萬(wàn)壽菊水提物對(duì)砷致胰島β細(xì)胞毒性作用的影響研究*

劉幗芬，張曉莉，牟亞豪，代 嬌，谷仕艷

1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000；2.曲靖醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，云南 曲靖 655000

萬(wàn)壽菊為一年生草本植物，花色呈橘黃色，具有較高的觀賞價(jià)值，同時(shí)萬(wàn)壽菊花瓣含有豐富的葉黃素，并含有黃酮和多酚等多種活性物質(zhì)，而兼具良好的藥用價(jià)值。經(jīng)研究證實(shí)，萬(wàn)壽菊花提取物可用于對(duì)抗白內(nèi)障、防止老年視黃斑退化、降低患癌率和防治冠心病等，在保健食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用較為普遍［1-3］。此外，也有研究證實(shí)萬(wàn)壽菊花水提物可在一定程度上恢復(fù)腎組織抗氧化酶活性，降低抗腫瘤藥物對(duì)腎臟的氧化損傷［4］，且有研究顯示，萬(wàn)壽菊花提取物具有一定的抗氧化活性［5-6］。然而，萬(wàn)壽菊花水提物的具體抗氧化功能及機(jī)制還缺乏深入的探討，這在一定程度上限制了它的使用和推廣。

砷（As）是自然界中廣泛存在的有毒類(lèi)金元素，主要通過(guò)消化道、呼吸道和皮膚接觸進(jìn)入機(jī)體，引起皮膚癌、肺癌、糖尿病以及神經(jīng)退行性等多種疾病的發(fā)生發(fā)展［7］。氧化應(yīng)激是多種疾病的分子病理機(jī)制，同時(shí)也被認(rèn)為是砷發(fā)揮毒性作用最主要的機(jī)制之一。當(dāng)無(wú)機(jī)砷進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可引起抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽的快速耗竭并使谷胱甘肽合成酶失活，這使得細(xì)胞內(nèi)大量活性氧（ROS）得不到有效清除而蓄積，蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子被氧化修飾而失去基本功能，引起細(xì)胞功能的紊亂，最終表現(xiàn)為細(xì)胞的死亡［8］。目前未見(jiàn)萬(wàn)壽菊花水提物能否拮抗或恢復(fù)砷引起的氧化損傷的報(bào)道。本研究以胰島β 細(xì)胞NIT-1 細(xì)胞為模型，首先評(píng)估萬(wàn)壽菊花水提物本身的細(xì)胞毒性作用，接著探討萬(wàn)壽菊花水提物對(duì)砷所致細(xì)胞毒性的影響，明確萬(wàn)壽菊花水提物能否拮抗砷誘導(dǎo)的毒性損傷，為將萬(wàn)壽菊更好地用于疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；真空冷凍干燥機(jī)（Scientz-ND，寧波新芝生物）；多功能熒光酶標(biāo)儀（SP-Max3500F，上海閃譜生物司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器）；As2O3（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（上海索萊寶）；CCK8 檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物）；ROS 活性氧檢測(cè)試劑盒（北京雷根）；細(xì)胞凋亡-Hoechst 染色試劑盒（上海碧云天）；實(shí)驗(yàn)所需其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 萬(wàn)壽菊花水提物提取 萬(wàn)壽菊干花放入中藥粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，粉碎時(shí)間為1 min，將得到的萬(wàn)壽菊花粉末過(guò)0.25 mm（60目）標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)孔篩獲得萬(wàn)壽菊60目粉。稱(chēng)取萬(wàn)壽菊60 目粉10 g，加入20 倍量（200 mL）蒸餾水，水浴100 ℃2 h 提取3 次，合并三次濾液，將濾液在45 ℃減壓條件下旋蒸，至旋蒸瓶中約有1 mL 左右的旋蒸液為止（旋蒸瓶壁上如有粉末貼壁，用55KHz超聲震蕩處理），用吸管將液體移至培養(yǎng)皿中，用保鮮膜包裹，并用針頭扎孔放入冰箱-20 ℃冷凍7 h 以上，后迅速放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥12 h，得到萬(wàn)壽菊水溶性成分的凍干粉末，4 ℃保存?zhèn)溆茫谂R用時(shí)以1640培養(yǎng)基配成50 mg/mL的儲(chǔ)備液。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠胰島素瘤β 細(xì)胞（NIT-1，廣州吉妮歐生物）在飽和濕度、5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋培養(yǎng)瓶壁達(dá)到80%～90% 時(shí)，進(jìn)行傳代處理。

