紫梗籽銀桂種胚發(fā)育與胚乳營養(yǎng)物質(zhì)的變化研究

朱永莉, 沈永寶

(1.南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院, 南京 210037; 2.上海商學(xué)院藝術(shù)設(shè)計(jì)學(xué)院, 上海 201400;3.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 南京 210037; 4.國家林業(yè)和草原局南方林木種子檢驗(yàn)中心, 南京 210037;5.南京林業(yè)大學(xué),南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210037)

高等植物種子發(fā)育通常可分為形態(tài)發(fā)育階段(胚、胚乳和種皮發(fā)育)和種子成熟階段(胚根的生長和種子灌漿),其中后者是種子發(fā)育的重要階段,碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等貯藏物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化對種子的質(zhì)量具有重要的意義[1-3]。植物種子發(fā)育過程需要可溶性糖、淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)以保證種子與胚的正常發(fā)育[4-9],因此研究種胚發(fā)育過程中內(nèi)含物質(zhì)的變化規(guī)律有利于了解種子的成熟過程和發(fā)育機(jī)理。桂花(Osmanthusfragrans)為木犀科木犀屬常綠木本植物,是我國傳統(tǒng)十大名花之一,桂花樹姿優(yōu)美,香味濃郁,具有很高的園林觀賞價(jià)值,現(xiàn)廣泛栽培于北亞熱帶和中亞熱帶地區(qū)[10]。近年來,有關(guān)桂花資源分布[11]、品種分類[10,12]、開花及傳粉生物學(xué)[13-14]、胚胎學(xué)[15-16]、保護(hù)遺傳學(xué)[17-18]、繁殖生物學(xué)[19-20]及種子休眠[21-22]等方面的研究較多,而與桂花種子的發(fā)育生物學(xué)相關(guān)的研究略顯薄弱。另外,桂花秋季(9—10月)開花,次年4—5月種子成熟,種子發(fā)育時(shí)間長,且結(jié)實(shí)率低導(dǎo)致取材難度較大,限制了桂花種子的發(fā)育生物學(xué)研究。為深入了解桂花種胚發(fā)育過程及成熟機(jī)制,本研究以發(fā)育不同時(shí)期的紫梗籽銀桂種子為研究對象,觀察種胚形態(tài)發(fā)育過程,分析發(fā)育過程中可溶性糖、淀粉、蛋白質(zhì)和粗脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)含量變化,揭示其種子發(fā)育過程中生理特性和重要指標(biāo)的變化規(guī)律,探討桂花種胚發(fā)育成熟的機(jī)制,為探明桂花種胚發(fā)育生理過程及其分子作用機(jī)理奠定基礎(chǔ),以期為桂花實(shí)生苗木培育、種質(zhì)資源保存提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料為紫梗籽銀桂(O.fragrans‘Zigengziyin’),試驗(yàn)所用的種子采于南京市八卦洲街道院內(nèi),于花后60 d開始,至來年果實(shí)成熟,每隔15～20 d進(jìn)行取樣,共取樣11次。紫梗籽銀桂花期9—10月,果實(shí)成熟次年4—5月,花后180 d,種胚開始大量形成。采集的材料用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室后立即去除果皮取出種子,一部分用于測定種子大小、含水量等變化,觀察種胚形態(tài)建成,另一部分分別剝離胚和胚乳,放入-76 ℃超低溫冰箱保存用于可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、粗脂肪等組分測定。

1.2 研究方法

1.2.1種實(shí)生物學(xué)特性研究

隨機(jī)選取30粒不同發(fā)育階段的果實(shí),用體式顯微鏡觀察各個(gè)時(shí)期的種子及種胚的發(fā)育狀況;用游標(biāo)卡尺測量果實(shí)的縱徑和橫徑,精確到0.001 cm。隨機(jī)取5 g左右果實(shí),用美國LI-COR公司生產(chǎn)的LI-6400光合儀測定果實(shí)的呼吸強(qiáng)度,依據(jù)GB 2772—1999《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》,采用烘箱恒溫干燥法測定果實(shí)含水量。

1.2.2胚乳營養(yǎng)物質(zhì)的測定

可溶性糖含量[23]、淀粉含量[24]測定采用蒽酮比色法,可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[23],粗脂肪含量測定采用索氏提取法[23]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用 Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理和圖表制作,采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種實(shí)生物學(xué)特性

