方法

以我國南方主栽水稻品種之一“中早35”作為試驗材料。將飽滿均一的種子在H2O2中浸泡消毒30 min 后用去離子水反復(fù)沖洗多次，然后均勻鋪在育苗盤上，在去離子水中進行第一階段培養(yǎng)。待種子發(fā)芽后移至人工氣候室內(nèi)，直至水稻幼苗長至兩葉一心期，將其轉(zhuǎn)移至盛有1/10 Hoagland 營養(yǎng)液的水培箱中進行第二階段培養(yǎng)，隨時觀察水稻幼苗生長情況并補充營養(yǎng)液。水稻幼苗長至三葉一心期時，挑選長勢一致的幼苗在去離子水中饑餓處理1 d后轉(zhuǎn)移至含有2.7 μmol·L-1CdCl2的1/10 Hoagland 營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，待噴藥處理。水培試驗在人工氣候室內(nèi)完成。人工氣候室條件參數(shù)為晝夜時間16 h/8 h，晝夜溫度28 ℃/20 ℃，相對濕度60%。

1.2 試驗處理及樣品采集

水稻幼苗在96孔水培箱中培養(yǎng)，每孔種植3株水稻幼苗，每箱共計288 株。水稻幼苗鎘脅迫濃度統(tǒng)一設(shè)定為2.7 μmol·L-1。將適量DMSA溶于pH=7.4的磷酸緩沖液中，用蒸餾水稀釋至300.0 mL，分別配制成濃度為0.2、0.4 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1的DMSA 溶液，每個濃度噴施處理設(shè)定5 次重復(fù)，每個重復(fù)噴施288 株幼苗，5 次重復(fù)共計1 440 株幼苗，同時設(shè)置只噴施磷酸緩沖液的對照處理（CK）。待水稻幼苗轉(zhuǎn)移至水培箱并經(jīng)Cd 脅迫處理3 d 后，立即進行第1 次DMSA 噴施處理，以后每隔3 d 噴施1 次，共噴施4 次。最后一次噴施處理3 d后采集樣品。采集的幼苗樣品用剪刀分為根、莖基及莖葉3 個部分后分別裝于信封中，于70 ℃烘箱中烘干后備用。

1.3 測定方法

1.3.1 鎘含量參照Gutsch 等[26]的方法測定水稻營養(yǎng)器官中的鎘含量。將烘干后的植株樣品取出并研磨成粉。準(zhǔn)確稱取粉碎后的根部樣品0.15 g，莖基樣品0.10 g，莖葉樣品0.25 g。將稱取的樣品置于消煮管中，加入7.0 mLMOS 級的濃HNO3浸泡過夜。在電熱消解儀上于110 ℃下加熱消解2.5 h，待樣品冷卻至室溫后加入1.0 mL H2O2繼續(xù)消解1.5 h，將溫度升至170 ℃繼續(xù)消解至管內(nèi)剩余硝酸體積小于0.5 mL 后停止加熱。待溫度降至室溫后用去離子水將樣品轉(zhuǎn)移定容至25.0 mL。用原子吸收光譜儀測定樣品中鎘含量。

1.3.2 鎘化學(xué)形態(tài)

采用分步提取法測定水稻樣品中鎘的化學(xué)形態(tài)，參照Guan 等[27]的方法進行試驗。提取劑依次為80.0%乙醇，去離子水，1.0 mol·L-1氯化鈉，2.0%醋酸，0.6 mol·L-1鹽酸。準(zhǔn)確稱取3.0 g 新鮮的水稻幼苗樣品加入20.0 mL 提取劑于低溫下勻漿，在25 ℃下恒溫振蕩22 h 后以3 000g離心10 min，倒出上清液。再向離心管中加入同種20.0 mL 提取劑于25 ℃恒溫振蕩2 h重復(fù)提取一次，3 000g離心10 min，合并兩次上清液于聚四氟乙烯消煮管中。每一種提取液均重復(fù)上述操作，共分5 次進行提取。提取液經(jīng)HNO3-H2O2消解后，用原子吸收光譜儀測定樣品鎘含量。將乙醇及去離子水提取組分合并在一起作為可溶性組分，其余組分作為難溶性組分。

