靈芝總?cè)频蜏靥崛」に噧?yōu)化及其降血糖活性研究

何榮軍,孫江亭,賀 丹,孫培龍

(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)

靈芝(Ganodermalucidum),又稱(chēng)瑞草、林中靈、瓊珍,是多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體[1]?！侗静菥V目》等書(shū)籍對(duì)靈芝有“補(bǔ)氣、止咳”等功能的記載[2]。多糖類(lèi)和三萜類(lèi)化合物是靈芝中重要的活性成分,《中國(guó)藥典》中以靈芝多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)靈芝質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn),而在日本則以三萜酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià)靈芝質(zhì)量[3]。靈芝三萜類(lèi)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和種類(lèi)的多樣性決定了其藥理活性和生物活性的多樣性,具有抗腫瘤活性[1]、抗炎活性[4-5]、抗氧化活性[6-7]、降血糖活性[8]和保肝活性[9-10]等特點(diǎn)。靈芝三萜的傳統(tǒng)提取方法是乙醇熱回流法[11],近年來(lái)興起的超聲輔助提取[12-13]和超臨界CO2萃取[14-15]等工藝很大程度上解決了傳統(tǒng)提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等問(wèn)題,但仍在較高溫度下進(jìn)行提取,不利于三萜的活性保持。相較于其他提取方法,低溫高速剪切提取能夠在較低溫度下實(shí)現(xiàn)對(duì)活性成分的提取,既有利于活性的保持,又降低了能源的消耗,在節(jié)能減排方面具有重大意義。筆者基于單因素實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化靈芝三萜的低溫高速剪切提取工藝,并比較了體外降血糖活性的差異,為低溫高速剪切技術(shù)在活性成分提取領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原 料

赤芝子實(shí)體顆粒,浙江科達(dá)生物科技有限公司贈(zèng)送。

1.2 試劑與儀器

香草醛(AR,99.0%)、α-葡萄糖苷酶(BR,50 U/mg)、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(BR,99%),麥克林生物科技有限公司;無(wú)水乙醇(AR),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(AR,>98.0%)、阿卡波糖(BR,95%),上海源葉生物科技有限公司;高氯酸(AR)、石油醚(AR,60～90 ℃)、三氯甲烷(AR),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;碳酸氫鈉(AR,≥99.8%)、冰乙酸(AR,99.5%)、磷酸二氫鈉(AR,99.0%),羅恩化學(xué)有限公司;磷酸氫二鈉(AR,98.0%),上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司;鹽酸(AR),上海泰坦科技股份有限公司。

T18Digtal高速剪切機(jī),德國(guó)儀器有限公司;752N紫外分光光度計(jì),INESA有限公司;CR21N臺(tái)式離心機(jī),日本日立株式會(huì)社;R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;ALpHA2-4LD冷凍干燥機(jī),德國(guó)Christ公司;DG5033A酶聯(lián)免疫測(cè)定儀,華東電子醫(yī)療裝備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 低溫高速剪切提取靈芝總?cè)乒に嚵鞒?/p>

稱(chēng)取5.0 g經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎的靈芝粉末,過(guò)80目篩,按一定的料液比加入乙醇攪拌均勻,用高速剪切機(jī)以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速剪切,結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移至離心瓶以4 510×g的轉(zhuǎn)速離心15 min,將上清液進(jìn)行抽濾,殘?jiān)瓷鲜霾襟E繼續(xù)剪切提取,重復(fù)提取3次,合并提取液,于37 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥即得靈芝總?cè)拼痔嵛?。提取靈芝總?cè)频墓に嚵鞒倘鐖D1所示。

圖1 低溫高速剪切提取靈芝總?cè)乒に嚵鞒?/p>

1.3.2 靈芝總?cè)频寐实臏y(cè)定

參考江紹琳等[16]的方法并稍作修改,采用熊果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,用無(wú)水乙醇準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,精確量取此標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40 mL分別置于10 mL試管中,用無(wú)水乙醇分別補(bǔ)充至1.00 mL,隨后于100 ℃水浴上加熱蒸干。每管中分別加入0.40 mL 5%的香草醛-冰乙酸溶液和1.00 mL高氯酸溶液后,于60 ℃水浴中加熱15 min,冷卻后再加入5.00 mL冰乙酸,搖勻后室溫靜置15 min,用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以測(cè)定靈芝總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)。按照?qǐng)D1得到的靈芝總?cè)铺崛∫河靡掖枷♂尩揭欢ㄙ|(zhì)量濃度后,按上述方法測(cè)定總?cè)频寐?。?jì)算式為

(1)