2.1.1果實(shí)形態(tài)變化

紫梗籽銀桂果實(shí)由外至內(nèi)依次為外果皮、中果皮(果肉)和內(nèi)果皮(種殼)及種子。從花后60 d到花后120 d,外果皮和中果皮(果肉)部分均為綠色,種實(shí)含水量較高,胚乳呈膠狀液體,內(nèi)果皮的木質(zhì)化程度逐漸加深(圖1 a～圖1 d)。花后135 d,胚乳逐漸變濃稠,邊緣部分出現(xiàn)白色固體狀物質(zhì)(圖1 e);花后150 d,種胚開始形成(圖1 f);至花后165 d,胚體開始出現(xiàn),胚乳成為白色固體狀態(tài)(圖1 g);花后180 d開始,種胚大量形成(圖1 h～圖1 i);花后195 d,果皮變?yōu)樽仙?果肉變軟,易于剝離,種殼進(jìn)一步木質(zhì)化,變厚變硬,胚乳變?yōu)榘咨腆w狀態(tài),胚逐漸占滿胚腔,種子發(fā)育趨于成熟,此后紫梗籽銀桂的種實(shí)在形態(tài)上未有太大變化(圖1 j);花后210～225 d,果實(shí)進(jìn)一步發(fā)育成熟,果皮變?yōu)樽虾谏?胚完成形態(tài)后熟占滿整個(gè)胚腔,子葉、胚軸、胚根清晰可見,種殼靠近胚根處發(fā)芽孔開裂,種子發(fā)育成熟(圖1 k～圖1 l)。

注:a～l為紫梗籽銀桂果實(shí)不同時(shí)期縱剖面(20×)。

2.1.2果實(shí)大小變化

紫梗籽銀桂果實(shí)的大小在發(fā)育過程中基本呈持續(xù)上升的趨勢,縱徑從花后60 d的0.652 cm到花后225 d(果實(shí)成熟)時(shí)增加到1.581 cm,橫徑從0.249 cm增加到0.707 cm,分別增長了0.929 cm和0.458 cm(圖2)。

圖2 紫梗籽銀桂發(fā)育過程中果實(shí)大小變化

2.1.3胚的變化

紫梗籽銀桂種子發(fā)育過程中種胚的比率和種胚長度變化如圖3、圖4所示,其胚的發(fā)育大約經(jīng)歷三個(gè)階段:花后150～165 d為種胚開始形成期,胚體可見,種胚的平均長度約為0.137 cm;花后165～195 d為種胚快速形成期,該階段胚的長度升至0.628 cm,胚形成率由花后180 d的15%上升至花后195 d的53%;花后195～225 d為種胚成熟期:該階段胚的長度上升至0.928 cm,種胚形成率也上升至93%。

圖3 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過程中種胚形成的比率變化

圖4 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過程中種胚的長度變化

2.1.4果實(shí)呼吸速率變化

如圖5所示,紫梗籽銀桂果實(shí)發(fā)育過程中呼吸速率整體呈下降趨勢?；ê?0 d到花后80 d, 呼吸速率從47.556 μmol/(g·min)下降到33.582 μmol/(g·min),這期間果實(shí)中含水量增長較快,種殼內(nèi)主要呈液體狀膠狀物,呼吸速率下降;花后80～120 d,呼吸速率從33.582 μmol/(g·min)上升到44.319 μmol/(g·min),果實(shí)呼吸速率上升并趨于穩(wěn)定,花后120 d后再下降,直到花后180 d呼吸速率下降至29.403 μmol/(g·min),花后195 d下降到15.584 μmol/(g·min),這可能是由于花后80～120 d果實(shí)的發(fā)育較旺盛,細(xì)胞分裂活躍,需要較多的物質(zhì)和能量,呼吸作用較強(qiáng);從花后120 d之后隨著果實(shí)的發(fā)育,各項(xiàng)組織逐漸成熟,呼吸速率逐漸降低,花后180 d種胚大量形成,種殼(內(nèi)果皮)趨于木質(zhì)化,種子發(fā)育趨于成熟,呼吸速率急劇下降;花后195～225 d,隨著果實(shí)和種子的發(fā)育,胚進(jìn)一步長大完成形態(tài)后熟占滿胚腔,外果皮和中果皮隨著種子和果實(shí)的發(fā)育成熟逐漸軟化解體,呼吸作用有所增強(qiáng),呼吸速率上升,從15.584 μmol/(g·min)上升到19.833 μmol/(g·min),基本趨于穩(wěn)定。這與之前的細(xì)胞學(xué)解剖結(jié)構(gòu)觀察基本一致。

圖5 紫梗籽銀桂果實(shí)發(fā)育過程中呼吸速率和含水量變化

2.1.5果實(shí)含水量變化

紫梗籽銀桂果實(shí)發(fā)育過程中含水量呈先升后降趨勢?；ê?0～165 d,隨著果實(shí)由小到大發(fā)育,果實(shí)的含水量呈上升趨勢,由71.10%上升到82.49%,此階段果實(shí)中各種組織尚未發(fā)育成熟,果實(shí)中含水量較高。隨著果實(shí)的發(fā)育,胚乳內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不斷積累,胚不斷成熟,果實(shí)含水量逐漸下降,至花后225 d果實(shí)發(fā)育成熟,含水量為72.75%,后趨于穩(wěn)定(圖5)。

