裂殖壺藻SlMYB118基因的克隆及生物信息學(xué)分析

陳 菁，蘇永昌，孫化淼，陳由強(qiáng)，薛 婷*，代容春*

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.海洋生物醫(yī)藥與制品產(chǎn)業(yè)化開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺，福建 福州 350117；3.福建省特色海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，福建 福州 350117；4.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013)

DHA(Docosahexaenoic acid)，即二十二碳六烯酸，是一種多不飽和脂肪酸，在人體內(nèi)無法自行合成，具有促進(jìn)大腦發(fā)育、保護(hù)視網(wǎng)膜、降低甘油三酯含量、改善血管功能和治療心腦血管疾病等重要作用[1-3]。DHA的主要來源是深海魚油和海洋微藻[4]，其中魚油是DHA的傳統(tǒng)來源，但受魚的品種、部位、季節(jié)、產(chǎn)地的影響而產(chǎn)生波動，DHA含量不穩(wěn)定，此外魚油生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜，產(chǎn)品多具有腥味，且易受海洋污染物的影響[5-8]；而可生成DHA的微藻能夠彌補(bǔ)魚油資源有限的缺陷，其培養(yǎng)具有不受季節(jié)、地域等條件的限制，培養(yǎng)周期短、產(chǎn)量高、不含有魚腥味、脂肪酸組成和提取純化工藝簡單、不破壞生態(tài)環(huán)境的特點和優(yōu)勢，打破了傳統(tǒng)魚油應(yīng)用的限制[9-10]。因此，利用海洋微藻生產(chǎn)DHA具有更加廣闊的應(yīng)用前景。

裂殖壺藻(SchizochytriumlimacinumSR21)是一種單細(xì)胞海洋真菌[11]，同時又是一種富含DHA的海洋微藻。裂殖壺藻具有生長速度快、生物量高、發(fā)酵周期短且安全、易于提純等優(yōu)勢[12]。根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理辦法》的規(guī)定，衛(wèi)生部批準(zhǔn)的新資源食品中包括DHA藻油，其中裂殖壺藻被列為DHA藻油的來源之一。鑒于其DHA藻油商業(yè)化應(yīng)用的許可不存在行政障礙，且世界很多國家已有其藻油DHA商業(yè)生產(chǎn)的成功先例，商業(yè)化應(yīng)用較為成熟，因此選擇裂殖壺藻為天然DHA的合成工具，作為DHA規(guī)模化、商業(yè)化應(yīng)用的理想藻株。

目前，裂殖壺藻的研究還停留在結(jié)合DHA合成途徑菌株性能的改善、發(fā)酵過程的調(diào)節(jié)以及油脂的提取和純化[13]。而近年來，植物轉(zhuǎn)錄因子的研究已成為熱點之一，調(diào)控脂肪酸合成和油脂積累的轉(zhuǎn)錄因子更是備受青睞。轉(zhuǎn)錄因子并不單獨(dú)作用，而是形成代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同發(fā)揮調(diào)控脂肪酸合成的作用，這些轉(zhuǎn)錄因子分屬各個家族，包括AP2家族、B3家族、DOF家族、MYB家族、HAP3/CBP和CHD3等[14]。研究報道，擬南芥MYB118基因是與種子發(fā)育時胚胎建成、脂肪酸從頭合成和代謝及油脂積累相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)MYB118基因能夠正調(diào)控一系列與脂肪酸合成、糖酵解途徑相關(guān)的基因，從而調(diào)控種子中脂肪酸的生物合成和油脂的積累[15]，但該基因在其他物種中有關(guān)脂肪酸生物合成的調(diào)控研究尚未見報道。為了挖掘裂殖壺藻DHA合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，本課題組前期利用氮源脅迫下不同培養(yǎng)時期的細(xì)胞RNA-Seq數(shù)據(jù)，通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)方法構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，尋找到1個與DHA含量特異相關(guān)的模塊，且該模塊中的關(guān)鍵基因[包含SlMYB118基因(GenBank登錄號：OQ784160.1)]與脂肪酸的合成相關(guān)，由此推斷該模塊中SlMYB118基因是潛在的裂殖壺藻 DHA合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子[16]。因此，本文對裂殖壺藻的SlMYB118基因進(jìn)行研究，經(jīng)PCR實驗過程獲取該基因的cDNA全長，并對SlMYB118基因進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，預(yù)測蛋白質(zhì)的親/疏水性、保守結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)預(yù)測以及系統(tǒng)進(jìn)化等生物信息，為后續(xù)確定SlMYB118基因的結(jié)合位點在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究、DHA合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的建立奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藻種