1.2.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞存活率 按1×104 個(gè)/100μL 將細(xì)胞接種于96 孔板，貼壁后分別用As2O3（0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/L）和萬(wàn)壽菊水提物（0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28mg/mL）單獨(dú)處理細(xì)胞，根據(jù)處理后的細(xì)胞存活率，設(shè)置As2O3 和萬(wàn)壽菊水提物的共處理組（As2O3和萬(wàn)壽菊水體物混合處理）和后處理組（As2O3處理結(jié)束后再給予萬(wàn)壽菊水提物處理），處理結(jié)束后棄液，每孔加90 μL 培養(yǎng)液和10 μL CCK-8 試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，以熒光酶標(biāo)儀在450 nm 的波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值（A450），根據(jù)公式：細(xì)胞存活率（%）=處理組A450/對(duì)照組A450×100%計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4 細(xì)胞凋亡測(cè)定 按5×105個(gè)/孔接種細(xì)胞，貼壁后分別給予3.2 mg/L As2O3、0.08 mg/mL 萬(wàn)壽菊水提物以及3.2 mg/L As2O3和0.08 mg/mL 的萬(wàn)壽菊花后處理24 h，棄液后每孔加入500 μL Hoechst 固定液，10 min 后去除，加入1 mL PBS 清洗2 次，最后避光加入500 μL 染色液孵育5 min。熒光顯微鏡下觀察和拍照，正常細(xì)胞的細(xì)胞核為均一藍(lán)色，凋亡細(xì)胞則細(xì)胞核皺縮且顏色變白發(fā)亮。按公式計(jì)算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/200×100%。

1.2.5 細(xì)胞ROS 活性測(cè)定 細(xì)胞經(jīng)As2O3和萬(wàn)壽菊水提物處理后，每孔加入含有DCFH-DA 探針濃度為10 μM 的培養(yǎng)基1 mL，37℃孵育20 min后，在熒光顯微鏡下觀察和拍照，圖片用Image J 軟件進(jìn)行定量分析。ROS 平均熒光強(qiáng)度=光密度總和/待測(cè)細(xì)胞面積，以對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用最小顯著法（LSD-t），方差不齊的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)（H）檢驗(yàn)。兩兩比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本間的秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 萬(wàn)壽菊水提物活性成分提取率及對(duì)細(xì)胞存活率的影響

萬(wàn)壽菊水提物凍干產(chǎn)物呈棕黃色并具有一定的黏性，三次提取物質(zhì)量分別為3.69 g、3.74 g 和3.75 g，平均浸提率為37.27%。NIT-1 細(xì)胞經(jīng)0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 mg/mL 萬(wàn)壽菊水提物作用24 h 后，細(xì)胞存活率依次是100.00%、104.05%、109.43%、92.47%、77.36%、49.44%、22.08%。0.08 mg/L 組的存活率高于“0”組，0.16、0.32、0.64、1.28 mg/mL 組的存活率低于“0”組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），0.4 mg/mL 組與“0”組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.243）；隨著萬(wàn)壽菊水提物濃度升高，NIT-1 細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=190.206，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 萬(wàn)壽菊水提物對(duì)NIT-1細(xì)胞存活率的影響

2.2 As2O3對(duì)細(xì)胞存活率的影響

NIT-1 細(xì)胞經(jīng)0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/L As2O3作用24 h 后，細(xì)胞存活率分別為100.00%、96.11%、93.79%、74.92%、63.02%、52.75%、42.22%，As2O3處理組與“0”組相比，除0.4 mg/L 組外，細(xì)胞存活率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 As2O3對(duì)NIT-1細(xì)胞存活率的影響