2.2 胚乳營養(yǎng)物質(zhì)的變化

2.2.1可溶性糖含量變化

隨著紫梗籽銀桂種子的發(fā)育,胚乳內(nèi)可溶性糖含量總體呈上升的趨勢?；ê?0 d胚乳中可溶性糖含量0.52%,花后150 d上升到0.79%,之后出現(xiàn)略微下降,花后165 d,可溶性糖含量下降至0.63%,這可能是由于這一階段胚開始形成,胚的發(fā)育消耗一定的糖,導(dǎo)致可溶性糖含量下降;花后180～195 d,隨著種子的進(jìn)一步發(fā)育,胚乳由膠狀液態(tài)變?yōu)榘咨虘B(tài),胚乳中營養(yǎng)物質(zhì)積累加速,可溶性糖含量上升幅度較大,由0.64%上升至1.04%,之后可溶性糖含量繼續(xù)上升,至花后225 d上升至1.26%,種子發(fā)育成熟,為種子萌發(fā)儲備物質(zhì)和能量(圖6)。

圖6 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過程中可溶性糖含量變化

2.2.2淀粉含量變化

紫梗籽銀桂種子在發(fā)育過程中淀粉含量呈先降后升的趨勢?；ê?0～100 d,淀粉含量由21.6%上升至24.39%,之后逐漸下降,至花后150 d,下降至16.03%,這可能是在種子發(fā)育的前期,胚乳內(nèi)淀粉逐漸被水解為可溶性糖供種子利用,這與該段時(shí)期內(nèi)可溶性糖含量的變化相吻合;花后150 d開始,隨著種胚的出現(xiàn),淀粉含量逐漸上升,花后180～195 d上升幅度較大,由19.99%上升至40.3%,此時(shí)胚發(fā)育進(jìn)一步成熟,逐漸占滿胚腔,胚乳由膠狀液態(tài)變?yōu)榘咨虘B(tài),胚乳中營養(yǎng)物質(zhì)積累加速,淀粉含量升高,之后隨著種子的發(fā)育成熟,淀粉含量上升至46.78%(花后210 d),之后略為下降,后趨于穩(wěn)定(圖7)。

圖7 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過程中淀粉含量變化

圖8 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過程中可溶性蛋白含量變化

2.2.3可溶性蛋白含量變化

紫梗籽銀桂種子發(fā)育過程中可溶性蛋白含量前期變化比較平穩(wěn),后期呈上升趨勢?；ê?0～165 d,可溶性蛋白含量較平穩(wěn),花后165 d開始逐漸上升,花后180～195 d可溶性蛋白含量的上升幅度較大,從8.15 mg/g升至24.51 mg/g,該段時(shí)期胚逐漸占滿胚腔,胚乳由膠狀液態(tài)變?yōu)榘咨虘B(tài),胚乳中營養(yǎng)物質(zhì)積累加速,至花后210 d可溶性蛋白含量有所下降,可能是種胚發(fā)育進(jìn)入后期,需要較多的蛋白質(zhì)支持,到花后225 d種子成熟,可溶性蛋白含量有所恢復(fù)保持穩(wěn)定,為種子萌發(fā)做好準(zhǔn)備(圖8)。

2.2.4粗脂肪含量變化

紫梗籽銀桂種子發(fā)育過程中粗脂肪含量不斷增加?；ê?0～165 d,增加比較緩慢,由8.83%增加至10.68%,花后180 d之后,上升幅度較快,粗脂肪含量由11.17%上升到18.67%,作為胚乳中的營養(yǎng)物質(zhì)大量儲存,為種子萌發(fā)做好準(zhǔn)備(圖9)。

圖9 紫梗籽銀桂種子發(fā)育過程中粗脂肪含量變化

3 討 論

種子的成熟過程實(shí)質(zhì)上就是胚從小長大,以及營養(yǎng)物質(zhì)在種子中變化和積累的過程[25],包括化合物的積累、酶類及激素的調(diào)節(jié)與代謝等[26]。紫梗籽銀桂種胚的發(fā)育大約經(jīng)歷三個(gè)階段:種胚開始形成期、種胚快速形成期和種胚成熟期。種子各類營養(yǎng)物質(zhì)快速積累發(fā)生在花后180 d之后,此期間種胚開始大量形成,到種子成熟階段達(dá)到峰值。紫梗籽銀桂果實(shí)在發(fā)育初期含水量較高,隨著果實(shí)的發(fā)育成熟,胚乳內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不斷積累,果實(shí)含水量逐漸下降并趨于穩(wěn)定,在此期間原生質(zhì)也由溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài),種子的生命活動(dòng)亦由代謝活躍轉(zhuǎn)入休眠狀態(tài)[27]。紫梗籽銀桂果實(shí)在花后前165 d,果實(shí)的含水量呈現(xiàn)上升趨勢。在花后165 d之后,胚開始出現(xiàn),胚乳內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不斷積累,果實(shí)含水量逐漸下降,至果實(shí)成熟基本趨于穩(wěn)定。這與紫花地丁Viola philippica[28]、牡丹Paeonia × suffruticosa[29]、黃蓮木Pistacia chinensis[30]、無患子Sapindus Saponaria[31]等物種相一致。