式中:D為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得總?cè)频馁|(zhì)量濃度,μg/mL;N為稀釋倍數(shù);V為提取液體積,mL;M為靈芝質(zhì)量,g。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提取時(shí)間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)是最重要的影響因素,因此重點(diǎn)對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。精確稱(chēng)取過(guò)80目篩的靈芝子實(shí)體粉末5.0 g,按照料液比1∶25 g/mL與體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇均勻混合,利用高速剪切技術(shù)提取2,4,6,8,10 min,主要考察提取時(shí)間對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊?。靈芝子實(shí)體粉末與體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇按一定料液比均勻混合后提取6 min,主要考察料液比1∶20,1∶25,1∶30,1∶35,1∶40 g/mL對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊?。靈芝子實(shí)體粉末按照料液比1∶35 g/mL與體積分?jǐn)?shù)為70%,75%,80%,85%,90%的乙醇分別混合后提取6 min,主要考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊憽?/p>

1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

利用Box-Behnken原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼如表1所示。采用Design-Expert V 10.0軟件分析所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),優(yōu)化低溫高速剪切提取靈芝總?cè)频墓に噮?shù)。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.5 靈芝三萜降血糖活性分析

參考郝瑞霞[17]的方法采用堿溶酸沉法將GLEC分成酸性三萜(CA)和中性三萜(CN),按照南婷婷[11]優(yōu)化后的乙醇熱回流法提取靈芝總?cè)?GLEH),同樣將GLEH分成酸性三萜(HA)和中性三萜(HN),評(píng)價(jià)并比較以上樣品的α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。參考Pinto等[18]的方法并稍作修改。用純水配制0.1 moL/L pH 6.9的PBS溶液、5 mmoL/L對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)溶液和0.67 moL/L碳酸鈉終止溶液,再用PBS溶液配制0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。用PBS溶液配制相應(yīng)的樣品溶液,以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。具體的測(cè)定體系組分和順序如表2所示。

按照表2的順序于96孔板中添加試劑并操作。加入終止液后于405 nm處測(cè)定吸光度A。計(jì)算式為

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=

(2)

式中:下標(biāo)為組名,樣品組包括陽(yáng)性對(duì)照組。進(jìn)而計(jì)算每個(gè)樣品的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以樣品質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo),以測(cè)定的吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)曲線,具體如圖2所示。所得標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程為Y=0.009 8X-0.067 9(R2=0.997 9)。

圖2 總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊?/p>

在料液比為1∶25 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的實(shí)驗(yàn)條件下,考察提取時(shí)間2,4,6,8,10 min對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊懸?guī)律,結(jié)果如圖3所示。隨著提取時(shí)間增加,靈芝總?cè)频寐食氏壬仙笙陆档内厔?shì),提取時(shí)間為2～6 min,靈芝總?cè)迫艹隽恐饾u增加,在提取時(shí)間為6 min時(shí)得率達(dá)到最大值,此后再增加提取時(shí)間,靈芝總?cè)频牡寐事杂邢陆岛筅呌诜€(wěn)定,得率略有下降,其原因可能是隨著提取時(shí)間的增加,溶液逐漸達(dá)到飽和狀態(tài),進(jìn)而有一定程度析出,因此提取時(shí)間選擇為6 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊?/p>

2.2.2 料液比對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊?/p>

當(dāng)提取時(shí)間為6 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%時(shí),考察不同料液比1∶20,1∶25,1∶30,1∶35,1∶40 g/mL對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊懸?guī)律,結(jié)果如圖4所示。隨著料液比從1∶20 g/mL到1∶35 g/mL,靈芝總?cè)频牡寐食霈F(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì),而且在料液比為1∶35 g/mL時(shí)得率呈現(xiàn)最大值,主要是由于提取溶劑用量的增加提高了原料與溶劑間的濃度差,有利于靈芝三萜向溶劑中擴(kuò)散[19]。當(dāng)料液比超過(guò)1∶35 g/mL時(shí),大部分靈芝三萜已經(jīng)滲出,靈芝總?cè)频牡寐时悴辉僭黾?因此料液比選擇為1∶35 g/mL。

圖4 料液比對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊?/p>

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊?/p>

在提取時(shí)間為6 min,料液比為1∶35 g/mL的實(shí)驗(yàn)條件下,考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,75%,80%,85%,90%對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊懸?guī)律,結(jié)果如圖5所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高,靈芝總?cè)频牡寐氏壬仙筅呌诜€(wěn)定,乙醇體積分?jǐn)?shù)從70%增加到85%,提取溶劑體積分?jǐn)?shù)的提高使原料與溶劑充分接觸,有利于靈芝三萜在溶劑中的溶解,因此靈芝總?cè)频寐手饾u升高,而且在乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí)得率呈現(xiàn)最大值,但乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)85%后,溶劑的極性降低,一些醇溶性成分和極性較小的成分溶出,阻礙目標(biāo)成分的溶出[19],靈芝總?cè)频寐授呌诜€(wěn)定,因此乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇為85%。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