2.3 萬(wàn)壽菊與As2O3共處理對(duì)細(xì)胞存活率的影響

0.08 mg/L 萬(wàn)壽菊水提物處理細(xì)胞24 h 后的細(xì)胞存活率為105.93%，1.6 mg/L As2O3和3.2 mg/L As2O3細(xì)胞存活率分別為76.28%和59.40%，而0.08 mg/L 萬(wàn)壽菊和1.6 mg/L As2O3共處理細(xì)胞存活率為39.44%，0.08 mg/L 萬(wàn)壽菊和3.2 mg/L As2O3共處理細(xì)胞存活率為34.64%，共處理組細(xì)胞存活率均低于砷單染和萬(wàn)壽菊單染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 萬(wàn)壽菊與As2O3共處理對(duì)NIT-1細(xì)胞存活率影響情況

2.4 萬(wàn)壽菊后處理對(duì)As2O3降低細(xì)胞存活率的影響

萬(wàn)壽菊水提物細(xì)胞存活率為107.00%，1.6 mg/L As2O3和3.2 mg/L As2O3細(xì)胞存活率分別為76.32%和56.54%，1.6 mg/L As2O3處理結(jié)束再給予0.08 mg/L 萬(wàn)壽菊水提物處理組中，細(xì)胞存活率為62.14%，與1.6 mg/L As2O3處理組相比，細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3.2 mg/L As2O3處理結(jié)束再給予0.08 mg/L 萬(wàn)壽菊水提物處理，細(xì)胞存活率為66.53%，與3.2 mg/L As2O3處理組相比，細(xì)胞存活率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 萬(wàn)壽菊后處理對(duì)As2O3降低NIT-1細(xì)胞存活率影響情況

2.5 萬(wàn)壽菊水提物對(duì)As2O3引起細(xì)胞凋亡的影響

“0”組細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核藍(lán)色均一，凋亡細(xì)胞較少；萬(wàn)壽菊水提物處理組細(xì)胞狀態(tài)與“0”組相近，而As2O3組細(xì)胞貼壁不良，細(xì)胞核呈碎片狀，且呈致密濃染，顏色發(fā)白，呈現(xiàn)典型凋亡狀態(tài)；萬(wàn)壽菊水提物后處理組與As2O3組比較，凋亡細(xì)胞少于As2O3組。經(jīng)觀察和計(jì)數(shù)，0 組、萬(wàn)壽菊組、As2O3組和聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率依次是8.67%、5.5%、21.33%、17.17%，聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡率高于“0”組和萬(wàn)壽菊水提物組，但低于As2O3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 萬(wàn)壽菊后處理對(duì)砷所致NIT-1細(xì)胞凋亡的影響

2.6 萬(wàn)壽菊水提物對(duì)As2O3升高細(xì)胞ROS含量的影響

ROS 檢測(cè)結(jié)果如圖6A 所示，萬(wàn)壽菊組綠色熒光信號(hào)與“0”組相近，As2O3組綠色熒光信號(hào)最強(qiáng)，聯(lián)合處理組綠色熒光信號(hào)弱于As2O3組但強(qiáng)于“0”組與萬(wàn)壽菊水提物處理組。經(jīng)定量，As2O3組（1.12 倍）和聯(lián)合處理組（1.06倍）的ROS 活性高于“0”組（P＜0.05），聯(lián)合處理組ROS活性低于As2O3組（P＜0.05），詳見(jiàn)圖6B。

圖6 萬(wàn)壽菊后處理對(duì)砷增加NIT-1細(xì)胞中ROS含量的影響

3 討論

本研究結(jié)果顯示，萬(wàn)壽菊水提物在較高濃度下會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，提示我們?cè)趯?shí)際應(yīng)用過(guò)程中，要關(guān)注萬(wàn)壽菊花提取物的使用濃度。