1.3.3 鎘亞細(xì)胞分布

參照Xiao 等[28]的方法進行鎘亞細(xì)胞分布試驗。稱取新鮮的水稻幼苗樣品0.5 g，加入20.0 mL 經(jīng)預(yù)冷的勻漿緩沖液（0.25 mol?L-1蔗糖、50.0 mmol?L-1Tris-HCl 緩沖液和1.0 mmol?L-1二硫赤鮮糖醇），低溫下勻漿。勻漿液過80 μm 尼龍網(wǎng)后再用提取液沖洗尼龍網(wǎng)2次，收集合并濾液，殘余在尼龍網(wǎng)上的部分為細(xì)胞壁和細(xì)胞壁殘基。濾液于4 ℃下以20 000g離心45 min，上清液即為可溶性組分，沉淀為細(xì)胞器組分。參照1.3.1中的方法采用HNO3-H2O2消解，原子吸收光譜儀測定鎘含量。

1.3.4 細(xì)胞壁組分

參照Zhong等[29]的方法測定細(xì)胞壁組分。稱取水稻幼苗組織0.5 g，經(jīng)過液氮冷卻后研磨成粉末，用7 mL 75.0%的乙醇將粉末轉(zhuǎn)移至15.0 mL 離心管中，再在冰浴中靜置20 min。冷卻后的勻漿液于1 000g下離心10 min，沉淀依次用5.0 mL 冷凍丙酮、5.0 mL 甲醇-氯仿（1∶1）、5.0 mL 甲醇洗滌3 次。棄掉所有上清液，離心沉淀冷凍干燥過夜。經(jīng)過干燥的沉淀即為粗細(xì)胞壁組分。①果膠組分提?。合蚣?xì)胞壁粗提物中加入5.0 mL 0.5%的草酸銨緩沖液（含有0.1%NaBH4），在沸水中提取1 h，離心收集上清液；②半纖維素Ⅰ提?。簩⒉襟E①中剩余沉淀用5.0 mL 含有0.1% NaBH4的4.0% KOH 水溶液常溫提取24 h，3 000g離心，上清液中即為半纖維素Ⅰ組分，離心收集沉淀用于下一步提??；③半纖維素Ⅱ提?。簩⒉襟E②中離心獲得的沉淀繼續(xù)用5.0 mL 含有0.1%NaBH4的24.0%KOH 溶液常溫提取24 h，3 000g離心，上清液中為半纖維素Ⅱ組分；④纖維素提?。簩⒉襟E③中剩余沉淀部分凍干作為纖維素組分。提取液經(jīng)消解后用原子吸收光譜儀測定提取液中鎘含量。

1.3.5 植物螯合素（PCs）和谷胱甘肽（GSH）含量

參照周蓉等[30]的方法測定樣品中巰基化合物PCs和GSH 含量。稱取0.5 g新鮮的水稻樣品置于液氮中研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移至2.0 mL 的EP 管中，加入1.0 mL 含有0.1%三氟乙酸（TFA）和6.3 mmol?L-1DT?PA 的提取緩沖液振蕩混合均勻。于4 ℃下12 000g離心10 min，取250.0 μL 上清液分別加入650.0 μL 的HEPES 緩沖液和25.0 μL 的TCEP 溶液，混合均勻后于25 ℃下孵育5 min。再加入20.0 μL mbbr 溶液，于25 ℃避光條件下衍生化30 min。衍生化結(jié)束后向混合液中加入100.0 μL 1.0 mmol?L-1的MSA終止衍生化反應(yīng)，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后用HPLC 測定巰基化合物含量，采用外標(biāo)法定性和定量。將PCs2、PCs3、PCs4含量相加，作為總PCs含量。

1.3.6 過氧化氫（H2O2）含量

參照Tyburski 等[31]的方法，采用2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酯（DCFHA）標(biāo)記法測定水稻根系與莖葉中的H2O2含量。準(zhǔn)確稱取50.0 μmol·L-1的DCFHA于容量瓶中，加入pH為7.5的50.0 mmol·L-1磷酸緩沖液充分溶解并定容至1 000.0 mL。將水稻幼苗根系或葉片在配制好的DCFHA 樣品中浸泡2 h 后取出，經(jīng)50.0 mmol·L-1磷酸緩沖液反復(fù)沖洗3 次后在熒光顯微鏡下觀察熒光強度。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.3.7 過氧化氫酶（CAT）與超氧化物歧化酶（SOD）活性

CAT 與SOD 活性均使用試劑盒測定，試劑盒購買于索萊寶公司。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Excel進行相關(guān)數(shù)據(jù)的計算處理和制圖。利用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗。方差分析和多重比較采用單因素（ANOVA）和Dun?can 檢驗。