以靈芝總?cè)频寐蔣為響應(yīng)值,共計(jì)進(jìn)行17組實(shí)驗(yàn)研究,其中5組中心重復(fù)性實(shí)驗(yàn),響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。響應(yīng)面設(shè)計(jì)回歸方程各項(xiàng)殘差分析結(jié)果如表4所示。由表4可知:回歸模型顯著性達(dá)到顯著性水平,失擬不顯著(P=0.252 9>0.05),說(shuō)明該模型擬合度良好。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.965 4,說(shuō)明所選因素能夠反映響應(yīng)值96.54%的變化?；貧w模型一次項(xiàng)A,B,C以及二次項(xiàng)A2,C2均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,二次項(xiàng)B2有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所得方程:Y=0.56+0.027A+0.033B+0.031C-4.000E-0.003AB+0.014AC-0.018BC-0.039A2-0.074B2-0.043C2

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)Design-expert V 10.0回歸分析結(jié)果,分別得到低溫剪切提取靈芝總?cè)聘饕蛩亻g交互作用的響應(yīng)面曲線圖,如圖6所示。3D曲面圖上的傾斜率越大,表示兩個(gè)因素相互作用越顯著,平面圖上顏色跨度越大,說(shuō)明響應(yīng)值變化越快。隨著提取時(shí)間A、料液比B及乙醇體積分?jǐn)?shù)C的增加,響應(yīng)曲面圖上的傾斜率均較大,表明總?cè)频寐视忻黠@變化,說(shuō)明這3個(gè)因素的交互作用對(duì)總?cè)频寐实挠绊戄^大。響應(yīng)面上等高線的中心在-1～1時(shí),表示提取靈芝總?cè)频淖罴压に嚄l件在設(shè)計(jì)因子水平范圍內(nèi)。運(yùn)用Design-expert V 10.0對(duì)回歸模型進(jìn)行進(jìn)一步解優(yōu)化分析,得到靈芝總?cè)谱罡叩寐实淖罴压に噮?shù):提取時(shí)間4.824 min,料液比1∶28.726 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)80.420%,靈芝總?cè)频寐蔬_(dá)到0.569%。

圖6 響應(yīng)面試驗(yàn)的相互作用圖

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

工藝參數(shù)修正為提取時(shí)間6 min,料液比1∶30 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,做3組平行實(shí)驗(yàn),所得總?cè)频寐实钠骄禐?0.54±0.05)%,與回歸方程所得的總?cè)频寐?.569%相符,這說(shuō)明回歸方程能夠真實(shí)地反映各因素的交互作用對(duì)靈芝總?cè)频寐实挠绊?因此用響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝總?cè)频寐实幕貧w模型可靠。

2.4 降血糖活性比較

靈芝酸性三萜,中性三萜以及總?cè)频摩?葡萄糖苷酶抑制活性如圖7所示。

圖7中:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。由圖7可知:隨著劑量質(zhì)量濃度的增加,樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力逐漸增加,因此,低溫高速剪切提取法和傳統(tǒng)乙醇熱回流法提取的靈芝總?cè)?、中性三萜以及酸性三萜均顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性。在相同樣品濃度下,只有CA對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力顯著高于HA(P<0.05),這說(shuō)明低溫高速剪切技術(shù)能夠保護(hù)酸性三萜中具有降血糖活性的組分不受破壞,顯著提高酸性三萜的降血糖活性。

靈芝酸性三萜,中性三萜以及總?cè)频陌胍种茲舛?IC50)如表5所示。由表5可知:降血糖能力由大到小排序?yàn)橹行匀?總?cè)?酸性三萜>阿卡波糖(Acarbose),表明天然產(chǎn)物靈芝三萜的降血糖活性顯著高于現(xiàn)行降血糖藥物阿卡波糖(P<0.000 1)。

表5 靈芝酸性三萜,中性三萜以及總?cè)频陌胍种茲舛?IC50)

3 結(jié) 論

以靈芝子實(shí)體為原料,以總?cè)频寐蕿樵u(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化低溫高速剪切法提取靈芝總?cè)频淖罴压に噮?shù):提取時(shí)間6 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,在此條件下總?cè)频寐蕿?0.54±0.05)%,與乙醇熱回流法提取靈芝總?cè)频寐?.63%接近[11]。將GLEC,CA,CN與GLEH,HA,HN進(jìn)行α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:相較于乙醇熱回流法,低溫高速剪切法能顯著提高酸性三萜的α-葡萄糖苷酶活性抑制率。因此,低溫高速剪切技術(shù)能快速提取靈芝總?cè)?顯著提高酸性三萜的降血糖活性,靈芝總?cè)频寐式咏鼈鹘y(tǒng)提取法,為低溫高速剪切技術(shù)在食品加工提取領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。