無(wú)機(jī)砷作為一種劇毒物質(zhì)，能以劑量依賴(lài)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS 的蓄積，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡或自噬［8-10］，表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性作用，而這種毒性作用可在一定程度上被逆轉(zhuǎn)，如叔丁基對(duì)苯二酚可通過(guò)激活Nrf2通路而增強(qiáng)細(xì)胞抵御氧化損傷的能力，進(jìn)而降低無(wú)機(jī)砷對(duì)細(xì)胞的毒性；姜黃素可有效拮抗無(wú)機(jī)砷對(duì)大鼠睪丸生殖細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；西紅花酸可對(duì)無(wú)機(jī)砷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用；玫瑰香葡萄果皮提取物可提高小鼠睪丸組織的抗氧化能力，緩解砷的雄性生殖毒性；葡萄籽提取物白藜蘆醇在低劑量時(shí)可拮抗無(wú)機(jī)砷的毒性作用，促進(jìn)細(xì)胞存活，而在高劑量時(shí)則能與無(wú)機(jī)砷產(chǎn)生協(xié)同作用，共同殺傷腫瘤細(xì)胞。以上這些研究表明，無(wú)機(jī)砷產(chǎn)生的細(xì)胞毒性可被抗氧化劑或者含抗氧化物質(zhì)的提取物在一定程度上逆轉(zhuǎn)，而這些物質(zhì)與無(wú)機(jī)砷的聯(lián)合作用方式有預(yù)處理（無(wú)機(jī)砷給藥前用這些物質(zhì)處理細(xì)胞），共處理（與無(wú)機(jī)砷同時(shí)給藥）和后處理（無(wú)機(jī)砷處理結(jié)束后給予）3 種。本研究為明確萬(wàn)壽菊提取物對(duì)無(wú)機(jī)砷毒性作用的影響，選擇共處理和后處理兩種方式處理后檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，在砷和萬(wàn)壽菊水提物共處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率低于萬(wàn)壽菊和砷單獨(dú)給藥的存活率，提示萬(wàn)壽菊的水提物成分可在一定程度上增強(qiáng)砷的細(xì)胞毒性，表現(xiàn)出聯(lián)合殺傷作用。在本研究中我們觀察到在砷處理后再給予萬(wàn)壽菊水提物處理時(shí)，萬(wàn)壽菊水提物可有效恢復(fù)As2O3引起的細(xì)胞毒性，表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡以及降低ROS的蓄積，表明萬(wàn)壽菊水提物能在一定程度上恢復(fù)無(wú)機(jī)砷引起的細(xì)胞損傷。在共處理時(shí)，萬(wàn)壽菊水提物和As2O3表現(xiàn)出聯(lián)合殺傷作用，可能是由于萬(wàn)壽菊水提物中的某些成分可增強(qiáng)As2O3的毒性；也有可能是由于水提物成分中含有多糖成分，而萬(wàn)壽菊多糖成分已被證實(shí)在體外有一定的抑瘤活性［8］。當(dāng)然，萬(wàn)壽菊水提物對(duì)As2O3毒性的增強(qiáng)作用還需要進(jìn)一步研究，比如更換處理時(shí)間、處理濃度，甚至選用不同的細(xì)胞株，以更清晰地闡明萬(wàn)壽菊水提物在共處理的方式下對(duì)As2O3毒性的影響。而后處理過(guò)程中，排除了As2O3和萬(wàn)壽菊水提物之間的相互作用，觀察到萬(wàn)壽菊水提物可有效恢復(fù)As2O3引起的細(xì)胞損傷，這可能與萬(wàn)壽菊水提物成分具有抗氧化特性有關(guān)［5-6］。

綜上所述，萬(wàn)壽菊提取物在低濃度下刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，高濃度則使細(xì)胞存活率下降，As2O3能以濃度依賴(lài)的方式降低細(xì)胞存活率，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，萬(wàn)壽菊后處理可有效逆轉(zhuǎn)As2O3所致的細(xì)胞毒性。本研究可為今后萬(wàn)壽菊水溶性成分修復(fù)細(xì)胞損傷的研究提供一定的參考依據(jù)，同時(shí)為合理利用和開(kāi)發(fā)萬(wàn)壽菊屬植物資源，實(shí)現(xiàn)萬(wàn)壽菊的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。