轉(zhuǎn)移效率為相鄰器官之間Cd含量的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施DMSA對水稻幼苗莖葉和根部鎘含量的影響

由圖1 可見，噴施DMSA 后水稻莖葉鎘含量隨著DMSA噴施濃度的增加出現(xiàn)顯著降低趨勢。當(dāng)DMSA噴施濃度達到0.4 mmol·L-1時，水稻幼苗莖葉中鎘含量降低27.8%，增加DMSA 噴施濃度至1.0 mmol·L-1時，水稻幼苗莖葉鎘含量繼續(xù)出現(xiàn)降低趨勢，但與噴施0.4 mmol·L-1的DMSA 處理相比未達顯著水平，表明0.4 mmol·L-1的DMSA為最佳降鎘噴施濃度。

圖1 噴施DMSA對水稻幼苗莖葉鎘含量的影響Figure 1 Effects of foliar application DMSA on Cd content in rice seedling stems and leaves

水稻幼苗根系中富集的鎘濃度較高（圖2），可以達到1 200.0 mg·kg-1以上。隨著DMSA 噴施濃度增加，水稻幼苗根部鎘含量未出現(xiàn)顯著降低或升高趨勢，表明噴施DMSA 對水稻幼苗根部鎘含量無顯著影響。

圖2 噴施DMSA對水稻幼苗根部鎘含量的影響Figure 2 Effects of foliar application DMSA on Cd content in rice seedling roots

2.2 噴施DMSA 對水稻幼苗莖基鎘含量和鎘轉(zhuǎn)移效率的影響

水稻幼苗莖基中富集了較高濃度的鎘（圖3），CK處理的幼苗莖基鎘含量達到275.0 mg·kg-1。隨著DMSA 噴施濃度增加，水稻幼苗莖基中鎘含量呈現(xiàn)顯著增加趨勢。當(dāng)DMSA 噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時莖基鎘含量達到433.0 mg·kg-1，與CK 處理相比增加了57.3%。結(jié)果表明噴施DMSA 顯著增加了水稻莖基對鎘的富集能力。

圖3 噴施DMSA對幼苗莖基鎘含量的影響Figure 3 Effects of foliar application DMSA on Cd content in stem base

由圖4 可知，隨著DMSA 噴施濃度的增加，鎘由水稻幼苗根部向莖基的轉(zhuǎn)移效率出現(xiàn)顯著增加趨勢。當(dāng)噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時根到莖基的轉(zhuǎn)移效率增加了45.5%。然而，鎘由水稻幼苗莖基向莖葉的轉(zhuǎn)移效率則出現(xiàn)顯著降低趨勢，當(dāng)噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時莖基到莖葉的轉(zhuǎn)移效率顯著降低了52.7%。以上數(shù)據(jù)表明，水稻莖基中累積了大量鎘，噴施DMSA 改變了鎘由根到莖基以及由莖基到莖葉的轉(zhuǎn)移效率，降低了鎘由莖基向莖葉轉(zhuǎn)運。

圖4 噴施DMSA對幼苗鎘轉(zhuǎn)移效率的影響Figure 4 Effects of foliar application DMSA on Cd transfer factors

2.3 噴施DMSA對水稻幼苗根部和莖基鎘形態(tài)的影響

水稻幼苗根部鎘主要以難溶態(tài)鎘形式存在（圖5），其占據(jù)根部總鎘含量的75.0%以上。隨著DMSA噴施濃度的增加，各試驗處理間根部難溶態(tài)鎘含量出現(xiàn)顯著增加趨勢，而可溶態(tài)鎘含量未出現(xiàn)顯著變化。當(dāng)DMSA 噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時，根部難溶態(tài)鎘含量與CK相比顯著增加18.1%。

圖5 噴施DMSA對水稻幼苗根部鎘形態(tài)的影響Figure 5 Effects of foliar application DMSA on Cd chemical form in rice seedling roots

由圖6 可見，水稻幼苗莖基中鎘的化學(xué)形態(tài)與根部鎘賦存形態(tài)類似，大部分以難溶態(tài)鎘形式存在。隨著DMSA 噴施濃度的增加，水稻幼苗莖基部難溶態(tài)鎘含量出現(xiàn)顯著增加趨勢。當(dāng)DMSA 噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時，難溶態(tài)鎘含量與CK 相比顯著增加80.8%，但是噴施DMSA 對莖基可溶態(tài)鎘含量無顯著影響。