可溶性糖、油脂和蛋白等可為種胚的生長發(fā)育提供必須的營養(yǎng)和能量,并在后期作為營養(yǎng)物質(zhì)積累起來,為種子萌發(fā)提供能量[32]。紫梗籽銀桂在花后前135 d為種子胚乳固態(tài)化的重要時(shí)期,胚乳逐漸變得濃稠,表明種子內(nèi)的可溶性糖和淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)主要用于自身形態(tài)建成,可溶性糖、淀粉和脂肪積累較慢;在花后165～195 d,種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐步構(gòu)建完成,胚乳轉(zhuǎn)化為白色固體狀態(tài),胚體逐步占滿胚腔,種子發(fā)育趨于成熟,在此期間,可溶性糖、油脂和蛋白上升趨勢明顯,可溶性糖、淀粉和脂肪的迅速積累可為胚胎的正常發(fā)育提供必要的能量支持。

可溶性糖作為生命活動(dòng)能量的源泉,不僅是植物胚生長發(fā)育營養(yǎng)物質(zhì)和能量的重要來源[5],而且參與種子發(fā)育后期營養(yǎng)物質(zhì)儲存積累[32-33]。紫梗籽銀桂種子在發(fā)育過程中,胚乳可溶性糖含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢(在胚建成初期略有回落),至果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大(1.26%),高含量的可溶性糖為種子萌發(fā)提供物質(zhì)和能量儲備。紫梗籽銀桂種胚形成過程中,在花后165 d胚形成后,可溶性糖含量迅速積累,這可能是該時(shí)期細(xì)胞處于旺盛的分裂和分化階段,可溶性糖的快速積累可滿足發(fā)育早期較高的能量支持。

紫梗籽銀桂胚乳中淀粉含量在種子發(fā)育前期呈逐漸遞增的變化趨勢,在胚建成期(花后135～165 d)略有下降,此后又逐漸上升并趨于穩(wěn)定,這可能是由于在種子發(fā)育的前期,胚乳內(nèi)淀粉逐漸被水解為可溶性糖供種子利用,這與該段時(shí)期內(nèi)可溶性糖含量的變化相吻合。總體上看,紫梗籽銀桂種子的發(fā)育表現(xiàn)為淀粉沉積的過程,這與米槁Cinnamomum migao[34]、“鳳丹”Paeonia ostii ‘Feng Dan’[9]等種子的發(fā)育結(jié)果基本相似。

蛋白質(zhì)作為種子發(fā)育過程中氮源的重要來源之一,可為種子及胚胎發(fā)育奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。紫梗籽銀桂種子發(fā)育過程中可溶性蛋白含量前期變化比較平穩(wěn),后期呈現(xiàn)上升趨勢,這與紅松Pinus koraiensis[8]、短絲木犀Osmanthus serrulatu[35]、板栗Castanea mollissima[36]等種子發(fā)育過程中蛋白質(zhì)含量變化趨勢一致。由此可見,在紫梗籽銀桂種胚后期的成熟過程中,需要有大量的蛋白質(zhì)參與,為種胚的繼續(xù)生長發(fā)育提供養(yǎng)分,并且蛋白質(zhì)也作為種胚形態(tài)建成的結(jié)構(gòu)組成物質(zhì)發(fā)揮作用。

植物油脂的積累時(shí)期因物種的不同而存在差異[37],紫梗籽銀桂在花后前150 d胚乳沒有固化,脂肪含量增加緩慢,含量較低;在花后165 d之后,胚乳逐漸固化,脂肪含量逐漸增加,這一結(jié)果與文冠果Xanthoceras sorbifolium[38]、核桃Juglans regia[41]等物種的種子發(fā)育研究結(jié)果相似。有研究結(jié)果表明,可溶性糖會在油脂快速積累之前大量積累,但在油脂積累過程中卻不斷減少[39-42],即種子在發(fā)育過程中可溶性糖、蛋白等在積累的同時(shí)會被消耗,但本研究結(jié)果表明,紫梗籽銀桂種子脂肪含量與可溶性糖、可溶性蛋白及淀粉含量的變化趨勢基本相似,這可能與這些物種的生物學(xué)特性和取樣策略相關(guān)。