裂殖壺藻購買于美國馬里蘭洲洛克菲勒的美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。

1.1.2 試劑

TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trans5α Chemically Competent Cell、EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit、X-gal(20 mg/mL)、IPTG(500 mmol/L)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TIANgel Maxi Purification Kit購自天根生化科技(北京)有限公司；克隆載體pMD19-T、DNA Marker購自Takara公司；Gloria Nova HS2X Master Mix、瓊脂粉購于ABclonal公司；蛋白胨、酵母粉、氨芐青霉素鈉購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖購自西隴科學(xué)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

采用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺藻，配方為1 L海水中加入5 g葡萄糖、1 g蛋白胨和1 g酵母粉，于115℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min，pH為5。

1.1.4 設(shè)備

滅菌鍋[施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司]、新型迷你型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)、小型臺式冷凍離心機(jī)(德國艾本德股份公司)、DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)、Mini PCR儀(美國Applied Biosystems)、凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)、電熱恒溫水槽(上海恒一科技有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(福州科遠(yuǎn)貿(mào)易有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 裂殖壺藻總RNA的提取

取2 mL、密度為5.58×107個/mL、處于對數(shù)生長期的藻液接種，加入裝有100 mL YPD培養(yǎng)基的錐形瓶中，振蕩培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置為28°C、轉(zhuǎn)速設(shè)置為200 r/min。培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，取50 mL裂殖壺藻，利用離心機(jī)8 000 r/min離心5 min。將藻泥裝入1.5 mL離心管中，用液氮速凍，取出后加入TransZol Up試劑1 mL，然后加入直徑為4 mm的鋼珠，利用自動研磨儀進(jìn)行研磨，參數(shù)設(shè)置為60 Hz、3 min。之后的步驟按照TransZol Up Plus RNA Kit的說明書進(jìn)行提取，提取結(jié)束后，利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證該RNA的質(zhì)量，以及利用NanoDrop-2000分光光度儀檢測RNA的濃度。利用所提的RNA為模板，遵循反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求，合成cDNA的第一鏈，并保存于-20°C以備用。

1.2.2SlMYB118基因的擴(kuò)增

利用SnapGene軟件設(shè)計引物。依據(jù)本實驗室建立的裂殖壺藻基因組數(shù)據(jù)庫中的SlMYB118基因序列來設(shè)計一對引物：上游(F)、下游(R)(表1)，下劃線為EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點，并且送到福州尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

表1 SlMYB118基因引物序列

以cDNA為模板擴(kuò)增SlMYB118基因，采用Gloria Nova HS2X Master Mix，以F和R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA模板2 μL，F(xiàn)、R引物各1 μL，Gloria Nova HS2X Master Mix 25 μL，ddH2O 21 μL。在PCR儀中，首先94°C預(yù)變性5 min；其次94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸1 min，35個循環(huán)；再72°C終延伸7 min；最終4°C保存。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測并分離，之后利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.3 目的基因的克隆及測序

在16°C連接儀中，將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans5α Chemically Competent Cell，并涂布于藍(lán)白斑篩選平板培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)箱中倒置、過夜培養(yǎng)。挑單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，菌液進(jìn)行抽提質(zhì)粒驗證并送至杭州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 裂殖壺藻SlMYB118蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

裂殖壺藻SlMYB118蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)內(nèi)容如表2所示。

表2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測的相關(guān)軟件網(wǎng)站

2 結(jié)果與分析

2.1 裂殖壺藻總RNA的提取

圖1是裂殖壺藻總RNA的凝膠電泳結(jié)果。從圖1可以看出，有兩條清晰的條帶在凝膠上，條帶分別是28 S和18 S。圖像結(jié)果證實試驗所提取的總 RNA 較完整。RNA經(jīng)超微量紫外分光光度計檢測，所提取的總RNA的濃度為220 ng/μL，OD260 /OD280 比值為1.81，表明所提取的總RNA符合反轉(zhuǎn)錄的實驗要求。

注：1、2、3為裂殖壺藻的總RNA。

2.2 以裂殖壺藻cDNA為模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以裂殖壺藻cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，與DL 2000 marker進(jìn)行對比，可見擴(kuò)增片段約為2 000 bp，與目的片段大小吻合(圖2)。

注：M為DL 2000 marker；1為cDNA擴(kuò)增。

2.3 pMD19-T克隆目的片段的檢測結(jié)果

抽提質(zhì)粒，電泳結(jié)果如圖3所示。電泳圖顯示，重組質(zhì)粒片段約為5 026 bp，目的片段的大小與預(yù)期的相一致，表明SlMYB118基因的cDNA成功連接在PMD19-T質(zhì)粒上。將成功克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序，經(jīng)SnapGene軟件分析的測序結(jié)果與裂殖壺藻SlMYB118基因的cDNA序列比對一致(圖4)，表明重組質(zhì)粒PMD-SlMYB118構(gòu)建成功。