圖6 噴施DMSA對水稻幼苗莖基鎘形態(tài)的影響Figure 6 Effects of foliar application DMSA on Cd chemical form in rice seedling stem base

2.4 噴施DMSA對水稻幼苗莖基鎘亞細(xì)胞分布的影響

水稻幼苗莖基細(xì)胞壁中鎘含量最高（圖7）。噴施DMSA 后水稻幼苗莖基細(xì)胞壁中鎘含量隨著DMSA 噴施濃度的增加出現(xiàn)顯著增加趨勢。噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時細(xì)胞壁中的鎘含量約是CK 組的2.1 倍。但是，噴施DMSA 對水稻莖基細(xì)胞器和可溶性組分中鎘含量無顯著影響。由以上結(jié)果可知，莖基中的鎘主要沉積在莖基細(xì)胞壁中。

圖7 噴施DMSA對水稻莖基鎘亞細(xì)胞分布的影響Figure 7 Effects of foliar application DMSA on Cd subcellular distribution in rice seedling stem base

2.5 噴施DMSA對鎘在細(xì)胞壁組分中分布的影響

由圖8 可見，水稻莖基細(xì)胞壁的果膠組分中鎘含量最高。隨著DMSA噴施濃度的增加，果膠、半纖維素Ⅰ、半纖維素Ⅱ組分中鎘含量均出現(xiàn)顯著增加趨勢。當(dāng)DMSA噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時，果膠中鎘含量與CK處理相比顯著增加99.5%，半纖維素Ⅰ中的鎘含量顯著增加65.5%，半纖維素Ⅱ中鎘含量顯著增加31.6%，但是纖維素中鎘含量未出現(xiàn)顯著變化。

圖8 噴施DMSA對鎘在水稻幼苗莖基細(xì)胞壁組分中分布的影響Figure 8 Effects of foliar application of DMSA on Cd distribution rice stem base cell wall

2.6 噴施DMSA對莖基PCs和GSH含量的影響

隨著DMSA 噴施濃度的增加，水稻幼苗莖基中GSH含量出現(xiàn)顯著增加趨勢（圖9）。當(dāng)DMSA噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時莖基中GSH含量達到CK處理的3.1倍，表明噴施DMSA顯著增加了莖基GSH的含量。

圖9 噴施DMSA對水稻幼苗莖基GSH含量的影響Figure 9 Effects of foliar application DMSA on GSH content in rice seedling stem base

由圖10 可見，隨著DMSA 噴施濃度的增加，水稻幼苗莖基中總PCs 含量也出現(xiàn)顯著增加趨勢。當(dāng)DMSA 噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時莖基中總PCs 含量達到CK 處理的2.2倍，表明噴施DMSA 顯著增加了莖基PCs的含量。

圖10 噴施DMSA對水稻幼苗莖基PCs含量的影響Figure 10 Effects of foliar application DMSA on PCs content in rice seedling stem base

2.7 噴施DMSA對水稻幼苗鎘脅迫的影響

由圖11可見，在激發(fā)波長為488 nm 條件下，H2O2分子經(jīng)標(biāo)記后在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光。CK處理幼苗葉片發(fā)出的綠色熒光強度最強，表明此時葉片中H2O2含量最高，葉片受到的鎘脅迫強度最大。隨著DMSA 噴施濃度增加，H2O2熒光強度出現(xiàn)顯著降低趨勢。當(dāng)噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時，葉片發(fā)出的綠色熒光強度最低，表明此時葉片在鎘脅迫下產(chǎn)生的H2O2量最少，鎘脅迫程度最低。

由圖12 可見，不同試驗處理的幼苗根部都發(fā)出較強的綠色熒光，水稻幼苗根部H2O2熒光強度未隨著DMSA 噴施濃度增加出現(xiàn)顯著降低趨勢，說明噴施DMSA對根部鎘脅迫未產(chǎn)生顯著緩解作用。

圖12 噴施DMSA對水稻幼苗根部鎘脅迫的影響Figure 12 Effects of foliar application DMSA on Cd stress in rice seedling roots

隨著DMSA 噴施濃度的增加，水稻幼苗莖葉中CAT 與SOD 的活性均呈現(xiàn)顯著增加趨勢（圖13），當(dāng)DMSA 噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時，莖葉中CAT 和SOD 活性分別達到CK 處理的2.7 倍和3.0 倍，但是對水稻幼苗根部CAT 與SOD 活性未造成顯著影響。以上結(jié)果表明，噴施DMSA 緩解了鎘對水稻幼苗莖葉的脅迫，但是對水稻幼苗根部的鎘脅迫未產(chǎn)生顯著緩解作用。

圖13 噴施DMSA對水稻幼苗CAT、SOD活性的影響Figure 13 Effects of foliar application DMSA on CAT and SOD activities of rice seedlings

3 討論

3.1 水稻幼苗莖基對鎘的攔阻作用

攔阻鎘由水稻根部向莖葉轉(zhuǎn)運對實現(xiàn)水稻安全生產(chǎn)、保障人體健康具有重要意義。水稻莖基部位是鎘由根向莖葉轉(zhuǎn)運的必經(jīng)之路，增加水稻莖基對鎘的攔阻作用可有效降低水稻莖葉鎘含量。Wang 等[32]的研究表明，低鎘累積水稻品種與高鎘累積水稻品種間莖基鎘含量存在顯著差異，低鎘累積水稻品種D62B莖基鎘含量是高鎘累積水稻品種Wujin4B 的1.57 倍，低鎘累積品種的莖基累積了更高濃度的鎘，降低了鎘向水稻莖葉轉(zhuǎn)運，莖基對鎘的攔阻作用是影響水稻籽粒中鎘含量的重要原因。Li 等[33]對油菜鎘轉(zhuǎn)運的研究也表明，莖基是抑制鎘由根部向莖葉中轉(zhuǎn)運的重要攔阻器官。上述兩篇文獻對莖基含硫化合物濃度變化的研究發(fā)現(xiàn)，PCs和GSH 等顯著增加對鎘具有螯合功能的巰基化合物含量，而正是由于這些含硫螯合物含量的增加導(dǎo)致大量鎘被攔阻在莖基中。PCs 和GSH是植物體內(nèi)重要的解毒物質(zhì)，它們的分子結(jié)構(gòu)中含有的活性巰基可以和多種重金屬元素如鎘、砷、鉛等形成螯合物[34]。在本研究中，噴施DMSA 顯著增加了水稻莖基鎘含量。當(dāng)DMSA 噴施濃度達到1.0 mmol·L-1時，莖基鎘含量與CK 處理相比顯著增加了57.3%，鎘由莖基向莖葉中的轉(zhuǎn)移效率顯著降低了52.7%。與之相應(yīng)，莖葉中鎘含量則顯著降低了27.8%。同時對莖基含巰基化合物PCs、GSH 的測定結(jié)果表明，隨著DMSA 噴施濃度增加，幼苗莖基中PCs 和GSH 的含量分別達到CK 處理的2.2 倍和3.1倍。據(jù)此推測，噴施DMSA 增加了莖基巰基化合物PCs和GSH的合成，進而導(dǎo)致大量鎘被PCs、GSH通過螯合作用固定在莖基部位，減少了向莖葉轉(zhuǎn)運。

水稻通過改變儲存在營養(yǎng)器官中鎘的化學(xué)形態(tài)從而起到自我解毒的作用[35]，一方面通過增加難溶態(tài)鎘的含量而降低活性鎘對水稻自身的脅迫作用，另一方面大量研究表明難溶態(tài)鎘一般分布于細(xì)胞壁與液泡中，因此難溶態(tài)鎘含量的增加還可能影響到鎘的亞細(xì)胞分布[29]。本研究中隨著DMSA 噴施濃度的增加，莖基難溶態(tài)鎘含量與CK 處理相比顯著增加80.8%。由此可見，莖基中雖然儲存了大量的鎘，但是大部分以難溶態(tài)形式存在，因此未對水稻幼苗生長造成顯著影響。此外，莖基中鎘大部分以難溶態(tài)形式存在減少了儲存在莖基中鎘向幼苗莖葉轉(zhuǎn)運，本研究中鎘由莖基向莖葉的轉(zhuǎn)移效率與CK相比顯著降低了52.7%。