注：M為Supercoiled ladder；1為PMD-SlMYB118質(zhì)粒。

2.4 裂殖壺藻SlMYB118基因的生物信息學(xué)分析

2.4.1 裂殖壺藻SlMYB118蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

經(jīng)Bioedit軟件分析，裂殖壺藻SlMYB118基因的cDNA序列全長為2 280 bp，其中G+C含量為53.11%，A+T含量為46.89%。使用ProtParam Tool分析，SlMYB118蛋白質(zhì)分子量為84.81 kDa，分子式為C3601H5604N1194O1155S22，理論等電點(pI)為8.75。該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)為70.54(<40為穩(wěn)定蛋白質(zhì))，推測其為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。預(yù)測該蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)的半衰期大于10 h，在酵母中表達(dá)的半衰期大于20 h，而在哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞中體外培養(yǎng)表達(dá)的半衰期為30 h。SlMYB118蛋白質(zhì)由20種基本氨基酸組成，氨基酸殘基較多的是谷氨酰胺(Gln，8.6%)、組氨酸(His，8.8%)和絲氨酸(Ser，12.9%)，氨基酸殘基較少是苯丙氨酸(Phe，1.7%)、酪氨酸(Tyr，1.4%)、色氨酸(Trp，1.1%)以及半胱氨酸(Cys，0.5%)。由表3可知，SlMYB118蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷的氨基酸72個(Asp+ Glu)、正電荷的氨基酸76個(Arg+ Lys)。

表3 SlMYB118蛋白質(zhì)的氨基酸組成

續(xù)表3

2.4.2 親/疏水性分析

經(jīng)ProtScale在線程序分析，親/疏水性最大值為1.667(位于第754位氨基酸處)，最小值為-3.622(位于第190位氨基酸處)，總平均疏水性為-1.087，同時SlMYB118蛋白質(zhì)含有較多的親水域，說明SlMYB118蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)(圖5)，其脂肪系數(shù)為53.04。

2.4.3 結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖6中，根據(jù)NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(CDD)的結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)具有Myb_DNA-binding結(jié)構(gòu)域，同時該結(jié)構(gòu)域同屬于SANT超家族。SANT超家族是Myb超家族蛋白質(zhì)，包括轉(zhuǎn)錄因子和mRNA剪接因子(轉(zhuǎn)錄/RNA加工修飾/細(xì)胞分裂和染色體分割)，符合對該蛋白質(zhì)的預(yù)期。DeepTMHMM預(yù)測SlMYB118蛋白質(zhì)處于膜內(nèi)，因此SlMYB118蛋白質(zhì)不存在跨膜結(jié)構(gòu)域；Hum-mPLoc 2.0預(yù)測該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核。經(jīng)過SignalP5.0在線預(yù)測信號肽的可能性為0.001 2，顯然小于閾值0.500 0，因此SlMYB118蛋白質(zhì)不存在信號肽序列。SlMYB118蛋白質(zhì)磷酸化位點由NetPhos3.1在線軟件進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖7所示，當(dāng)潛在磷酸化位點的閾值為0.5時，可能存在106個磷酸化位點在SlMYB118蛋白質(zhì)中，其中包括3個酪氨酸(Tyr)位點、22個蘇氨酸(Thr)位點及81個絲氨酸(Ser)位點。

2.4.4 二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖8中，SlMYB118蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)由在線軟件SOPMA進(jìn)行預(yù)測。SlMYB118蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲。這些結(jié)構(gòu)中所占比例最高的為無規(guī)則卷曲(56.92%)，其次為α-螺旋(25.96%)，所占比例最低的為β-轉(zhuǎn)角(5.67%)。由此可知，SlMYB118蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要是由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成，隸屬混合型蛋白質(zhì)。圖9為SlMYB118蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果，其是通過SWISS-MODEL對SlMYB118蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的同源建模。

2.4.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹

將SlMYB118蛋白質(zhì)序列提交至NCBI-Blastp進(jìn)行比對，結(jié)果顯示裂殖壺藻SlMYB118蛋白質(zhì)序列與HondaeafermentalgianaMYB98蛋白質(zhì)序列相似度最高，為80.57%；與H.fermentalgianaMYB44蛋白質(zhì)序列的相似度次之(48.60%)。在MEGA11軟件中，采取鄰接法(Neighbor-joining algorithm)、bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000次(圖10)，將其中15種與裂殖壺藻相似度較高的MYB蛋白質(zhì)序列與目的蛋白質(zhì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果顯示裂殖壺藻SlMYB118蛋白質(zhì)與H.fermentalgianaMYB98蛋白質(zhì)聚為一支，親緣關(guān)系最近。

3 討論

MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族是指含有MYB結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子，是植物中較大轉(zhuǎn)錄因子的家族之一。MYB轉(zhuǎn)錄因子的共同特征是具有保守的MYB結(jié)構(gòu)域由N端1-4個R基序組成，根據(jù)R基序重復(fù)的數(shù)目可以分為1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB等 4種類型[17]。裂殖壺藻SlMYB118蛋白質(zhì)通過保守結(jié)構(gòu)域分析，表明該蛋白質(zhì)具有2個Myb_DNA-binding結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB。在植物中，R2R3-MYB普遍數(shù)目較多，且發(fā)揮多種重要功能，包括形態(tài)建成、次級代謝調(diào)節(jié)和抗逆性等生理生化活動[18-24]。如擬南芥AtMYB37、AtMYB38和 AtMYB84能夠調(diào)控其側(cè)分生組織的形成[18]；月季RhMYB113c基因通過MYB-bHLH或MYB-bHLH-WD40復(fù)合物調(diào)節(jié)花青素苷的合成，從而影響月季紅色花瓣的著色[19]；三七PnMYB1基因能夠調(diào)控三七皂苷生物合成途徑中基因的表達(dá)，促進(jìn)三七皂苷的合成[20]；Ye Z M等[21]的研究表明，CitMYB21基因負(fù)調(diào)控柑橘類類黃酮生物合成；在擬南芥中，過表達(dá)荷花的NnMYB4基因，使其AtC3H、At4CL1、AtF5H、AtCOMT1等木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶的表達(dá)量下調(diào)，從而負(fù)調(diào)控植物木質(zhì)素的合成[22]；在干旱脅迫條件下，白羊草中的BiMYB142、BiMYB143和BiMYB35基因通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)，增強(qiáng)了白羊草抗旱的能力[23]；在低溫脅迫下，番茄SlMYB102基因?qū)?種外源激素的積累具有積極作用，推測其可能參與了這6種激素對抗寒性的調(diào)控通路[24]。本課題組前期利用氮源脅迫下不同培養(yǎng)時期的細(xì)胞RNA-Seq數(shù)據(jù)，通過WGCNA分析，證實SlMYB118基因與脂肪酸的合成相關(guān)，由此推測SlMYB118基因是裂殖壺藻DHA合成調(diào)控的潛在轉(zhuǎn)錄因子。本研究通過蛋白序列比對，表明SlMYB118蛋白序列與H.fermentalgianaMYB98蛋白質(zhì)序列最為相似；系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示H.fermentalgiana的MYB98、MYB44及MYB118蛋白質(zhì)序列與裂殖壺藻的SlMYB118蛋白質(zhì)序列聚為一支，可見2個物種之間的親緣關(guān)系較近。裂殖壺藻與H.fermentalgiana均為破囊壺菌科，這與NCBI分類數(shù)據(jù)庫一致。

轉(zhuǎn)錄因子在動、植物的生長發(fā)育及其對外界環(huán)境的反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用，一直以來都是研究內(nèi)容之一，現(xiàn)也是生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點。多種微藻中調(diào)控DHA的機(jī)理已被研究[25-26]，而裂殖壺藻調(diào)控DHA的機(jī)理目前僅局限于在不同供氧條件下的轉(zhuǎn)錄組和基因表達(dá)的分析[27]。大量研究推測，裂殖壺藻多不飽和脂肪酸的合成可能存在2種途徑：一是以乙酰輔酶A為起點，經(jīng)過一系列的碳鏈延長和脫飽和反應(yīng)得到多不飽和脂肪酸(FAS途徑)；二是以乙酰輔酶A為起點，不經(jīng)過一系列的碳鏈延長酶和脫飽和酶反應(yīng)，而是形成多酮基與多羥基的化合物(PKS途徑)[28]。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，已開展利用基因組、轉(zhuǎn)錄組來揭示參與DHA合成途徑的關(guān)鍵功能基因(如延長酶、去飽和酶、聚酮合成酶等)，目前利用過量表達(dá)脂肪酸合成途徑中的單個關(guān)鍵酶/酶的亞基基因，或是通過同時過量表達(dá)代謝途徑中的多個酶基因的方法來提高DHA含量，但這些方法在一定程度上都無法突破脂肪酸合成通量的限制[29-30]。DHA合成受多個層面的調(diào)控，不僅涉及到脂肪酸合成途徑相關(guān)功能基因的表達(dá)，也與轉(zhuǎn)錄因子的導(dǎo)向作用密切相關(guān)，但參與DHA合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子還不清楚，且該信號通路激活的下游基因仍未知，及其參與調(diào)控裂殖壺藻DHA合成在國內(nèi)、外也少有研究。因此，挖掘調(diào)控DHA合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并鑒定其下游靶基因，解析其參與DHA合成調(diào)控的分子機(jī)制是高產(chǎn)DHA裂殖壺藻藻種構(gòu)建和選育亟需解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。本研究為后續(xù)對裂殖壺藻SlMYB118基因的結(jié)構(gòu)、功能及其對脂肪酸合成調(diào)控的研究提供了依據(jù)。