3.2 莖基細(xì)胞壁對鎘的攔阻作用

植物根部細(xì)胞壁是阻礙鎘進入植物細(xì)胞的第一道屏障[36]。植物細(xì)胞壁主要由果膠、半纖維素、纖維素等多糖構(gòu)成。其中果膠是一種由ɑ-1，4-半乳糖醛酸聚合鏈構(gòu)成的多糖，包含大量含有陰離子的羧基基團，因此對金屬陽離子表現(xiàn)出高度親和性，對鎘離子具有強鍵合能力。在所有的細(xì)胞壁多糖中果膠是固定鎘的最主要組分，尤其是當(dāng)果膠脫甲基化以后對鎘的固持能力更加突出[37]。半纖維素包含多種功能基團（如羧基、羥基、醛基），因此也能夠與鎘鍵合阻止鎘向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。植物細(xì)胞壁中的半纖維素和果膠在與鎘鍵合過程中發(fā)揮最重要作用。鎘脅迫通常會誘導(dǎo)植物根細(xì)胞壁中合成更多的果膠和半纖維素，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁對鎘的持留容量增加[38]。前人研究表明，細(xì)胞壁對鎘具有重要的攔截作用，而且大部分?jǐn)r截的鎘分布在果膠和半纖維素組分中。截止到目前，大部分關(guān)于細(xì)胞壁攔阻鎘的報道都集中在對水稻根系的研究方面，對莖基和莖稈報道較少。本研究中噴施DMSA 顯著增加了水稻幼苗莖基鎘含量，對幼苗根部鎘含量無顯著影響。對幼苗莖基細(xì)胞壁鎘含量的測定結(jié)果表明，細(xì)胞壁鎘含量隨著DMSA 噴施濃度升高呈現(xiàn)顯著增加趨勢，細(xì)胞壁中鎘含量最高達到CK 處理的2.1倍。進一步對細(xì)胞壁果膠組分鎘含量的測定結(jié)果表明，細(xì)胞壁中大部分鎘存在于果膠組分中，其次是半纖維素組分，而且隨著DMSA 噴施濃度增加兩組分中的鎘含量也出現(xiàn)逐漸增加趨勢。以上結(jié)果進一步表明，噴施DMSA 增加了水稻幼苗莖基對鎘的攔阻作用，而且莖基中的鎘主要分布在細(xì)胞壁的果膠和半纖維素多糖組分中。

3.3 噴施DMSA對鎘脅迫的影響

重金屬脅迫對植物生長具有重要影響，可能導(dǎo)致農(nóng)作物植株矮小、葉片失綠等，解除鎘脅迫恢復(fù)作物正常生長對提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。噴施葉面阻控劑往往在一定程度上會同時降低營養(yǎng)器官中重金屬含量，因此大部分葉面阻控劑成分都具有一定的緩解重金屬脅迫的功能。Li 等[39]通過水培試驗和田間試驗發(fā)現(xiàn)，葉面噴施茉莉酸可以顯著降低水稻籽粒和莖葉中鎘含量，同時還可以顯著提高葉片中CAT、SOD 活性，顯著緩解水稻鎘脅迫。葉面噴施蘋果酸[21]、硅[17]、硒[20]等也可顯著降低鎘含量，緩解鎘脅迫導(dǎo)致的氧化損傷功能。重金屬脅迫引發(fā)的氧化損傷往往導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，進而產(chǎn)生大量丙二醛（MDA），該指標(biāo)是表征植物氧化損傷程度的重要指標(biāo)之一。楊曉榮等[24]的研究表明葉面噴施DMSA 可以顯著減少葉片組織中MDA 含量。本研究中，噴施DMSA 使水稻莖葉中具有抗氧化損傷功能的CAT 和SOD 活性升高，最高分別達到CK 處理的2.7 倍和3.0倍，同時熒光標(biāo)記試驗結(jié)果表明H2O2熒光強度隨著DMSA 噴施濃度升高出現(xiàn)顯著降低，說明葉面噴施DMSA使水稻葉片受到的鎘脅迫得到有效緩解。但是本研究中水稻幼苗根部H2O2熒光強度隨著DMSA噴施濃度升高未出現(xiàn)顯著降低趨勢，同時噴施DMSA也未對根部鎘含量造成顯著影響，這些結(jié)果表明噴施DMSA對水稻幼苗根部鎘脅迫無顯著緩解作用。

4 結(jié)論

（1）噴施2，3-二巰基丁二酸通過顯著增加水稻幼苗莖基中植物螯合素和谷胱甘肽含量增加了莖基對鎘的攔阻作用，從而減少鎘向莖葉轉(zhuǎn)運，降低水稻幼苗莖葉中鎘含量。

（2）水稻幼苗莖基中持留的鎘主要被固定在細(xì)胞壁果膠組分和纖維素Ⅱ組分中。